体外受精技术PPT推荐.ppt

体外受精技术PPT推荐.ppt

《体外受精技术PPT推荐.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《体外受精技术PPT推荐.ppt（71页珍藏版）》请在冰点文库上搜索。

缺点：

容易损伤卵母细胞周围的卵丘细胞，影响其随后的成熟。

体外胚胎生产技术要点,卵母细胞的采集,卵巢解剖法：

卵巢切为两半，去掉中间的髓质部分，刀片划破卵泡，在培养液中反复冲洗优点：

能保持卵母细胞周围卵泡细胞的完整性，回收率也相对较高；

回收的速度相对较慢，容易造成污染。

体外胚胎生产技术要点,卵母细胞的采集,2.活体采集（OvumPick-Up,OPU）腔镜法：

腹壁切开一小口，插入腹腔镜，操作杆和穿刺针，配合将卵母细胞抽吸出来优点：

比较直观，容易掌握；

工作量大，对母牛有损伤，不能频繁手术。

体外胚胎生产技术要点,卵母细胞的采集,B型超声波法：

超声波探头和采卵器插入到阴道子宫颈的一侧穹隆处。

术者通过直肠将卵巢贴在探头上，根据B超屏幕上所显示的卵泡位置进行穿刺而将卵母细胞抽出优点：

不用手术，操作速度快，对母牛损伤小，可频繁采卵，且亦可对妊娠母牛采卵；

操作技术较难掌握，并需要昂贵的超声设备。

体外胚胎生产技术要点,卵母细胞的筛选,只有周围包被着完整卵丘（A级）或部分卵丘脱落（B级）（1层以上卵丘细胞）、胞浆均质并充满于透明带内的卵母细胞才能进行成熟与胚胎发育的培养。

A级：

卵丘细胞致密，至少有5层以上；

B级：

卵丘细胞为2-4层；

C级：

卵母细胞大部分被包裹；

D级：

卵母细胞少量被包裹；

E级：

裸卵。

A、B级可用于培养，C、D级成熟率低。

体外胚胎生产技术要点,卵母细胞的体外成熟,卵母细胞成熟目的：

提供可利用的卵母细胞用于体外受精、克隆等；

研究其体内成熟的模型。

卵母细胞体外成熟的特征生发泡破裂；

染色体凝集；

纺缍体形成；

极体排出；

透明带软化；

卵丘细胞扩展。

体外胚胎生产技术要点,卵母细胞的体外成熟,卵母细胞成熟培养液以TCM-199较好，可使牛、羊、猪的卵母细胞体外成熟率高达80%以上。

添加成分：

促性腺激素：

FSH、LHFCS、BSA：

有认为FCS比BSA好，而发情牛血清或发情羊血清比FCS好。

抗生素,体外胚胎生产技术要点,卵母细胞的体外成熟培养,OocyteCollectionMedium（OCM）最常用的是碳酸氢钠或Hepes缓冲的TCM-199;

2.OocyteMaturationMedium

（1）Bovinesteerserum

（2）Folltropin（3）Estradiol（4）NaPyruvate（5）Glutamine,体外胚胎生产技术要点,卵母细胞的体外成熟培养,2.成熟培养时间一般22h-24h，但猪40h-44h，马30h-36h，兔仅12h-15h3.成熟培养的温度和气相环境人和啮齿类动物：

37牛、猪、羊和马等：

3839。

pH：

7.7好于7.1，7.4，8.0渗透压：

330Osm/kg好于300，320气相：

5%CO25%CO25%O290%N2,体外胚胎生产技术要点,卵母细胞的体外成熟培养,4.IVM系统开放培养系统1ml-2ml成熟培养液直接置于平皿内或培养板内，放入50枚-200枚卵母细胞培养，上面不盖石蜡油。

简单，对培养液中的脂溶性物质没有若影响，能同时培养大量细胞缺点：

渗透压变化较大，容易污染,体外胚胎生产技术要点,卵母细胞的体外成熟培养,微滴培养系统将成熟培养液在做成50-500l的微滴，覆石蜡油，将卵母细胞置于其中培养。

渗透压比较稳定，不易污染；

对脂溶性物质有稀释作用，成本高，培养结果易受石蜡油质量的影响。

密闭培养系统置12ml培养液的试管中，胶塞，在培养箱或恒温水浴中培养；

若采用培养皿或微滴培养，则可将其装入密闭的塑料袋内。

不要CO2培养箱，方便运输缺点：

pH不如前者稳定。

体外胚胎生产技术要点,卵母细胞的体外成熟,卵母细胞成熟的标志第一极体的排出、卵丘细胞的扩展可作为成熟的标志，而生发泡破裂（GVBD）是卵母细胞恢复减数分裂的主要标准，因此常用地衣红染色才可判断。

牛卵母细胞体外成熟标准：

1级成熟卵：

卵丘细胞完全扩展，卵丘细胞至少向外扩展3倍于裸卵直径；

2级成熟卵：

卵丘细胞中等扩展，卵丘细胞至少向外扩展2倍于裸卵直径；

3级成熟卵：

卵丘细胞轻度假扩展，卵丘细胞仍紧紧粘附于透明带上。

1级和2级卵通常均已排出第一极体。

体外胚胎生产技术要点,卵母细胞体外成熟的质量评定,形态观察：

细胞质均匀、没有空泡固定染色法：

0.1%透明质酸酶醋酸酒精或醋酸甲醇（1:

3）固定24h48h1%间苯二酚兰（Lacmoid）或1%地衣红（Orcein）的40%醋酸溶液染色受精和胚胎发育潜能的评定,体外胚胎生产技术要点,卵母细胞的体外成熟,影响卵母细胞成熟的因素卵母细胞的来源：

不同种类的动物、不同生理阶段的动物（小牛低于成年牛）、卵母细胞的质量等；

（1）动物种类与年龄：

牛、羊效果较好，而马、猪较差。

小牛卵母细胞的平均直径（118.041.15m）比成年母牛的（122.840.74m）小。

体外成熟的小牛卵母细胞体外受精后发育潜力也低于成年卵母细胞,体外胚胎生产技术要点,卵母细胞的体外成熟,

（2）卵母细胞的形态A、76.2%；

B、67%；

C、22%；

D、11.4%（3）卵巢贮存时间与温度30C对成熟和胚胎发育不利（First&

Parrish）绵羊的卵巢贮存在22C数小时对成熟无明显影响，但体温条件下则会使卵母细胞的质量下降（Moodie&

Graham）,体外胚胎生产技术要点,卵母细胞的体外成熟,2.激素目前大多数都离不开FSH或LH或两者的混合物，但仍有争议GH能显著提高精子的受精率，促进卵裂及胚泡的形成甲状旁腺激素相关蛋白（PTHrP）胰岛素激活素,体外胚胎生产技术要点,卵母细胞的体外成熟,3.生长因子目前已经证实与卵母细胞成熟有关的生长因子有：

上皮细胞生长因子（EGF）、转化生长因子和（TGF-，）、成纤维细胞生长因子（FGF）、胰岛素类生长因子和（IGF-，）4.血清胎牛血清（FBS）、发情牛血清（OCS）、发情前期母牛血清（POS）、超排母牛血清（SCS）、公牛血清（SS）。

体外胚胎生产技术要点,卵母细胞的体外保存,1.37保存应考虑保存时间与卵老化2.低温保存0-10兔:

10，受精能力显著降低。

体外胚胎生产技术要点,卵母细胞的体外保存,3.冷冻保存借鉴胚胎冷冻方法，现已建立了几种卵母细胞冷冻程序：

A慢速冷冻、慢速解冻法B慢速冷冻、快速解冻法C快速冷冻、快速解冻法D一步冷冻法E玻璃化法F超快速冷冻法,体外胚胎生产技术要点,影响卵母细胞成熟的因素,培养条件：

温度：

37C较好，但各种动物最适温度不同，如兔子低于体温3C较好，牛35-39C都可，但38-39C最合适；

培养基：

水、血清（无血清、有血清）、无血清时添加BSA等；

有血清时如胎牛血清、发情牛血清、公牛血清、超排牛血清等；

体外胚胎生产技术要点,精子的分离与洗涤洗涤的目的：

去掉精浆中抑制精子获能的因子和死精子，或洗去防冻剂及卵黄等成分，以获得活力好的精子。

精子分离及洗涤方法悬浮法（Swim-up）：

利用精子上游的特性将高活力的精子与死精子及精浆成分分开。

将精液置于获能液或受精液中，培养箱中孵育龄10-30分钟，吸取上层液体，再离心洗涤1-2次即可。

精子的分离、洗涤与体外获能,体外胚胎生产技术要点,精子的分离、洗涤与体外获能,离心洗涤法：

对于活力好的精子直接将其放入获能液或受精液中，离心洗涤若干次便可。

BSA/Percoll密度梯度离心法：

利用形态正常精子密度高于异常精子的原理。

如将BSA制成不连续的密度梯度或将Percoll制成30-40%或45-90%梯度，经平衡离心从而得到高受精力的精子。

玻璃棉过滤法：

采作小玻璃珠过滤除去死精子。

因其成本高，较少采用。

（二）精子获能处理方法1.血清白蛋白法将精子与血清白蛋白溶液进行长时间孵育。

该法由于需要的时间较长，且诱发精子获能的作用不强，故仅在IVF技术研究的初期进行过尝试，具有一定作用，目前仅作为精子获能的一种辅助手段。

2.高渗盐法精子表面含有许多被膜蛋白，即所谓的“去能因子”。

当用高离子强度溶液处理精子时，这些被膜蛋白将从精子的表面脱落，从而导致精子获能。

由于高离子强度溶液对精子具有渗透打击作用，会影响精子的活力，故目前已废除不用。

（二）精子获能处理方法3.卵泡液孵育法卵泡液含有来自血清的大分子物质，并含有诱发精子获能和顶体反应的因子，故在精液中添加一定浓度的卵泡液可诱发精子获能。

10%卵泡液，牛受精分裂率（40.3%Vs87.5%）和囊胚发育率（8.3%Vs40.4%）均显著下降，但加入50%的卵泡内膜细胞条件液则能。

卵泡液可以用于精子的获能处理，但不能用于IVF系统。

（二）精子获能处理方法4.钙离子载体法钙离子载体A23187能直接诱发Ca2+进入精子细胞内，提高细胞内的Ca2+浓度，从而导致获能。

0.5mol/L1.0mol/LA23187溶液处理精子5min，然后加入等量含1%BSA的BO溶液终止A23187的作用，即可将获能精子加到含卵母细胞的受精滴中进行IVF。

注意控制A23187的工作浓度和作用时间，否则会导致精子的活力下降和死亡。

（二）精子获能处理方法5.肝素法肝素是一种高度硫酸化的氨基多糖类化合物，与精子结合后，能引起Ca2+进入精子细胞内部而导致精子获能。

最初，制备好的精子常用含有肝素（100mg/L）的获能液预处理15min，然后加到受精滴中进行IVF。

现直接将肝素（50mg/L）添加到受精液中进行受精。

（三）精子获能的检测1.精子形态及运动方式的观察头部膨大，活力增强，超活化2.顶体反应的检测

（1）双重染色法优点：

无需昂贵设备，简单易行；

易发生误判

（2）透射电镜观察成本高，制片繁琐，可操作性不强。

三、IVF培养系统,

（一）微滴系统20-40l微滴受精液，覆石蜡油，每滴放入IVM的卵母细胞10-20枚及获能处理的精子（1.0-1.5）106个/ml，孵育6-24h优点：

受精液及精液的用量均较少，IVF的效果亦较好；

结果易受石蜡油质量影响，操作繁琐，成本较高。

（二）四孔培养板系统每孔加入500ml受精液和100-150枚IVM的卵母细胞，然后加入获能处理的精子（1.0-1.5）106个/ml，孵育6h-24h。

操作相对比较简单，受精结果不受石蜡油质量的影响；

精子的利用率相对较低，IVF效果不如微滴法稳定。

三、IVF培养系统,通常以精子穿透率、原核形成率、受精分裂率和囊胚发育率来衡量。

其中，囊胚发育率最为可靠。

（一）固定染色法受精810h精子穿透率和多精子受精率；

受精1820h双原核形成率

（二）体外培养受精48h2-8细胞比例，7d囊胚发育率，9d囊胚的孵化率,三、IVF质量评定,体外胚胎生产技术要点,精子的分离、洗涤与体外获能,SpermSwim-upItisslowerthanthePercollprocedure,sometimesitdoesnotgivebetterresults.1.Thaw6to8strawsoffrozensemeninthecyto-thawfor60seconds.Ifpossible,usesemenfromdifferentbulls.2.Combinecontentsofstrawsin5mlSp-TALP.Placesampleintotheincubator（38.5C）for5minutes.3.Centrifugesemen（200xg;

5min）anddiscardallbutthebottom1mlofsupernatant.4.Prepare4to5testtubescontaining1mlSp-TALP.Addapproximately250mlofspermsuspensionveryslowlytothebottomofeachtubeusinga20gaugeneedleand1mlsyringe.Placetubesinincubator（38.5C）for1h.5Attheendofspermswim-up,aspiratethetop800mlfromeachtubeandcombinesamples.Centrifuge（1000rpm）thecombinedsamplefor5minutes.Discardallbutthebottom500mlofsupernate.,体外胚胎生产技术要点,精子的分离、洗涤与体外获能,Glass-woolFiltrationThisfiltrationprocedureusuallyrequires10-15minutesandgenerallyyieldsnearly100%viablesperm.1.Prepareinadvance0.2mlglasswoolcolumnsin1mlsyringesthatarerinsed10XwithMilli-Qwaterandautoclaved.2.Immediatelybeforestartingpurification,rinsecolumnseveraltimeswithHepes-TALPandfinallywithSperm-TALPtoequilibratecolumn.3.Frozen-thawedsemen（3-5straws）iswashedtwicewith10-15mlSperm-TALPbycentrifugationat200xg（10min）andthenresuspendedin0.6-0.8mlIVF-TALP.4.Spermsuspensionisthenlayeredoverthewetcolumnandallowedtofilterbygravity.5.Thenumberandviabilityoffilteredspermisdetermined.,体外胚胎生产技术要点,精子的分离、洗涤与体外获能,Thawstraw,LayeringofspermontoPercoll.Aftercuttingthetipofthestraw（Leftpanel）,thecontentsofthestrawareexpelledontothetopofthePercollgradient（rightpanel）.Here,removalofthesemenisfacilitatedbyusingahomemadeplunger.,Percollgradient:

uptobottom45-90%,RemovalofspermfromthebottomofthePercollgradient.,WashingsperminSp-TALP.Theleftpanelshowsthewashedandcentrifugedsperm.Therightpanelshowsthepelletofspermremaininginthetubeafteraspirationofthesupernatant.,Percollmethod,Hemacytometerusedforcountingsperm.,体外胚胎生产技术要点,精子的分离、洗涤与体外获能,2.精子的体外获能

（1）卵泡液孵育法：

卵泡液含有来自血清的大分子物质，并含有诱发精子获能和顶体反应的因子，故在精液中添加一定浓度的卵泡液可使精子获能。

但不能用于体外受精（卵裂率和囊胚率下降）。

（2）钙离子载体法：

钙离子载体A23187能诱发Ca进入精子细胞内，诱发精子的超活化和顶体反应，从而导致获能。

但其作用时间和浓度对于获能非常关键。

体外胚胎生产技术要点,精子的分离、洗涤与体外获能,（3）肝素法：

它与精子孵育后，能引起Ca进入精子内，导致获能。

这是被广泛采用的获能法。

原来将肝素（100mg/ml）获能液预处理精液，再受精，现在直接将肝素（50mg/ml）添加到受精液中受精。

实际操作时，常将多种因素共同使用，如咖啡因-肝素-BSA系统。

体外胚胎生产技术要点,精子的分离、洗涤与体外获能,3.精子获能的检测

（1）精子形态及运动方式改变（常用）：

获能后的精子头部膨大，运动增强。

（2）顶体反应的检测：

双重染色法：

取样固定染色（快绿FCF和曙红）涂片干燥观察若头部有厚的蓝绿区为无获能，若出现粉经为获能。

电镜法：

2.体外授精授精通常在覆盖下的微滴中进行，微滴以50-100ul，一般每滴中加5-10个卵母细胞，精子最终浓度为1X106个/ML。

培养条件：

5%CO2、39C培养，BO液中6-8h，TALP液中18-24h。

体外胚胎生产技术要点,精子的体外获能与体外受精（牛）,1.Removeplatescontainingmaturedoocytesfromtheincubatorandplaceontheslidewarmer.2.Add25mlspermpreparationand25mlPHEmixintoeachwell.Whenpipettingthesperm,placethepipetteinthemiddleofthespermsuspensionratherthanonthebottomtoavoidgrabbingdebristhatcansettletothebottomofthetube.3.Return4-wellplatetoincubatorfor8-10h.Manypeopledofertilizationfor18-20h.WhenwewereestablishingIVFinourlab,8-10hgavebetterresultsthanlongerincubationtimes.Recently,however,wehavegottengoodresultswith18-20hfertilizationtimes.Inaddition,longerfertilizationtimesmakeiteasiertoremovecumuluscellsafterfertilization.Todeterminetheincidenceofparthenogenesis,onewellshouldbepreparedwithoutsperm,butwithPHE.After810h,placetheseoocytesintoaseparateculturemediumdropandculturefor2daysbeforelookingatrateofparthenogenesis.,体外胚胎生产技术要点,体外受精,体外胚胎生产技术要点,早期胚胎的体外发育,阻滞期：

各种动物的早期胚胎体外发育时都存在阻断期，因此可通过改善培养条件和在培养液中添加生长因子（TGF-或bFGF等）或细胞外基质因子克服阻断。

但目前的发育率仍然比较低，约为40%，是限制体外受精应用的一个突出问题。

各种动物阻断期：

牛：

猪：

羊：

体外胚胎生产技术要点,早期胚胎的体外发育,培养液添加的成分：

（1）丙酮酸钠和乳酸钠：

作为能量底物。

（2）生物体液和蛋白质：

FCS、NCS、发情母畜血清、BSA等。

（3）激素：

PMSG、FSH、胰岛素、雌激素等，提高囊胚率。

（4）生长因子及多肽：

IGF，促进卵母细胞的成熟、受精和早期胚胎发育；

EGF促进胚胎的分化和囊胚的形成；

TGF促使牛的胚胎通过早期阻断；

LIF（白血病抑制因子）提高孵化囊胚发育率，并抑制胚胎干细胞的体外分化。

体外胚胎生产技术要点,早期胚胎的体外发育,2.胚胎的体外培养系统常规培养系统：

微滴法和培养板法。

输卵管离体培养法：

克服阻断，但因繁琐不常用。

与体细胞共培养：

如输卵管上皮细胞、滋养层细胞、颗粒细胞、子宫内膜细胞等。

体外胚胎生产技术要点,胚胎的冷冻保存,常规的慢速冷冻法冷冻液:

1.5M甘油+0.25M蔗糖+PBSS液+0.1mg/mlPVP1.5M乙二醇+0.25蔗糖+PBSS液+0.1mg/mlPVP冷冻方法：

在室温下，先将牛胚胎放入防冻液中平衡一段时间；

装管；

以每分钟1的速度降温至7；

植冰；

以每分钟0.5的速度降温至35；

平衡10分钟后，投入液氮中保存。

体外胚胎生产技术要点,胚胎冷冻保存,2.玻璃化冷冻冷冻液：

EFS40：

40%乙二醇+0.3M蔗糖+18%聚蔗糖+PBSS冷冻步骤：

首先将胚胎放入20%乙二醇溶液（EFS20）中平衡5min；

用移卵管移入玻璃化溶液中平衡10min；

装管，封口；

将细管投入液氮冷冻保存。

影响体外受精的因素,卵母细胞的成熟精子的体外获能,