酶活测定方法Word文档格式.docx
《酶活测定方法Word文档格式.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《酶活测定方法Word文档格式.docx（15页珍藏版）》请在冰点文库上搜索。
以驱逐残溴及除去颜色,溶液应呈黄色而非绿色。
若溶液仍有绿色,需要再加几滴溴液,再
煮沸除去之。
冷却后,定容至1000mL,用细菌漏斗（No4～5）过滤,置于棕色瓶中保存。
此溶
液使用时加2倍蒸馏水稀释。
即成已稀释的福林试剂。
1.1.20.4mol碳酸钠溶液:
称取无水碳酸钠（Na2CO3）42.4g,定容至1000mL。
1.1.30.4mol三氯乙酸（TCA）溶液:
称取三氯乙酸（CCL3COOH）65.4g,定容至1000mL。
1.1.4pH7.2磷酸盐缓冲液:
称取磷酸二氢钠（NaH2PO4·
2H2O）31.2g,定容至1000mL,即
成0.2mol溶液（A液）。
称取磷酸氢二钠（Na2HPO4·
12H2O）71.63g,定容至1000mL,即成
0.2mol溶液（B液）。
取A液28mL和B液72mL,再用蒸馏水稀释1倍,即成0.1molpH7.2的磷酸盐缓冲液。
1.1.52%酪蛋白溶液:
准确称取干酪素2g,称准至0.002g,加入0.1N氢氧化钠10mL,在
水浴中加热使溶解（必要时用小火加热煮沸）,然后用pH7.2磷酸盐缓冲液定容至100mL即
成。
配制后应及时使用或放入冰箱内保存,否则极易繁殖细菌,引起变质。
1.1.6100μg/mL酪氨酸溶液:
精确称取在105℃烘箱中烘至恒重的酪氨酸0.1000g,逐
步加入6mL1N盐酸使溶解,用0.2N盐酸定容至100mL,其浓度为1000μg/mL,再吸取此液10
mL,以0.2N盐酸定容至100mL,即配成100μg/mL的酪氨酸溶液。
此溶液配成后也应及时使
用或放入冰箱内保存,以免繁殖细菌而变质。
1.2仪器
a.分析天平:
感量0.1mg;
b.581-G型光电比色计或72型分光光度计;
c.水浴锅;
d.1、2、5、10mL移液管等。
1.3操作
1.3.1标准曲线的绘制
1.3.1.1按下表配制各种不同浓度的酪氨酸溶液（表1）。
表1配制各种不同浓度的酪氨酸溶液
━━━━━━━━━━━┳━━━━━━━━━━━━━━━━━━
┃管号
试剂┣━━┳━━┳━━┳━━┳━━┳━━━
┃1┃2┃3┃4┃5┃6
━━━━━━━━━━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━━
蒸馏水,mL┃10┃8┃6┃4┃2┃0
100μg/mL酪氨酸,mL┃0┃2┃4┃6┃8┃10
酪氨酸最终浓度,μg/ml┃0┃20┃40┃60┃80┃100
━━━━━━━━━━━┻━━┻━━┻━━┻━━┻━━┻━━━
1.3.1.2测定步骤:
取6支试管编号按表1分别吸取不同浓度酪氨酸1mL,各加入0.4mol
碳酸钠5mL,再各加入已稀释的福林试剂1mL。
摇匀置于水浴锅中。
40℃保温发色20min在
581-G型光电比色计上分别测定光密度（OD）（滤色片用65**#）或用72型分光光度计进行
测定（波长660nm）。
一般测三次,取平均值。
将1～6号管所测得的光密度（OD）减去1号管（
蒸馏水空白试验）所测得的光密度为净OD数。
为了清楚起见。
再列出表格如下（表2）。
表2
━━━━━━━━━━━━━━━┳━━━━━━━━━━━━━━━━━━
━━━━━━━━━━━━━━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━━
按表1制备的不同浓度酪氨酸,mL┃1┃1┃1┃1┃1┃1
0.4mol/LNa2CO3,mL┃5┃5┃5┃5┃5┃5
福林试剂,mL┃1┃1┃1┃1┃1┃1
━━━━━━━━━━┳━━━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━━
┃1┃┃┃┃┃┃
┣━━━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━━
┃2┃┃┃┃┃┃
OD值┣━━━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━━
┃3┃┃┃┃┃┃
┃平均┃┃┃┃┃┃
━━━━━━━━━━┻━━━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━━
净OD值┃0┃┃┃┃┃
━━━━━━━━━━━━━━━┻━━┻━━┻━━┻━━┻━━┻━━━
以净OD值为横坐标,酪氨酸的浓度为纵坐标,绘制成标准曲线（或可求出每度OD所相
当的酪氨酸量K）。
1.3.2样品稀释液的制备。
1.3.2.1测定酶制剂:
称取酶粉0.100g,加入pH7.2磷酸盐缓冲液定容至100mL,吸取此
液5mL,再用缓冲液稀释至25mL,即成5000倍的酶粉稀释液。
1.3.2.2测定成曲酶:
称取充分研细的成曲5g,加水至100mL,在40℃水浴内间断搅拌
1h,过滤,滤液用0.1molpH7.2磷酸盐缓冲液稀释到一定倍数（估计酶活力而定）。
1.3.3样品测定:
取15×
100mm试管3支,编号1、2、3（做2只也可）,每管内加入样品
稀释液1mL,置于40℃水浴中预热2min,再各加入经同样预热的酪蛋白1mL,精确保温10min,
时间到后,立即再各加入0.4mol三氯乙酸2mL,以终止反应,继续置于水浴中保温20min,使
残余蛋白质沉淀后离心或过滤,然后另取15×
150mm试管3支,编号1、2、3,每管内加入滤
液1mL,再加0.4mol碳酸钠5mL,已稀释的福林试剂1mL,摇匀,40℃保温发色20min后进行光
密度（OD）测定。
空白试验也取试管3支,编号
（1）、
（2）、（3）,测定方法同上,唯在加酪蛋白之前先加
0.4mol三氯乙酸2mL,使酶失活,再加入酪蛋白。
为了清楚起见,分别列出表格于下（见表3及表4）。
表3
━━━━━━━━━━┳━━━━━┳━━━━━━━━━━┳━━━━━━━━
┃管号┃试剂┃管号
试剂┣━┳━┳━┫┣━━┳━━┳━━
┃1┃2┃3┃┃
（1）┃
（2）┃（3）
━━━━━━━━━━╋━╋━╋━╋━━━━━━━━━━╋━━╋━━╋━━
预热酶液,mL┃1┃1┃1┃预热酶液,mL┃1┃1┃1
预热2%酪蛋白,mL┃1┃1┃1┃0.4mol三氯乙酸,mL┃2┃2┃2
━━━━━━━━━━┻━┻━┻━╋━━━━━━━━━━╋━━╋━━┻━━
作用10min（精确计时）┃作用10min（精确计时）┃┃
━━━━━━━━━━┳━┳━┳━╋━━━━━━━━━━╋━━╋━━┳━━
0.4mol三氯乙酸,mL┃2┃2┃2┃预热2%酪蛋白,mL┃1┃1┃1
━━━━━━━━━━┻━┻━┻━┻━━━━━━━━━━┻━━┻━━┻━━
表4
━━━━━━━━━━┳━━━━━━━━━━━━━━━━
试剂┣━┳━┳━━┳━━┳━━┳━━━
┃1┃2┃3┃
（1）┃
（2）┃（3）
━━━━━━━━━━╋━╋━╋━━╋━━╋━━╋━━━
滤液,mL┃1┃1┃1┃1┃1┃1
0.4molNa2CO3,mL┃5┃5┃5┃5┃5┃5
福林试剂,mL┃1┃1┃1┃1┃1┃1
OD值┃┃┃┃┃┃
━━━━━━━━━━╋━┻━┻━━╋━━┻━━┻━━━
平均OD值┃┃
━━━━━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━━━━
净OD值┃┃0
━━━━━━━━━━┻━━━━━━┻━━━━━━━━━
样品的平均光密度（OD）一空白的平均光密度（OD）=净OD值。
1.4计算
在40℃下每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸,定义为1个蛋白酶活力单位。
A1
样品蛋白酶活力单位（干基）=━━×
4×
N×
━━━………………………
（1）
101-W
式中:
A——由样品测得OD值,查标准曲线得相当的酪氨酸微克数（或OD值×
K）;
4——4毫升反应液取出1mL测定（即4倍）;
N——酶液稀释的倍数;
10——反应10min;
W——样品水分百分含量。
1.5注意事项
以上介绍的方法用于测定中性蛋白酶（pH7.2）。
若要测定酸性蛋白酶或碱性蛋白酶,
则把配制酪蛋白溶液和稀释酶液用的pH缓冲液换成相应pH缓冲液即可。
现把几种常用pH
缓冲液配方提供如下:
1.5.1pH7.5磷酸盐缓冲液（0.02mol/L）
12H2O）6.02g和磷酸二氢钠（NaH2PO4·
2H2O）0.5g以蒸
馏水溶解定容至1000mL。
1.5.2pH2.5乳酸-乳酸钠缓冲液（0.05mol）
A液:
称取80%～90%乳酸10.6g,加蒸馏水稀释定容至1000mL。
B液:
称取70%乳酸钠16g,加水稀释定容至1000mL。
取A液16mL与B液1mL混合稀释一倍即成。
1.5.3pH3.0乳酸-乳酸钠缓冲液（0.05mol）
称取80%～90%乳酸10.6g,以水定容至1000mL。
称取70%乳酸钠16g,蒸馏水溶解定容至1000mL。
取A液8mL与B液1mL,混合稀释一倍即成。
1.5.4pH10硼砂-氢氧化钠缓冲液
称取硼砂19.08g,用蒸馏水溶解定容至1000mL（0.05mol）。
称取氢氧化钠8g,用蒸馏水溶解定容至1000mL（0.2N）。
取A液250mL,B液215mL混合,用蒸馏水稀释定容至1000mL即成。
1.5.5pH11.0硼砂-氢氧化钠缓冲液
称取硼砂19.08g,用蒸馏水定容至1000mL。
称取氢氧化钠4g,用蒸馏水定容至1000mL。
取A液与B液等量混合。
1.5.62%酪蛋白溶液配成酸性时,须先加数滴浓乳酸,使之湿润以加速其溶解。
2甲醛法
成曲蛋白酶活力的测定,如用福林法测定确有困难时,可用甲醛法测定作过渡。
2.1仪器
感量0.01g;
b.水浴锅;
c.电烘箱;
d.容量瓶、吸管、滴定管等。
2.2试剂与溶液
a.1%酚酞指示剂;
b.0.1%麝香草酚蓝;
c.0.1N氢氧化钠液、甲醛（试剂配制法同氨基态氮的测定,见ZBX66038—87《氨
基态氮测定法》）。
2.3操作
2.3.1目测法
称取研细均匀的成曲样品10g,放入250mL锥形瓶中,加55℃温水80mL,充分摇匀,置于
55℃水浴锅中保温3h,取出后加热煮沸以破坏酶活力,冷却后定容至100mL,充分摇匀后以
脱脂棉过滤,吸取滤液10mL,移至150mL锥形瓶中,加水50mL,1%酚酞指示剂0.2mL,以0.1N
氢氧化钠标准溶液滴定至刚显微红色（pH8.2）,记下滴定数作为总酸,继续加甲醛10mL,用
0.1N氢氧化钠液滴定至深红色（pH8.5）为终点,若再加麝香草酚蓝1mL作指示剂,则滴至紫
红色为终点。
记下滴定数,减去空白数后计算成氨基态氮。
另称取曲10g做水分,再折算成
干基数。
2.3.2酸度计法
所用仪器、药品、操作方法等与氨基态氮测定法同（见ZBX66038-87）。
2.4计算
蛋白酶活力（克氨基态氮/100g）（干基）
（V-***Vo）×
0.014100
=━━━━━━━━━━×
━━━………………………………
（2）
101-W
10×
━━━
100
V——加入甲醛后氢氧化钠标准液滴定数,mL;
***Vo——甲醛空白滴定数,mL;
W——曲水分,%;
N——氢氧化钠标准溶液的当量数,N;
0.014——氮的毫克当量数。
━━━━━━━━━
附加说明:
本标准由商业部副食品局提出。
本标准由上海市酿造科学研究所起草。
本标准主要起草人须凤高。
*本法实质上是在一定温度下、一定时间内,成曲利用自身的蛋白酶把自身原料中的蛋
白质水解成氨基酸。
以测定氨基态氮的量来衡量蛋白酶活力的数值。
在培养和堆放过程,
环境温度和自身含有水分,故已有少量氨基酸生成。
为了能和福林法的酶活力进行对照,
可用空白试验以扣除此误差,方法是另取一曲样于开始时即将成曲酶活杀灭,其余操作步
骤完全相同。
杀酶的方法是把已煮沸的蒸馏水70mL倾入10g成曲中,并马上继续把成曲液
煮沸几分钟,其余操作与样品同,成曲和甲醛的空白一起算成Vo。
搜索更多相关主题的帖子:
测定法蛋白酶活力
蛋白酶活力的测定
随着生物技术的发展及环保要求的提高，越来越多的酶制剂应用于制革生产中。
比如浸水，脱毛，软化，脱脂等工序都用到大量的酶制剂，从酶的作用性质来看制革生产中用到的主要是蛋白酶和脂肪酶。
酶的本质是蛋白质，所以酶在出厂后的长途运输及存放过程中，由于条件的变化、振荡、阳光等的作用，其活力要有所改变，故在使用之前必须测定其活力。
作为计算酶制剂用量的依据，以达到预期的脱毛效果。
即现测现用。
酶的活力是指酶催化底物进行反应的本领。
即酶催化底物反应在一定时间内生成物越多或消耗的底物越大，则催化速度越快，活力越高。
酶活力的大小用酶活力单位（U，activeunit）来表示。
1961年国际酶学会议规定：
1个酶活力单位是指在特定条件（25℃，其它为最适条件）下，在1分钟内能转化1微摩尔底物的酶量，或是转化底物中1微摩尔的有关基团的酶量。
1979年国际生物化学协会为了使酶活性单位与国际单位制（SI）的反应速率相一致，推荐用Katal单位（也称催量，Kat）。
规定为：
在最适条件下，1秒钟能使1摩尔底物转化的酶量。
Kat和U的换算关系：
1Kat=6×
107U，1U=16.67nmol.s-1=16.67nKat。
把酶制剂的量和活力联系在一起，即为酶的比活力，它表示单位质量的蛋白质中所含的某种酶的活力单位的多少。
是用来度量酶纯度的指标。
在实际生产中所说的酶活力一般是指酶的比活力大小。
另外在实际的生产应用中，由于酶的性质不同，测定方法不同，很多酶的活力都有各自的惯用单位。
1、Folin法（第一法）测定蛋白酶活力
目前所用到的蛋白酶的种类比较多。
根据每种酶作用的条件不同，主要是最适PH值不同而分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶。
其中酸性蛋白酶可用于毛皮的软化。
在制革上则主要选用中性和碱性蛋白酶来脱毛。
定义：
lg固体酶粉（或1mL液体酶），在一定温度和pH值条件下，lmin水解酪素产生lμg酪氨酸为一个酶活力单位，以U/g（U/mL）表示。
具体测定方法见《QB/T1803-1993工业酶制剂通用试验方法》及《SB/T10317-1999蛋白酶活力测定法》。
表1几种酶促反应最佳条件
2、胰酶活力测定
胰酶系从各种动物胰脏制取的混合物，主要是蛋白酶，脂酶和淀粉酶。
白色或淡黄色无定形粉末，有微弱的肉类物臭味。
溶于水呈微浑溶液，不溶于醇和醚。
遇酸、碱及热即丧失活力，pH＝7.8~8.7活性强。
水溶液遇酸、热、重金属或单宁酸时产生沉淀，经煮沸则迅速分解而变性。
胰酶用于原料皮脱灰后进行软化。
胰酶中所含的弹性蛋白酶，可以分解弹性蛋白质，防止成革粒面出现碎玻璃花纹，提高产品质量。
胰酶软化时，对皮内一些蛋白质进行不同程度的消解，可除去皮内残存的脏物、毛根分解产物、纤维间质等，有利于皮纤维进一步分散，促进躁剂与皮胶原的结合，以使成革具有柔软性、丰满性和良好的透气性。
酶软化是制造软革很重要的操作，但胰酶浓度过高，皮内胶原纤维损失大，致使成革松面。
为了达到正常的软化目的，必须在软化之前，测定其活力，以便确定其含量。
[醋酸盐指示剂法]
（1）测定原理胰酶能催化酪蛋白水解，而且胰酶量越多，被水解的酪蛋白就越多。
一定量的胰酶，催化的酪蛋白越多或生成的分解产物越多，其胰酶的活力越大。
与福林法蛋白酶活力不同的表示是，胰酶活力是用在一定条件下底物的消耗量来表示。
即在一定的pH值和时间内1g胰酶能使酪蛋白完全水解的质量（g），即胰酶能使酪蛋白转化的能力，又称酪蛋白转化力，以倍数来计量。
控制胰酶的最适条件pH＝8~9、T＝（40±
1）℃，用定量的酪蛋白和不同量的胰酶作用，水解一定的时间后，用醋酸盐（或醋酸）指示剂调节反应液pH值达到酪蛋白的等电点（pH＝4.6）附近，末被水解的酪蛋白呈白色沉淀析出，而水解产物则不沉淀。
据此，则可找到恰好使定量的酪蛋白完全水解的最小胰酶用量。
根据胰酶的体积和浓度，即可计算出胰酶对酪蛋白的转化倍数，即胰酶的活力。
（2）试剂1.24:
50硼酸水溶液；
0.1mo1/L。
NaOH水溶液；
硼酸盐溶液，即1.24:
50的H3BO420mL+2mL0.1mo1/LNaOH；
13.6％醋酸钠水溶液；
60％醋酸溶液；
醋酸盐缓冲液，即l3.6％NaAc与60％HAc等体积混合。
（3）操作
①配制底物酪蛋白称取（精确至0.0001g）0.2g细酪蛋白于小烧杯中，加20mL蒸馏水，移取5mL0.1mo1/LNaOH，40℃水浴上加热约30min，搅拌使之溶解，移人100mL容量瓶，加5mLH3BO4溶液，并定容到刻度（pH＝8.5）。
②胰酶溶液的配制在研钵中称取（精确至0.0001g）胰酶0.1g（先加3~5滴研磨，再补加15~17滴），加1mL硼酸盐溶液，浸泡3~5min，研磨到无大块胰酶，转移定容到500mL容量瓶，用H2O定容。
③粗测取5支带刻度的干燥试管，按表1-2所示进行。
依次滴加醋酸盐缓冲液0.5mL（10滴），边滴边观察刚加人时是否产生白色沉淀，若缓冲溶液到了试管底部还不出现沉淀，说明酪蛋白已水解完全，有沉淀产生，证明酪蛋白没有全部水解，找出刚不产生沉淀的胰酶体积（mL）。
即是5mL酪蛋白完全水解的最少胰酶量。
表2胰酶活力粗测步骤
④精确测定在粗测刚不沉淀至刚沉淀之间移取酶液量，梯度为0.1mL。
例如表1-2中2.0mL刚沉淀，则取2.5~2.0mL。
按表1-3所示进行。
操作同上，找出刚好不产生沉淀胰酶的量，记为V。
表3胰酶活力精确测定步骤
（4）计算胰酶活力X按照下式计算。
式中ml——酪蛋白的质量，g；
m2——胰酶的质量，g；
V——终点时管中胰酶溶液的体积，mL。
（5）注意事项：
①酪蛋白、胰酶、水按比例加入以后一定要使其混合均匀，否则将造成试管底部的酪蛋白没有水解，使测定结果不准确。
②水浴加热，使整个液面都进入到水中。
③试管的粗细程度。
试管不可太粗或太细，既好摇匀又好观察，且粗细一致。
④配制好的胰酶和酪蛋白溶液在室温20℃以下存放24h有效，室温高于20℃时胰酶4h有效，酪蛋白8h有效。
⑤产生白色沉淀必须是现加现看，不能放置过久，否则酪氨酸也沉淀出来了。
3.l还原糖法（Reducingsugarrelease）
这种方法是采用化学合成或从自然界提取的酶的底物来进行的。
酶与底物在特定的条件（温度、PH值和底物浓度）下反应。
反应产物是还原糖，通过比色确定还原糖的数量，同时制作标准曲线。
酶的活性表示为每分钟产生lmmol的产物所需要的酶量（mg或ml）。
3.2比色法（ColorimetricassaysⅠ）
这种方法是对底物进行化学修饰，使其带有特定的可溶性生色基团物质，该生色基团能够产生特定颜色。
在酶与底物发生反应后，生色基团就被释放出来，用分光光度计可以测定颜色的深度，并制作标准曲线。
与已知标准酶的活性进行比较，计算出该酶的活性。
这种方法并不能区分内切酶和外切酶，但是通常认为这种方法更适合于测定外切酶。
目前采用这种方法测定所需的底物被工业上广泛采用。
3.3比色法（ColorimetricassnysⅡ）
这种方法是通过生色基团结合酶作用底物分子的中间产物（sub-unit）来确定酶的活性。
如PNPG（paranitrophenyl），该种物质与半乳糖结合形成一种乳糖（或葡萄糖）类似物。
在酶的作用下，释放出PNP，利用其它方法测定PNP的含量。
上述的方法通常只在生物化学实验室采用，饲料酶作用的底物是高
升级会员 