第4章 发酵Word格式.docx
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第四章赖氨酸发酵过程优化
第一节赖氨酸发酵概述
一、研究背景
1889年Drechsel用酸水解干酪素，经分离谷氨酸后在不含氯化物的水解液中加入硝酸银得到一种碱性物质，其组成为（C6H13N2O2AgNO3HNO3），后来被证实为赖氨酸和精氨酸的混合物。
1891年Fisher和Drechsel分别从干酪素的水解液中得到纯的赖氨酸（C6H13N2O2OHPtC15）。
此后，Fisher于1902年确证了赖氨酸的化学组成。
赖氨酸的分子结构中含两个氨基和一个羧基，是一种碱性氨基酸。
赖氨酸名列八种必需氨基酸之首，被认为是谷物蛋白的第一限制性氨基酸，在谷物食料中添加适量的赖氨酸，其蛋白质的功效大大提高。
如玉米中添加0.4%的赖氨酸，玉米蛋白的功效提高2.1倍；
大米中添加0.2%的赖氨酸，大米蛋白的功效提高1.7倍等。
赖氨酸的应用范围很广：
作为食品强化剂，对儿童的发育、智力，妇女妊娠期的保健、病人的治疗及病后的恢复都有明显的效果；
作为药物可用作肝细胞再生剂，对改善肝功能，治疗肝硬化、高氨症，增进食欲、改善营养状况有明显的疗效；
作为饲料添加剂，在畜、禽类的饲料中添加少许的赖氨酸，对家禽、家畜的日增重、料肉比、家禽的产卵量等方面效果尤为显著。
赖氨酸是仅次于谷氨酸的第二大氨基酸产品。
按配合饲料中0.1%的平均添加量计，仅饲料用赖氨酸，国内需求量2000年和2010年将分别达到8万吨和10万吨。
但我国赖氨酸工业发展缓慢。
1992年年产饲料用赖氨酸4959吨，到1994年约6000吨，1997年接近2万吨，但仍远不能满足市场需求，需要大量进口。
所以，从供需情况来看，我国赖氨酸市场前景看好。
也正如此，近年来，赖氨酸工业化生产成了国内一些投资者的兴趣之一。
国内需求增加而供应不足是导致赖氨酸市场大起大落的内因，国际市场的冲击则是外因。
在我国赖氨酸工业薄弱的情况下，国内赖氨酸市场乃至整个赖氨酸工业易受国外大集团的控制。
因此，迅速提高我国的赖氨酸生产水平，发展赖氨酸生产能力意义重大。
二、发酵法生产赖氨酸技术的发展
（一）赖氨酸的生产方法概述
赖氨酸的生产方法有：
水解法、合成法、酶法和直接发酵法。
赖氨酸最早由蛋白质的水解而制成，目前在赖氨酸的工业化生产中水解法已经淘汰。
以己内酰胺、二氢吡喃、环己酮、呱啶为原料合成L-赖氨酸已有报道。
但因合成法制成的中间体为D，L-赖氨酸，进一步的分离工艺很复杂，美国Allied和联邦德国Deguess公司多年来从事L-赖氨酸合成法的研究，至今未见大规模的生产报道。
见诸报道的酶法生产赖氨酸工艺有∶
（1）合成-苯甲酰--乙酰-DL-赖氨酸，采用消旋酶处理制成-苯甲酰-L-赖氨酸，经酸水解得产品；
合成DL-4-氨基丁基乙内酰脲，采用微生物酶使其转变为L-赖氨酸；
由环乙烯合成DL-氨基己内酰胺采用水解酶和消旋酶共同作用使其变成L-赖氨酸。
其中，第三种工艺已用于赖氨酸的工业化生产。
该法的发明者富村隆最初找到了可水解L-氨基己内酰胺的罗伦隐球酵母（CryptococcusLaurenti），然后又发现具有DL-氨基己内酰胺消旋酶活性的新细菌──无色杆菌（Achomobaterobeaa），通过这两细菌的共同作用，DL-氨基己内酰胺可被转化为L-赖氨酸，该法得率高，适于大规模生产。
富村隆研究的酶法生产赖氨酸工艺，在学术和工业上都得到了较高的评价，1980年曾获日本科学技术奖。
日本东丽株式会社1976年使用上述合成酶法生产工艺制造赖氨酸，至今已形成年产8000吨规模。
但总的来说，酶法对原料成本的依赖性很大。
发酵法生产赖氨酸原料来源广泛，且生产的赖氨酸均为L-型，因此在赖氨酸的生产中发酵法占据主导地位。
目前世界上赖氨酸的年产量已突破20万吨，主要厂家列于表4-1-1，其中90%以上的企业采用发酵法。
表4-1-1世界主要赖氨酸生产厂家
公司
厂址
规模（万吨/年）
制法
味之素
日本，九州佐贺县
2.0
发酵法
协和发酵
日本，山口县防府
1.5
哈特兰德赖氨酸公司
美国，依阿华州
生物协和发酵
美国，蜜苏里州开普吉拉多
1.36
ADM公司
美国，依利诺斯州迪凯特
4.7
亚吉诺莫托公司
美国，北卡罗来纳州罗利
不详
欧洲赖氨酸公司
法国，亚眠
日本味之素泰国公司
泰国，曼谷
0.2
东丽公司
日本，名古屋
0.8
酶法
费埃尔麦克斯
墨西哥
0.6
协和与匈联营公司
匈牙利，布达佩斯东
0.5
塔拉戈纳化工公司
西班牙，巴伦西亚得塘湖安
台湾糖业公司
台南市
0.4
南斯拉夫，伏伊伏丁那日蒂什泰
2.6
拉托维亚，利瓦尔
1.32
合计
21.58
（二）发酵法生产赖氨酸
微生物的赖氨酸合成途径1950年以后逐渐被阐明。
Cilvery等首先报道了肠杆菌属的一株代表菌结肠芽胞杆菌赖氨酸的合成途径，随后椎尾男等研究了黄色短杆菌赖氨酸的合成途径，Tosaka等对乳糖发酵短杆菌的赖氨酸合成途径进行了研究。
对生物赖氨酸的合成途径解析后发现：
赖氨酸的合成与其它氨基酸不同，存在两条途径即二氨基二酸途径和-氨基乙二酸途径，前者存在于细菌、绿藻、原生质、高等植物中，后者存在于酵母霉菌中。
1957年，日本开始采用野生菌株发酵生产谷氨酸，1960年用谷氨酸棒杆菌的高丝氨酸缺陷型变异株生产赖氨酸。
60年代中期，我国开始赖氨酸发酵菌株和工艺条件研究。
1974年中科院微生物研究所诱变谷氨酸生产菌北京棒杆菌AS1.229得到营养缺陷型变异株AS1.563，产酸17.9g/L，进一步诱变得到AECr变异株，产酸达50g/L。
70年代后期，上海、黑龙江、广西和江苏等地积极开展赖氨酸菌种筛选工作，如上海天厨味精厂得到AECr和高丝氨酸缺陷双突变株，产酸36～37g/L；
中科院微生物研究所和常州味精厂合作筛选到产酸48～53g/L的钝齿棒杆菌，通过发酵中试技术鉴定。
上海工业微生物研究所从黄色短杆菌2030出发经一系列诱变筛选得到抗性和营养缺陷型双突变株，其中的FH128菌株在16L小罐发酵70h产酸130g/L以上，5m3罐中试发酵65～69h，产酸92.2～95g/L，转化率为40.2%左右，达到国际先进水平，但至今未有工业化报道。
广西南宁赖氨酸厂于80年代投产后，与广西生物化工研究所协作一直进行赖氨酸生产菌改良和发酵工艺改进，得到分别以糖蜜和淀粉糖为原料的高产菌株，以淀粉糖为原料30L罐发酵产酸120～130g/L左右，该厂还获得了可耐高温生产菌，37℃下发酵，赖氨酸产量基本不受影响。
无锡轻工大学80年代初就开始赖氨酸生产菌选育和发酵工艺研究，从谷氨酸产生菌AS1.495诱变得赖氨酸产生菌F11519，产酸57.4g/L。
再经原生质体融合和化学、物理诱变等手段得到多重变异株FB21，摇瓶产酸70g/L，这在80年代末为国内领先水平，但未进行发酵中试和工业化。
总之，国内赖氨酸发酵研究起步较早，实验室研究水平也不低，但高产菌实现工业化比例较低；
另外，研究多局限于菌种改良和优化发酵的环境条件，对各种培养条件下的优化控制研究不多，或与实际生产脱节。
（三）我国赖氨酸发酵工业现状
20世纪80年代初，国内开始进行赖氨酸发酵中试，并兴建赖氨酸发酵厂，特点是产酸水平和转化率低、规模小。
“七五”期间，国家在广西南宁、福建泉州、湖北武汉及吉林九站建了四套年产1000吨的赖氨酸生产装置。
武汉制药厂因无原料早已改产，吉林九站的装置长期生产不正常，已停产。
广西南宁赖氨酸厂于1987年投产，现增至6000吨/年的生产能力，并计划于“九五”期间扩大到1万吨/年的生产能力，但在近期赖氨酸销售价格大幅度回落的情况下，其扩建计划受到了影响。
福建泉州赖氨酸厂1989年与正大集团合资后改名为“泉州大泉赖氨酸有限公司”，生产能力为5000吨/年左右，使用国外菌种和技术。
四川川化味之素公司是中日合资企业，赖氨酸生产能力为6000吨/年，使用日本菌种和技术。
以上三家企业为我国最主要的饲料用赖氨酸生产厂家，其总生产能力也不过略高于1.5万吨/年，而仅美国ADM公司年产赖氨酸就达12万吨以上；
而且，其中只有广西一家是拥有自己的菌种和技术的国内赖氨酸生产企业，该厂主要以糖蜜为生产原料，产酸达到80g/L以上，对糖转化率38%左右，在国内属先进水平，但跟日本等国的赖氨酸生产水平（日本味之素公司发酵法生产赖氨酸盐酸盐浓度为120g/L左右，转化率可达50%）相比尚有很大差距。
年产赖氨酸千吨以上规模的还有上海天厨味精厂，其产品主要作药用，但目前已停产。
我国赖氨酸行业的特点是∶总生产能力小、企业规模小、生产水平低，因而发展困难。
在这样的情况下，国内赖氨酸市场难免易受国际市场冲击，而且将来可能受外国企业的控制，目前国内主要赖氨酸生产厂家中合资企业占很大比例即是一个信号。
所以应尽快发展我国的特别是我国自己掌握全套生产技术的赖氨酸生产能力，使赖氨酸产品最终能象谷氨酸那样具有完整、强大的工业生产体系。
三、本章研究的目的和主要内容
1987年以前，我国饲料用赖氨酸全部进口，主要来自日本味之素公司。
1987年8月，广西赖氨酸厂的产品投放市场，但不能满足国内的需求。
90年代以后，世界上赖氨酸产量最大的美国ADM公司的产品进入中国市场，1992年我国进口赖氨酸9672吨。
根据我国饲料工业的发展计划，1995年需求赖氨酸1.2~1.3万吨，到2000年增加至2.5万吨。
这样一个广阔的市场，其技术、产品一旦掌握在他人手里，对国家未来的发展极为不利。
我国赖氨酸生产技术虽然取得了长足的进步，但与国外先进水平相比仍有差距（表4-1-2）。
因此实现我国赖氨酸工业化生产的低消耗、低生产成本、高效率，建立起具有竞争力的生产体系是一个迫切需要解决的问题。
发酵是赖氨酸工业的心脏，发酵水平的高低是工厂的命脉。
提高发酵水平有两条途径：
一是筛选出优良的菌株，二是得出与目的菌株相匹配的最佳培养条件、控制手段。
前者是建立在代谢控制发酵研究上的菌种选育技术，后者是建立在生化反应工程基础上的发酵过程控制技术。
只有两者紧密地结合才能最终实现发酵的高水平，而后者正占据着越来越重要的地位。
例如，味之素公司的研究人员曾报道，乳糖发酵短杆菌变异株AJ11204在摇瓶条件下48h产赖氨酸为4.3%，但在小型发酵罐中，通过控制培养条件，48h产酸水平可提高到7%。
如此类似的结果不仅在赖氨酸研究中，而且在其它发酵产品的研究中也时有报道。
表4-1-2我国与日本发酵法赖氨酸生产（商业规模）技术指标对照
生产技术指标
日本
我国
产酸水平/%
10
4.5~6.5
转化率/%
50
35
提取率/%
86~95
71~90
工厂最大规模/万吨年-1
0.3
生产成本比值
1
2
电耗/kwht-1
1600~2200
9117
我国学者对赖氨酸的研究长期以来都把工作重点放在高产菌株的选育上，有关如何对发酵过程进行优化与控制的研究较少。
实际生产中所需的一些培养控制条件、技术指标往往在摇瓶条件下获得，这种低水平的研究方法客观上制约了菌种潜力的进一步发挥。
不仅如此，由于在摇瓶条件下无法对目的微生物生理生化特性、营养供给及操作、发酵设备三者之间建立起有机的联系，当反应器规模发生变化时发酵结果常常不能重复。
而这一点正是国内发酵法生产赖氨酸从60年代中期开始研究至今，多次出现随生产规模扩大（从摇瓶到中试至大生产）过程中发酵水平降低的根本原因所在。
实现发酵过程的最优化，使菌种的潜力充分发挥，是发酵技术的一个最高境界。
国外有关发酵过程最优化的研究非常活跃，这在我国还几乎是一个空白，不能不说是一个遗憾。
在赖氨酸发酵的最优化研究方面，虽然1973年就有了关于流加发酵最优化的研究报道，1985年Lim等进一步完善了最优化理论，并针对赖氨酸发酵进行了讨论，但所有这些研究所讨论的问题仅仅是最优控制的数学求解，而对赖氨酸发酵过程的动力学解析相对缺乏，由此所得出的控制方法的适用性值得怀疑。
发酵过程的最优化的研究。
必须从微生物反应过程的定量解析入手，由于其中所涉及的理论问题非常广泛，从文献资料报道来看，目前真正针对某一具体发酵产品进行过程控制最优化的研究，并成功用于指导实践的报道几乎没有。
考虑到国内赖氨酸的高产菌株多集中于黄色短杆菌，我们选用黄色短杆菌作为研究菌株，在小型反应器上对黄色短杆菌发酵生产赖氨酸的过程进行定量的解析，以实现流加发酵的最优化为目的展开研究，具体分为以下几部分：
（1）在所提供出发菌株的基础上，通过常规诱变获得一株赖氨酸产生菌FB42，并在摇瓶条件下对可能影响起代谢的环境因子进行了考察，对发酵条件进行了优化。
（2）以连续培养作为研究手段，考察了微生物的菌体生长、产物形成及基质消耗特性。
通过对代谢途径进行定量的质、能衡算，得出了赖氨酸的理论转化率。
进一步比较理论转化率和FB42真实转化率之间的差异，对FB42的代谢流进行分析，据此得出对工艺研究有指导的一些理论依据。
（3）在小型反应器中对影响赖氨酸形成的一些重要环境因子进行定量的考察，找出目的微生物的生理生化特性、营养源供给与反应器特性之间的内在联系，得出最适的操作条件。
在此基础上进一步对发酵过程的动力学进行研究，建立出合理的动力学模型，为流加发酵的最优化研究打下基础。
（4）在动力学研究的基础上对发酵进行最优化操作。
包括：
状态方程的建立、目标泛函的确定、最优化流加方式的求解。
并通过实验对最优化操作进行检验，达到理论和实践的统一。
第二节赖氨酸生产菌FB42的获得
一、引言
20世纪50年代以后赖氨酸的微生物合成途径逐步被阐明，在此基础上的代谢控制发酵的研究非常活跃，以选育营养缺陷型及多重结构类似物抗性突变株为主的常规育种技术，给赖氨酸发酵工业奠定了基础。
我们曾于1988年选育出一株赖氨酸产生菌FB21，该菌株的产酸当时为国内领先水平，后研究工作一度中断，菌种退化很多，因此有必要对其遗传标记进行检查，并进一步提高其产酸能力。
另一方面，在摇瓶条件下，易于考察各营养因子对微生物代谢的影响，选择出合适的培养基组成，同时可进行一些初步的优化工作，为以后的研究打下基础。
二、出发菌株FB21的遗传特性
赖氨酸产生菌黄色短杆菌（Bervibacteriumflavum）FB21是由无锡轻工大学经多年筛选于1988年获得，诱变谱系见图4-2-1，其中FB16到FB21是经原生质体诱变。
据报道，FB21菌株在糖浓度为18%下发酵88h，产酸达到7%，为当时国内领先水平。
图4-2-1黄色短杆菌FB21的诱变谱系
本研究出发菌株FB31是由FB21的保藏斜面中接出，经复壮、分离、纯化后获得。
由于FB21保藏时间过长，所获得的FB31其遗传特性极有可能发生改变，FB21的主要遗传标记为Leu-Thr-AECrAHVr，对这四种标记进行鉴定，发现FB31菌株的生长需要Thr和Leu。
在不含Leu的培养基中FB31菌株完全不生长，表现为Leu缺陷型；
在不含Thr的培养基中，FB31菌株能微弱生长，但生长不充分，表现为Thr生长需求型（也可称为代谢渗透缺陷型）。
在AEC浓度为10mg/L时，FB31菌株的生长几乎不受影响；
在AHV浓度为2mg/L时，FB31的相对生长为50%，这些均和FB21的报道相一致。
通过遗传特性的鉴别可以看出，FB31基本上保留了FB21的遗传标记，但Th标记发生了改变，由缺陷型变为需求型，FB31的主要遗传标记为Thr-、AECr、AHVr。
三、FB31菌株摇瓶发酵性能的初步研究
（一）种龄的确定
适宜的种龄应是菌体处于对数生长的中后期。
这是因为处于对数生长期的菌体接种进行发酵是能迅速生长，有利于缩短发酵周期。
而且对数生长期末菌体浓度相对较高，更有利于保持高的接种量。
图4-2-2为FB31种子培养的生长曲线，从图中可以看出培养进行到17~19h时，FB31菌株处于对数生长期末，所以选择种龄为17~19h。
图4-2-2FB31菌株在种子培养基中的生长曲线
（二）接种量对发酵的影响
培养17~19h的新鲜种子按不同的接种量接入发酵培养基中，实验结果如表4-2-1所示，表明接种量以5%为好。
表4-2-1不同接种量对发酵的影响
接种量/%
3
5
8
产酸/gL-1
34.5
38.8
41.8
36.0
34.4
进一步研究发现最适的接种量很大程度上与种子的生长情况有关，实验结果如表4-2-2所示。
当种子OD值为0.18~0.20时接种量以5%为好；
当种子OD值较低，如OD值为0.085时，接种量则以8%为宜。
表4-2-2种子OD值不同时接种量对发酵的影响
17~19h种子OD值
0.085
0.185
0.20
产量/gL-1
34.6
41.1
41.3
35.0
42.0
35.1
事实上由于温差、斜面接种量波动或其它因素的影响，种子培养17~19h后OD值的发生改变是很难免的，而且有时会相差很大，这时可以通过改变接种量，或延长种子培养时间来调整，以获得最佳的接种效果，保证发酵的稳产高产。
（三）初糖浓度对发酵的影响
如表4-2-3所示。
当初糖浓度为13%时发酵的转化率最高，初糖浓度进一步提高时对发酵不利，特别当初糖浓度为18%时FB31几乎不产酸，可见菌株不具备耐高糖的特性。
表4-2-3初糖浓度对发酵的影响
初糖浓度/gL-1
105.0
128.0
148.0
178.0
产酸/gL-1
32.6
41.6
17.2
转化率/%
31.0
32.5
28.3
9.6
（四）发酵培养基的优化
FB31的发酵培养基成分包括碳源、氮源、无机盐等。
碳源主要由葡萄糖提供；
玉米浆、豆饼水解液、（NH4）2SO4用以提供氮源；
无机盐有磷酸氢二钾、七水合硫酸镁和碳酸钙，其中碳酸钙除用作钙盐外主要是起pH缓冲作用，使得发酵过程pH不致过低。
固定培养基组成为葡萄糖13%、磷酸氢二钾0.1%、七水合硫酸镁0.05%、碳酸钙4.5%，考察了玉米浆、豆饼水解液和硫酸铵对发酵影响，选用L34正交表，结果如表4-2-4。
表4-2-4正交实验结果
实验号
豆饼水解液
玉米浆
（NH4）2SO4
产酸（g/L）
1（0.5%）
1（2.5%）
1（3%）
21.0
2（1.0%）
2（3.0%）
2（4%）
3（1.5%）
3（3.5%）
3（5%）
4
38.0
22.0
6
33.0
7
24.0
9
30.0
K1
28.0
K2
37.0
K3
26.0
极差
5.0
11.0
表4-2-5方差分析表
方差来源
偏差平方和
自由度
均方
F值
显著性
5.51
2.76
23.0
20.47
10.24
85.3
硫酸铵
21.43
10.72
89.3
误差
0.32
0.12
总和
47.73
F0.01（2,2）=99.0F0.05（2,2）=19.0
从正交实验结果可以看出，豆饼水解液、玉米浆、硫酸铵浓度的变化对发酵都有显著的影响。
豆饼水解液和玉米浆用以提供有机氮和FB31生长所必需的氨基酸，因此添加量过少对发酵不利，但过高的添加量也会使产酸下降，这可能是因为在过多的添加量下发酵液中其它氨基酸浓度的增大对FB31菌株合成赖氨酸有抑制作用。
此外，从实验结果来看，玉米浆浓度过高对发酵尤为不利，这可能是因为玉米浆除用以提供有机氮外，还含有大量菌体生长所必需的因子，在过高的玉米浆浓度下，菌体生长过旺不利产酸。
对黄色短杆菌的赖氨酸发酵，硫酸铵是最好的无机氮源，有结果表明提高硫酸铵的浓度有刺激产酸的作用。
本实验结果表明对于FB31的赖氨酸发酵，硫酸铵浓度有一最佳值为4%，当硫酸铵进一步提高对发酵影响不大。
实验得出FB31菌株发酵培养基的最适组成为（g/L）：
葡萄糖130、玉米浆30、豆饼水解液10、硫酸铵40、磷酸氢二钾1、七水合硫酸镁0.5、碳酸钙45。
用该培养基发酵72h，产酸为42g/L，和菌株FB21相比其产酸性能下降很多。
保持高产菌株遗传性能的稳定，防止回复突变，是发酵工业生产中一个非常重要的问题，目前通常采用的一些方法有：
（1）选育遗传性能稳定的菌株：
经诱变处理后，在易出现回复突变株的培养基中反复传代，选出不发生回复突变的菌株。
（2）定向赋加生产菌的遗传标记：
如选育双缺菌株，增加抗回复突变性能；
对于抗性株，尽量选育多重抗性突变株。
（3）在保藏过程中除选择合理的保藏方法外，对于营养缺陷型菌株要提供足够的营养物，抗性株可添加适量的抗性物质。
（4）必须定期进行分离、纯化工作，保持其遗传性能的稳定。
通过前面的研究可以发现，虽然FB31是从FB21的保藏斜面中接出，但其遗传标记发生了改变，比较FB31和FB21的发酵性能来看，FB31退化较为明显，主要表现在两方面：
一是产酸水平的降低，二是耐高糖性能的降低，表明菌株发生了回复突变。
为此对FB31菌株进行了诱变，希望提高其产酸性能。
四、赖氨酸产生菌FB42的获得
（一）黄色短杆菌产赖氨酸的合成途径与调控机制
根据文献报道，黄色短杆菌产12种氨基酸的合成代谢途径如图4-2-3所示。
氨基酸的代谢途径
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