油菜素甾醇类物质的生理作用及信号传导11Word格式文档下载.docx

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后又合成前体菜油甾醇（Campesterol）、谷甾醇和胆固醇等。

菜油甾醇首先生成菜油甾烷醇（campestanol），然后经过早期C-6氧化和后期C-6氧化2条途径，转化为栗木甾酮，继而转化成油菜素内酯。

现在油菜素甾醇已经在27个科的种子植物、1种羊齿类植物（问荆）、1种苔藓类植物（地钱）、1种绿藻（水网藻）等中得到了鉴定。

因此，油菜素甾醇是一种在陆生植物进化之前就普遍存在于各种植物中的激素。

在被子植物中，油菜素甾醇在花粉、花药、种子、叶片、茎、根、幼嫩的生长组织中均有较低浓度的广泛分布。

现在多数实验表明，BRs缺乏长距离运输模式，可进行短距离运输。

在施用BL处理后的种子，产量可提高45%。

BR促进植物长大，因此生物量自然会增多，这在水果、蔬菜中有着重大的意义。

BR参与调控植物株型的调整，这在农业上也有着潜在的用途。

比如控制株型大小、种植密度等。

外源的表油菜素内酯处理后，作物对各种环境胁迫，如热胁迫、冷胁迫、干旱等的耐受性均会有较大幅度的提高。

二、生理作用

油菜素甾醇为甾醇类激素，也是一类环戊烷多氢菲，但其与动物甾体类激素的作用机制不同，不经过细胞核内受体发挥作用，而是通过细胞膜表面受体传递信号。

油菜素甾醇最早由Michelle于1970年发现。

他从油菜花粉中提取出了一种能促进植物茎杆伸长和细胞分裂的高活性物质，将其称为油菜素（Brassins）。

由于很低浓度的油菜素甾醇就可以强烈诱导生长和分化，并且通过进一步的对拟南芥（Arabidopsisthaliana）的分子遗传学研究，证明油菜素甾醇是一种植物激素。

合成途径：

BR的合成有一系列酶参与完成。

与赤霉素和脱落酸的合成类似，油菜素甾醇的合成也是萜类途径的一个分支。

油菜素甾醇的合成前体为菜油甾醇（Campesterol）、谷甾醇及胆固醇等，其来源于环阿屯醇。

菜油甾醇首先生成菜油甾烷醇（campestanol），然后经过早期C-6氧化和后期C-6氧化2条途径，转化为栗木甾酮。

两条途径在栗木甾酮处合并，继而转化成油菜素内酯。

油菜素唑Brz（Brassinazole）是一种BR合成的特异性抑制剂，其抑制油菜素内酯合成途径中催化6-氧-菜油甾烷醇生成卡它甾酮的单氧酶CYP72B1DWF4的活性。

BR，是新型植物激素，在不同情况下对植物生长发育表现出特殊的调节作用，但因其性质不完全符合植物激素的严格定义，一般称之为植物激素类似物。

合成机制如下图：

生理作用：

BR在植物的生长发育中有着重要的作用，与其他植物激素一起参与调控植物发育的很多方面，包括茎叶的生长、根的生长、维管组织的分化、育性、种子萌发、顶端优势的维持、植物光形态建成等。

另外，对于植物的对环境胁迫的防御中也有重要作用。

油菜素内酯（BS）与根系的生长发育有关系，它在很低浓度水平下能表现出强的生活性。

有实验表明在黄化水稻幼苗第二叶片弯曲实验中，油菜素内酯在0.005mg/L时即可产生明显的倾斜效应。

而生长素、赤霉素虽也有此反应，但一般在较高浓度下，才表现出倾斜效应。

与传统的五大类植物激素相比，其作用机理独特、生理效应广泛、生理活性极高，但用量仅是五大类激素的千分之一。

BS和BR可以促进胚芽鞘的生长

提取的BS与合成的BR均能促进植物胚芽鞘的伸长，且生理活性相似。

以下是BS和BR对水稻胚芽鞘伸长的作用

BR可提高幼苗光合速率

以玉米幼苗为例，epihomoBR浸种后，玉米品种铁单10号幼苗根力活力、根干重、叶面积、地上部干重、充实度、叶绿素a含量、光合速率、玉米素含量均有提高；

叶鞘主脉出维管束细胞径向增大，细胞壁增厚，同时维管束变大。

实验表明，经BR浸种处理，除了能增加光合面积外，还能显著提高光合速率，这充分说明BR能有效提高苗期光合作用，为培育壮苗，增加秧苗干物质的积累创造有利条件。

BR浸种后推断其提高光合速率的机制有两种可能：

一是浸种处理提高了叶片的素质。

二是BR浸种提高了幼苗叶片内ZR（玉米素）的含量，机制如下图所示：

BS生物活性具有稳定性

通过实验，提取的BS促进黄化水稻第二叶切段的效果随BS处理浓度的增大而增加，随BS处理时间的延长而增加，如下图，BS处理时间与黄化水稻叶片倾斜角度的关系，说明BS的生理活性很稳定。

油菜素甾醇类与生长素能够相互作用。

近年来研究表明，BR与生长素能协同调节基因的表达，二者在代谢、运输和信息转导等不同层次上存在相互作用，并且这两种信号与其他信号转导途径，如激素信号转导途径和光信号转导途径之间也存在信号对话。

1.协同调节基因的表达

近年来随着基因芯片技术的应用，推动了BR调节基因表达的研究。

Mussig等利用基因芯片技术，比较BR处理和对照植株，以及BR缺失型突变体和野生型植株的基因表达，发现BR对一些生长素反应基因也有调节作用，BR能快速诱导生长素早期基因IAA3和IAA19的表达，并且这种诱导不仅依赖于生长素的水平。

ARF1是与生长素反应元件结合的转录因子，ARF1结合蛋白（ARF1PB）的功能很可能是调节ARF1的活性。

在BR处理的拟南芥植株中ARF1PB表达较少，这表明BR通过调控ARF1PB基因与生长素协同调节生长素影响基因的表达。

而生长素也能增强BR响应基因TCH4的表达。

2.BR和生长素与其他植物激素的相互作用

除了BR生长素之间存在相互作用外，它们还会共同语其他植物激素相互作用，以调节植物的生长发育。

如在拟南芥中，BL能诱导GA20氧化酶基因（GA20ox）的表达，在豌豆中，生长素能抑制该基因（PsGA20oxl）的表达。

3.BR和生长素与光的相互作用

Reed研究发现BR和生长素共同调节AUX/IAA蛋白和GH3蛋白，同时还可能调节植物的光反应。

在酵母双交中，光敏色素A（PHYA）能与AUX/IAA蛋白相互作用，如燕麦中的PHYA在体外能磷酸化IAA1、SHY2/IAA3、IAA9、AXR3/IAA17和豌豆中的IAA4等AUX/IAA蛋白。

这些实验证据从水分子水平揭示了BR和生长素与光信号之间的相互作用。

二、信号传导

油菜素甾醇的细胞信号通路研究是最近植物学领域最前沿的领域之一。

通过十多年的分子遗传学、生物化学、蛋白质组学和结构生物学研究，已经基本建立了完整的油菜素甾醇细胞信号转导途径。

在油菜的近亲------模式生物拟南芥中发现了BR不敏感突变体，找到的这些拟南芥突变体不仅包括BR生物合成酶的突变，也有感知和传导BR信号的信号蛋白的突变。

BR的信号转导级联反应途径：

细胞表面受体激酶BRI1感知BR

BRI1激酶通过与共受体BAK1的配体诱导契合和相互磷酸化

BKI1的解离而被激活BRI1继而磷酸化BSK1，接着激活BSU1

BIN2由于BSU1催化其Tyr的去磷酸化而被抑制

引起去磷酸化BZR的核内累积和BR应答基因的表达

BRI1在细胞表面感知BR

BR不敏感突变体bri1（brassinosteroidinsenstitive1）是用外源BR处理后仍保持矮小的不敏感状态而鉴定出来的。

bri1的其他等位突变体促使了BRI1基因（编码LRR-RTK蛋白）的克隆。

BRI1的胞外域包含了24个富亮氨酸重复序列（LRR）和一个位于第20和21个LRR之间的“岛”区域（ID）；

胞内结构域包括一个Ser/Thr激酶结构域、一个近膜区（JM）和一个C末端序列。

几组实验证明BRI1的功能是作为BR的受体。

这些实验包括：

嵌合受体BRI1-XA2能在BR诱导下引发防御反应、拟南芥内源的或者大肠杆菌表达纯化的BRI1能与氚标记BL（3H-BL）免疫共沉淀结合、BR能诱导BRI1的自磷酸化。

更深入的研究显示，含94个氨基酸残基的ID-LRR21结构域（包括岛区域ID和紧挨着ID的LRR21）是BR结合的充分条件。

这些研究就证明BRI1是BR受体，并给出了一种新的甾体结合基序。

BR结合到BRI1的胞外域后，激活胞内激酶，进而将信号传递到胞内其它蛋白分子。

28个bri1位点突变的大部分都位于ID-LRR21或胞内激酶结构域，这与BRI1的BR结合和激酶活性的基本功能相吻合。

结构域-结构分析也揭示了JM和CT结构域的重要作用。

去掉JM结构域能消除BRI1的信号功能，这暗示JM在BRI1的功能发挥中起着正调控作用。

相反，去掉BRI1碳末端49个氨基酸残基后，在体外实验中激酶活性更高，转基因到bri1突变体植物后挽救bri1表型更强，这暗示CT起着自抑制的作用。

CT区包含很多磷酸化位点，将这些Ser/Thr位点突变为模拟磷酸化的酸性氨基酸后的效应与去掉这个区域的效应相似，暗示CT区域的磷酸化能帮助激活激酶。

这可能是通过C末端尾巴通过构象改变而释放自抑制功能而发生的。

BR增加BRI1与其共受体BAK1异源寡聚化，诱导受体激酶二聚体化和寡聚体化

动物中的许多研究显示，受体激酶的激活通常需要配体诱导的同源或异源二聚体化，或着异源寡聚体化。

BRI1的同源二聚体化最早是通过对豌豆原生质体的质膜进行荧光能量转移共振实验（FRET）而检测到的。

在此之后，单分子检测技术证明质膜中大约20%的BRI1分子是以同源二聚体形式存在的，并没有更加高级的寡聚体化。

拟南芥转基因植株中BRI1-GFP和BRI1-FLAG融合蛋白的免疫共沉淀实验也检测到了BRI1的同源二聚体化。

尽管在原生质体中，BR对BRI1的同源二聚体化几乎没有作用，但BR处理拟南芥植物后，BRI1-GFP和BRI1-FLAG的免疫共沉淀增加了，这就暗示BR能促进或者是稳定BRI1的同源二聚体化。

目前尚不清楚BR是像生长素诱导TIR1-IAA的二聚体化一样，作为分子胶水来帮助稳定BRI1同源二聚体；

还是BR结合后引起构象变化成为更加偏爱同源二聚体的形式。

据估算，每一分子BL能结合一个分子的BRI1-GFP，这就支持了第二种可能性。

目前也不是很清楚BRI1激酶活性对BR诱导的BRI1同源二聚体化是否是必要的。

不管怎样，BR诱导的BRI1同源二聚体化并不足以完全激活BRI1激酶，还需要共受体激酶BAK1的结合。

BAK1是由两个独立的研究小组分别采用酵母双杂交的方法筛选BRI1互作蛋白和激活标签筛选bri1-5抑制蛋白的方法鉴定到的。

BAK1也叫SERK3，是SERK家族（SERK1-SERK5）五个成员中的一个。

它也是LRR-RTKs，包含有一个具有5个富亮氨酸重复的小胞外域（图１）。

过表达BAK1能抑制bri1弱突变体的表型。

bak1功能缺失突变体表型与bri1弱突变体类似，并且过表达激酶功能缺失的bak1突变体具有强烈的矮化表型，与bri1强突变体类似，推测这是由于显性抑制效应的结果。

最近的BAK1/SERK3及其同源蛋白（SERK1和SERK4）的功能缺失遗传学研究阐明了他们在BR信号中的重要作用，与在其他通路中一样。

在体外实验和酵母实验中，BRI1和BAK1的激酶结构域能相互作用并转磷酸化，并且他们的体内相互作用已经通过转基因拟南芥的免疫共沉淀实验和原生质体的荧光能量转移共振实验证实。

BRI1和BAK1在体外实验中，都有本底激酶活性，相互由对方作用后迅速增加。

在酵母中，只有野生型BRI1和BAK1共表达的时候才能检测到激酶活性，突变或者缺失BRI1或BAK1都不能检测到。

这些结果暗示，BRI1和BAK1受体激酶活性的完全激活需要相互之间的转磷酸化。

图1：

BRI1和BAK1的结构。

BRI1由24个富亮氨酸重复LRR、1个含70个氨基酸的岛区域ID、单跨膜区TM、近膜区JM、激酶结构域KD和C末端尾巴CT组成。

BAK1由4个亮氨酸拉链LZ、5个LRR、1个富脯氨酸区、单跨膜区TM、激酶结构域KD和一个CT组成。

黑色方框表示推测的信号肽序列，灰色方框表示未知的区域。

AL表示激酶结构域的激发环。

圆圈表示得到证实的磷酸化位点，带方框的P表示推测的磷酸化位点。

激活型磷酸化位点用红色表示，抑制性磷酸化位点用蓝色表示，对激酶活性没有明显效应或者没有得到实验验证的用黄色表示。

在拟南芥中，BR处理能促进BRI1和BAK1的相互作用并增加它们的磷酸化水平。

BR诱导的BRI1-BAK1结合似乎是由它们的激酶结构域介导，而不是胞外域的共同结合。

首先，BR结合BRI1并不依赖于BAK1，BAK1也不参与BR与BRI1的结合，在bak1无义突变体和BAK1过表达的植株中，BL结合BRI1的活性都没有发生变化。

其次，BRI1与BAK1的相互作用依赖于它们的激酶活性。

将BAK1的激酶结构域突变后，体外相互作用减弱；

BRI1的激酶结构域突变为没有激酶活性形式后，它们的相互作用几乎完全消失。

一个BRI1激酶活性丧失的突变体不能表现出BR诱导的与BAK1的结合，这暗示对于BR诱导的BRI1与BAK1的结合，完整的胞外域并不是充分条件，而BRI1激酶活性却是必要条件。

然而，酵母中BAK1胞外域亮氨酸拉链中的L46E突变似乎丢失了BAK1与BRI1的结合。

虽然这个结果可能支持了胞外域在BRI1-BAK1结合中的作用，但缺乏与BRI1的相互作用也可能是由于突变BAK1蛋白的定位错误（如滞留在内质网中）或在细胞中的不稳定性。

另一方面，一个BAK1激酶活性丧失的突变体在BR处理后仍能与野生型BRI1结合，这暗示BR首先激活BRI1激酶，BAK1与BRI1的结合是第一步BRI1激酶激活的结果。

BRI1激酶活性的对于与BAK1相互作用和BAK1的激活的必要性也与一个观察到的现象一致，即BAK1过表达只能抑制bri1弱突变的表型，而不能抑制bri1-5det2双突变和bri1无义突变的表型。

以上这些结果显示，BAK1参与BRI1的激活，不参与将BR信号传递到下游物质。

受体激酶的团体行动和多重任务处理

BRI1是高等植物中主要的BR受体。

番茄、水稻和豌豆中BRI1的直向同源物突变能引起BR不敏感的表型。

然而，BRI1并不是唯一的BR受体。

拟南芥中有3个很接近于BRI1的同源蛋白，其中至少2个——BRL1和BRL3——能高亲和地结合BR。

并且，以BRI1启动子表达这两个蛋白后，能挽救bri1突变体的表型。

这些BRI1同源蛋白似乎能介导维管组织中细胞类型特异的BR反应。

这种BRI1同源蛋白的功能特化在进化中显然是在单子叶植物和双子叶植物分化之前形成的，因为水稻的OsBRL1和OsBRL3也能介导组织特异的和细胞类型特异的BR反应。

BAK1也属于RLKs家族中的SERK亚家族（SERK1-SERK5）。

除了BAK1（SERK3），2个SERK家族的其他成员——SERK1和BKK1（BAK1-like1，SERK4）——似乎在BR信号中起着和BAK1冗余的作用。

和BAK1一样，过表达SERK1或BKK1都能部分抑制bri1-5的表型；

体内实验中，它们也能与BRI1相互作用。

虽然bak1功能确实单突变只有比较弱的矮化表型，但bak1serk1-1双突变的BR不敏感的矮化表型显著增强，bak1-4bkk1-1双突变和bak1单突变相比，只有去黄化轻微增强的表型。

遗传学研究也发现了BAK1和SERK家族其他成员在多个信号通路中的作用。

BAK1和BKK1/SERK4参与控制光依赖性细胞死亡过程。

bak1bkk1双突变体表现出光下的幼苗致死表型，但在暗处却没有。

在bak1bkk1双突变中能观察到细胞死亡表型的多个方面，包括防御相关基因的上调和胼胝质、H2O2的积累，但在每个基因的单突变和bri1无义突变体重却没有这种现象。

这就暗示BAK1和BKK1在抑制不依赖于BR信号的细胞死亡通路中起着冗余的作用。

BAK1在病原菌感染后的植物发病过程中起着非常重要的作用。

bak1突变体对腐殖营养病原菌感染表现出更强的易感性。

用BR处理后，只能抑制bak1的生长缺陷表现，而不能抑制他的疾病易感表型，这就支持了BAK1在防御中不依赖于BR的假设。

另外，bak1突变体对病原菌相关分子模式（PAMPs）如鞭毛蛋白、EF-Tu、INF1和CSP22表现出敏感性降低。

更加深入的研究显示，用鞭毛蛋白处理后，BAK1能与鞭毛蛋白受体FLS2（也是一种LRR-RTK）相互作用。

这些结果显示BAK1在鞭毛蛋白信号途径中能作为FLS2的共受体。

Shan及其同事报道了细菌性病原菌的毒性因子能与targetBAK1以战胜寄主防御系统，同时抑制BR信号通路。

过表达细菌效应蛋白AvrPto的转基因植物具有与bri1弱突变体相似的矮小表型，AvrPto和AvrPtoB也能与BAK1相互作用，导致FLS2-BAK1结合的瓦解。

SERK1和SERK2在雄性孢子发生中起着冗余作用。

serk1serk2双突变因为花粉绒毡层发育缺陷而雄性不育。

综合起来，SERK家族的四个成员似乎在4个不同的途径中起着相互重叠的作用：

BAK1、SERK1和BKK1/SERK4在BR信号通路中起作用；

BAK1和BKK1/SERK4在细胞死亡控制中起作用；

BAK1在鞭毛蛋白信号途径和自然免疫中起作用；

SERK1和SERK2在雄性孢子发生中起作用。

一个基因家族的成员可能是通过基因duplication产生的，这样最早得到的基因拷贝功能上就是完全冗余的。

SERK家族不同成员是如何获得并保持自身特定的功能的在进化上是一个有趣的问题。

功能上的特异性或许是由启动子和编码序列的改变而产生的，结果就导致了多种多样的组织特异性基因表达和蛋白活性。

用SERK1或SERK2的启动子驱动SERK3的表达并不能拯救serk1serk2双突变体的雄性不育表型，这说明SERK蛋白功能是特异的。

相反，BRI1同源蛋白的功能特异性是通过启动子改变和基因表达模式改变而获得的，因为用BRI1启动子驱动表达BRL1也能拯救bri1的表型。

番茄BRI1的双重功能是值得注意的，即还能与系统素结合，然而，这项发现之后受到争议。

近期的研究发现得出结论：

番茄BRI1对于BR信号是必需的，但对于系统素的信号不是必需的。

与此类似，孕酮被发现能与一些动物细胞中的催产素的G蛋白偶联受体结合，但这些结果也是随后颇受争议。

通过自磷酸化和转磷酸化调控

为了了解BRI1和BAK1的信号机制，最新的几项的研究主要通过质谱（MS）鉴定出了它们激酶结构域的磷酸化位点（图1）。

体外的磷酸化位点鉴定是通过分析大肠杆菌表达并纯化的重组胞内结构域实现的，而体内磷酸化位点鉴定是通过分析免疫共沉淀的转基因拟南芥的表位标记BRI1或BAK1而实现的。

这些研究明确鉴定出了11个BRI1中的磷酸化位点（6个是体内磷酸化位点，5个只在体外磷酸化）。

质谱数据也说明存在不属于特定氨基酸残基的其他磷酸化位点，包括存在于第VII和第VIII结构域之间激发环上的至少3个位点。

此外，磷酸肽作图（phosphopeptidemapping）之后进行的定点突变证明其他位点存在磷酸化（S1162）。

尽管最初的质谱数据只鉴定出了Ser/Thr残基的磷酸化，最近的一项采用磷酸肽特异性抗体和质谱分析的研究为BRI1的Tyr残基在体内和体外都能磷酸化给出了令人信服的证据，这暗示BRI1是一个双重特异性激酶。

许多鉴定出的或推测出的BRI1磷酸化位点的功能已经通过定点突变后的体外激酶实验和bri1表型挽救实验得到了研究。

这些研究证明BRI1激发环的磷酸化对于激酶活性具有及其重要的作用。

体外实验中，S1044/T1045、T1049、Y1052、Y1057突变的BRI1几乎完全丧失激酶活性，并且不能挽救bri1-5的表型。

两个激发环外的Tyr位点突变（Y956和Y1072）也失去了激酶活性，尽管在体内还没有检测到Y1072的磷酸化。

BRI1的JM区和C末端结构域磷酸化的重要作用也被证明了。

去除JM区后，BRI1不能发挥信号作用和拯救bri1-5突变体表型，并且没有影响BRI1在质膜上的定位。

通过质谱分析，鉴定出了JM区的7个磷酸化位点，它们在体内和体外实验中能自我磷酸化。

其中，四个磷酸化位点的模拟磷酸化替代（S838D、T842D、T846D和S858D）在没有BAK1的情况下增强了BRI1自身的磷酸化，说明JM区的磷酸化激活了BRI1。

然而，JM区调制BRI1活性的激活机制目前仍不清楚。

与JM相反，在体外实验和体内实验中，去除CT区域的BRI1能增加BRI1的激酶活性，且比野生型BRI1更加有效促进地bri1-5和det2突变体的下胚轴生长。

CT尾巴的多个Ser/Thr位点都是磷酸化的，其中8个可能的位点中的4个（S-1162、S-1166、S-1168和T-1180）已经被实验证实。

将CT的多个Ser/Thr残基替换成Asp后能显著增加BRI1不依赖于BAK1的激酶活性。

此外，将CT尾巴包含模拟磷酸化突变位点的BRI1突变体能更加有效抑制det2的矮化表型缺陷。

这些研究结果说明，BRI1的CT尾巴是其激酶结构域的自抑制区，磷酸化可以减轻抑制效应。

BRI1的JM区和CT尾巴的功能说明，胞内域的非催化部分在特异性调节激酶的活性中起着重要作用。

哺乳动物受体激酶胞内非激酶结构域不仅在自调节中起重要作用，也为底物创造结合位点，而这些作用是依赖于磷酸化状况的。

同样，BRI1的JM区和CT尾巴也可能参与调节激酶活性，并能为BRI1下游底物创造结合位点。

目前已经鉴定出了BAK1胞内域的9个磷酸化位点，其中5个（S290,T312,T446,T449,T455）在体内磷酸化，4个在体外（S286,T450,S604,S612）。

和BRI1不同的是，BAK1的磷酸化主要发生在激发环（T446,T449,T450,T455）上，不过最近在体外也鉴定到了CT尾巴上的2个磷酸化位点（S604，S612）。

BAK1激发环上对应于BRI1T1049的T455残基的磷酸化在其功能发挥中