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溶液pH值距离等电点愈远，生物分子所带净电荷就越多，电泳时速度就越快。

当缓冲液pH大于等电点时，生物分子带负电荷，电泳时向正极移动；

当缓冲液pH小于等电点时，生物分子带正电荷，电泳时向负极移动。

③电场强度：

电场强度指每单位介质长度的电位梯度（又称电位差或电位降）。

一般而言，电场强度越大，电泳速度越快。

但随着电场强度的增大会引起通过介质的电流强度增大，从而造成电泳过程产生的热量增多，最终导致介质温度升高。

降低电流强度，可以减少产热，但会延长电泳时间，引起生物分子扩散增加，同样影响分离效果。

所以电泳实验中要选择适当的电场强度。

④电渗：

液体在电场中对于固体支持介质的相对移动称为电渗。

由于支持介质表面存在一些带电基团，如滤纸表面含有羧基，琼脂含有硫酸基等。

这些基团电离后使支持介质表面带电，吸附一些带相反电荷的离子在电场作用下向电极方向移动，形成介质表面溶液的流动。

当电渗方向与电泳方向相同时则加快电泳速度；

当电渗方向与电泳方向相反时，则降低电泳速度。

⑤支持介质的筛孔：

支持介质的筛孔大小对生物大分子的电泳迁移速度有明显的影响。

在筛孔大的介质中泳动速度快，反之则泳动速度慢。

2.3电泳技术的分类：

①根据电泳中是否使用支持介质分为自由电泳和区带电泳：

自由电泳不使用支持介质，电泳在溶液中进行；

区带电泳需使用支持介质，根据支持介质不同可分为醋酸纤维薄膜电泳、薄层电泳和凝胶电泳等。

根据支持介质的装置形式不同又可分为水平板式电泳、垂直板式电泳、垂直盘状电泳、毛细管电脉等。

②根据电泳时电压的高低分为高压电泳和常压电泳：

高压电泳使用的电压在500～1000V，这类电泳分离速度快，但热效应较大，必须具备冷却装置，主要适用于小分子化合物的快速分离；

常压电泳使用的电压在500V以下，电位梯度为2～10V/cm。

这类电泳的分离速度较慢，但对电泳设备要求简单。

③根据电泳系统pH是否连续分为连续pＨ电泳和不连续pＨ电泳：

连续pH电泳是指电泳全过程中pH保持不变；

不连续pH电泳是指电极缓冲液和电泳支持介质中的pH不同，甚至电泳支持介质不同区段的pH也不相同，如聚丙烯酰胺凝胶电泳。

④根据工作目的和分离样品的数量多少分为分析电泳和制备电泳。

⑤．根据结合配套的技术种类不同分为免疫电泳、层析电泳、等电聚焦电泳、转移电泳、双相电泳、脉冲梯度电场凝胶电泳和相互垂直交替电场凝胶电泳等。

⑥根据电泳物质类别不同分为细胞电泳、核酸电泳、蛋白质电泳等

2.4电泳示踪剂：

电泳常用的示踪剂有溴酚兰和二甲苯青FF。

示踪剂一般与蔗糖、甘油组成上样缓冲液，蔗糖、甘油可增加溶液密度，使其比重增加，以确保样品均匀沉入加样孔内。

2.5聚丙烯酰胺凝胶：

是由丙烯酰胺（Acr）与交联剂亚甲基双丙烯酰胺（Bis）在催化剂作用下，经过聚合交联形成含有亲水性酰胺基侧链的脂肪族长链，相邻的两个链通过亚甲基桥交联起来的三维网状结构的凝胶。

具有机械强度好、弹性大、透明、化学稳定性高、无电渗作用、设备简单、样品量小（1～100μg）、分辨率高等优点，并可通过控制单体浓度或与交联剂的比例聚合成不同大小孔径的凝胶。

可用于蛋白质、核酸等不同大小的生物分子的分离、定性和定量分析；

还可结合解离剂十二烷基硫酸钠（SDS）以测定蛋白质亚基的相对分子质量。

2.6聚丙烯酰胺凝胶的聚合体系有两种：

①化学聚合：

通常采用过硫酸铵（AP）为催化剂，四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂。

在TEMED加速作用下，过硫酸铵可使丙烯酰胺单体的双键打开、活化形成自由基丙烯酰胺，从而引发聚合作用。

②光聚合：

通常采用核黄素作催化剂，核黄素在光照下光解成无色基，后者再被氧化成自由基而引发聚合作用。

光聚合的凝胶孔径较大，而且随时间延长而逐渐变小，不太稳定。

化学聚合的凝胶孔径较小，且各次制备的重复性好。

故一般采用化学聚合。

2.7不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳有三种效应：

浓缩效应、电荷效应和分子筛效应。

①浓缩效应在浓缩胶中进行；

分子筛效应在分离胶中进行；

电荷效应在浓缩胶和分离胶中都有。

②蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。

2.8SDS：

是一种阴离子型去污剂，在蛋白质溶解液中加入SDS和巯基乙醇后，巯基乙醇可使蛋白质分子中的二硫键还原；

SDS能使蛋白质的非共价键（氢键、疏水键）打开，并结合到蛋白质分子上，形成蛋白质SDS复合物。

由于SDS带有大量负电荷，当它与蛋白质结合时，所带的负电荷的量大大超过蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差异；

SDS与蛋白质结合后，还引起了蛋白质构象的改变；

蛋白质-SDS复合物在水溶液中的形状，近似于雪茄烟形的长椭圆棒。

不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都一样，而长轴则随蛋白质相对分子质量的大小成正比地变化；

这样的蛋白质-SDS复合物在凝胶中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只是椭圆棒的长度，也就是蛋白质相对分子质量的函数。

二、实验器材和材料

2.1实验器材：

垂直板型电泳装置，直流稳压电源（电压300~600V，电流50~100mA），50μL、200μL、1000μL的微量注射器，小烧杯。

2.2实验试剂：

2%（V/V）TEMED溶液，10%（W/V）过硫酸铵溶液，蛋白质样品溶解液，分离胶缓冲溶液，浓缩胶缓冲溶液，凝胶贮液，10%SDS溶液，电极缓冲溶液，染色液，脱色液。

2.3实验对象：

标准蛋白质纯品、小鼠肝的蛋白质提取物

三、实验方法和步骤

3.1安装垂直板型电泳装置：

3.1.1将玻璃板用蒸馏水洗净烘干，是否洗净可通过是否有水珠悬挂于板上判断。

3.1.2把玻璃板在灌胶支架上固定好。

固定玻璃板时，两边用力一定要平均，防止夹坏玻璃板，同时也要注意大小两块板要对齐，夹紧，防止溶液漏出。

3.2凝胶的制备：

3.2.1分离胶的制备：

在小烧杯中配制溶液，先加入4.0mL凝胶贮液、1.25mL分离胶缓冲溶液、0.1mL10%SDS溶液、4.0mLddH2O、0.06mL10%过硫酸铵，然后加入0.6mL2%（V/V）TEMED溶液。

将所配凝胶液沿着凝胶的长玻璃片的内面加至长、短玻璃片的窄缝内，加胶高度距样品槽模板下缘1cm。

用滴管沿玻璃片内壁加一层蒸馏水，使胶面平整。

等分离胶面不会因倾斜而倾斜时，去掉水封层，并用滤纸条吸干。

3.2.2浓缩胶的制备：

在另一个干净的小烧杯中，先加入0.75mL凝胶贮液、0.83mL浓缩胶缓冲溶液、0.1mL10%SDS溶液、3.0mLddH2O、0.02mL10%过硫酸铵，然后加入0.2mL2%（V/V）TEMED溶液。

混匀后将凝胶溶液加到已聚合的分离胶上方，直至距短玻璃片上缘0.5cm处，轻轻将“梳子”插入浓缩胶中，使凝胶顶部形成无数个相互隔开的凹槽，然后放置30min。

之后小心拔去“梳子”。

3.3加样：

将pH8.3的电极缓冲液倒入内外贮槽中，内槽中液面应没过短玻璃片，如果内槽漏水，则外槽液面应与内槽液面相同。

在同一块凝胶上两组分别用微量注射器在样品凹槽内依次加入牛血清，E1样品1，E1样品2，蛋白marker，E2样品1，E2样品2，牛血清样本。

加样体积为：

蛋白质样品液，牛血清样品液均为15μL；

蛋白质marker为5μL。

3.4电泳：

将上槽接负极，下槽接正极，打开电源，开始时将电压控制在70V，待样品进入分离胶后，改为90V。

待蓝色染料迁移至下端约1cm左右时，停止电泳。

3.5剥胶：

将电泳槽中的凝胶板取出，将凝胶取出放入一大培养皿中。

剥完胶之后同时做染色和转膜。

3.6染色和脱色：

加入染色液，染色45min。

染色完毕，倾出染色液，加入脱色液。

20～30min换一次脱色液，2～3次后可初步观察电泳条带，然后脱色过夜，直至背景清晰。

3.7Mr的计算：

通常以相对迁移率（Mr）来表示迁移率。

相对迁移率的计算方法如下：

用直尺分别量出样品区带中心及铜丝与凝胶顶端的距离，按下式计算：

相对迁移率（Mr）=样品迁移距离（cm）／染料迁移距离（cm）。

以标准蛋白质相对分子质量的对数对相对迁移率作图，得到标准曲线。

根据待测样品的相对迁移率，从标准曲线上查出其相对分子质量。

四、实验数据记录和处理

图一SDS-PAGE电泳结果照片（红色框内为观察到的条带）

表一Marker标准蛋白质相对分子质量及对应迁移率

注：

l1为两条条带A的样品迁移距离的平均值，染料迁移距离l2=5.25cm

Mr=样品迁移距离l1/染料迁移距离l2

根据标准蛋白质相对分子质量对数值lgM，对相对迁移率Mr作图，得到标准曲线：

图二蛋白质相对分子质量标准曲线

五、实验结果和分析

由图二可知，标准曲线为y=2.11-1.23x

讲标曲带入计算可得各样品中蛋白质亚基的相对分子质量：

表二待测样品蛋白质亚基相对分子质量

染料迁移距离l2=5.25cm，Mr=样品迁移距离l1/染料迁移距离l2

实验结果：

E1样品中检测出6种亚基，它们的相对分子质量为167.87、146.82、105.04、43.97、27.51、15.06

E2样品中检测出三种亚基：

它们的相对分子质量为43.97、27.51、15.06

B蛋白只有一种亚基：

其相对分子质量为80.35

六、注意事项

1、玻璃板在使用前一定要确定洗净，因为制胶过程中要保证两块玻璃板严密地合在一起，如果有脏物附着的话无法保证这一点。

是否洗净可通过观察洗涤后玻璃板表面是否有水滴残留。

2、在制备凝胶时，当所有试剂都加入后，烧杯可进行稍微混匀，切不可用力摇匀，否则会产生气泡。

当分离胶凝胶时间基本足够时，可稍微倾斜垂直板，若分离胶与封水层之间的界面没有倾斜时则说明凝胶完成。

3、在倒电极缓冲液时，若内槽有漏水，则内外槽需保持液面一致；

若无漏水，则只需内槽液面没过短玻璃片即可。

4、电泳结束后需马上将凝胶从电极缓冲液中拿出来，否则蛋白质会扩散。