分子生物学精华版Word格式.docx
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耐药性的基础；
具有不相容性（DNA克隆的基础）；
重要性;
质粒带有某些特殊的不同于宿主细胞的遗传信息，所以质粒在细菌内的存在会赋予宿主细胞一些新的遗传性状，如对某些抗生素或重金属产生抗性等。
根据宿主细胞的表型可识别质粒的存在，这一性质被用于筛选和鉴定重组DNA。
3.PCR的原理,反应流程,RT-PCR，PCR与基因复制的异同？
原理：
在微量离心管中,加入适量的缓冲液,微量的模板DNA,四种脱氧单核苷酸,耐热性多聚酶,一对DNA的引物,产生酶促反应,通过高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段反应使特异区段的基因拷贝数倍增；
并进行循环，每一次循环基因拷贝数放大一倍,经过30次循环,最终使基因放大数百万倍。
反应流程:
高温变性（denaturation，94℃），通过加热使模板DNA双螺旋的氢键断裂，解链成单链DNA；
低温退火（anealing 55℃），反应混合物降温，引物与单链DNA模板的互补序列结合，形成模板-引物复合物；
中温延伸（extension70℃左右），将反应混合物升温，在TaqDNA聚合酶作用下，以碱基互补的原则合成一条新的DNA单链.这三个步骤要重复30-40次
RT-PCR:
提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。
再以cDNA为模板进行PCR扩增,它使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，因此让一些极微量的RNA样品分析成为可能。
相同点：
以亲代的DNA为模板，在酶的作用下，以半保留方式合成具有相同序列的新的子代DNA，实现模板包含的遗传信息的复制。
与基因复制的不同点：
DNA复制是以自身为模板边解旋，边复制，边折叠的。
自身DNA复制有一个变构问题。
PCR是一个个核苷酸或脱氧核苷酸用酶接上去，再洗脱再接下一个的，形成的是单链，而且没有包裹的蛋白。
DNA复制在细胞内进行，复制产物为双链DNA：
PCR是一个体外过程，复制产物可以双链也可以是单链
他们的酶不同，反应条件也不同
DNA复制时细胞内的DNA成倍增加；
PCR扩增的是特定的序列
PCR可以复制DNA也可以复制RNA；
基因的DNA复制仅进行DNA复制
PCR的扩增平均每1000个碱基，就有两个错误，保真性远不及基因的DNA复制
4端粒与端粒酶（性质，功能作用，与疾病的关系）？
端粒性质：
是染色体末端的一种特殊结构，是DNA与相关蛋白质的复合体。
功能作用：
维持染色体结构的完整性，防止染色体被核酸酶降解及染色体间互相融合
防止染色体结构基因在复制时丢失，解决了末端复制的问题。
与疾病的关系
端粒酶性质：
是RNA与蛋白质组成的核糖核蛋白，是一种RNA依赖性DNA聚合酶。
是维持端粒的长度，他能利用端粒3’端单链为引物，自身的RNA为模板合成端粒重复序列添加到染色体末端，从而延长端粒的长度，保证DNA分子在复制过程中不会缩短。
5细胞分化与细胞基因表达？
表达指DNA中储存的信息通过生物过程合成活性分子，DNA编码的活性分子有：
活性RNA，包括tRNA、rRNA以及其他催化活性RNA蛋白质的合成必须要经过mRNA阶段才能实现；
现大部分基因表达指蛋白质的表达；
所以基因表达一般包括转录和翻译两个部分的内容。
转录：
以DNA为模板，4种NTP为底物，依碱基配对规律，在DNA指导下合成RNA。
一、原核生物转录
RNA聚合酶;
全酶包括α2ββ`σ；
σ因子的作用是识别启动子元件；
其他4个亚基是为核心；
转录模板:
只使用一条链上的信息作模板；
模板链实际上是反义链；
编码链是正义链；
模板可能位于不同的链上
过程：
起始位点由σ因子识别，一般是TATA盒;
聚合酶的延伸无须σ因子参加;
延伸随模板DNA3`-5`，新生RNA5`-3`;
终止需要RNA形成发卡结构或特殊的蛋白因子辅助；
tRNA和rRNA需转录后加工
真核生物RNA的生物合成
聚合酶有三种，I和III分别负责rRNA和tRNA的转录，RNA聚合酶II负责mRNA的转录
RNA聚合酶的启动子结合蛋白有20种以上，相当于σ的角色；
转录单位单一
过程和原核生物相似，但起始转录复合物的形成复杂
转录产物加工
5`端加帽：
核内完成，典型的加帽反应始在未成熟的mRNA5`末端加上一个三磷酸鸟苷，再使之甲基化，并使相邻的核苷酸甲基化，最后成为m7GpppmNp-结构。
3`加尾：
核内完成，在加尾信号AAUAAA下游20bp左右加100多bp的多聚A
外显子剪接：
在snRNA和蛋白因子参与下，将内含子剪除，二外显子则连接在一起成为连续的单链。
有些内含子能够自我剪除（核酶）。
蛋白质翻译的模板是成熟mRNA
成熟mRNA的编码区从起始密码子（AUG）到终止密码子（UAA，UAG，UGA），这一区域称为开放读码框，前、后的序列称为5`或3`UTR
三联体密码的方向5`-3`
原核生物mRNA在转录后始成熟的，在未完成转录时同时进行翻译
真核生物要加工后运输到细胞质才能进行
mRNA上的密码具有方向性、连续性、兼并性、核通用性
核糖体是蛋白质合成的机器，核糖体有：
结合mRNA的结合位点及结合tRNA的位点；
以上两种结合rRNA的互补有关，非特异性；
结合各种起始、延伸核终止因子的位点；
转肽酶活性；
GTP酶活性
tRNA即可特异性的识别相应的氨基酸，又可通过反密码子识别mRNA上的密码子，是正确翻译的基础在氨基酰tRNA合成酶的催化下，tRNA和相应的氨基酸结合，通过密码子-反密码子互补准确将氨基酸加到延伸的肽链
合成时同一mRNA可以有多个核糖体同时翻译，以提高效率（多聚核糖体）
真核生物需要更多的因子参与
新合成的蛋白质要经过加工才能成为有活性的，包括：
折叠—可能需要伴侣蛋白参与
内质网内进行糖基化修饰，
水解修饰如胰岛素
亚单位聚合
6转录调控
A为什么同一细胞内不同基因表达不同：
同一细胞不同基因，面临不同的转录因子则表达不同。
外界因子刺激转录因子的活化和顺式作用元件结合开启基因开关的表达不同。
B不同细胞同一基因表达不同：
不同分化的细胞在进行甲基化和乙酰化修饰组蛋白时，改变染色体结构或转录因子活性不同，影响基因开关基因表达的不同，且转录因子也有分化和数量的差异，上游的调控序列中有不同的元件，可募集到不同的转录因子组合。
C为什么细胞发育过程中基因表达不同：
在真核基因表达调控中，甲基化起着重要作用。
甲基化的DNA可诱导去乙酰化酶。
因为组蛋白乙酰化后不能形成核小体，而去乙酰化酶则可以解开组蛋白的封闭，使之形成核小体，随着细胞发育，染色质聚集。
但是DNA甲基化与基因的表达成反比关系。
甲基化程度高，基因的表达则降低。
甲基化具有组织特异性，在各组织中都表达的基因如管家基因的调控区多呈低甲基化：
在组织中不表达的基因多呈高甲基化。
所以细胞发育过程中基因表达不同。
D.为什么经过细胞外调节，某些基因结合后转录因子会改变：
转录因子受激酶调节，激酶通过磷酸化级联获得更强的活化基因的能力。
7、折叠与疾病
折叠：
蛋白质的折叠是蛋白质翻译后形成功能蛋白质的必经阶段。
从核糖体合成的新生多肽链必须通过折叠才能形成热力学和动力学稳定的三维结构，并表现出特定的生物学功能。
如果蛋白质的折叠错误，就会形成异常的空间结构，严重者甚至会引起疾病。
蛋白质的折叠需要分子伴侣和折叠酶。
与蛋白质折叠错误有关的疾病：
1）朊病毒：
库鲁病、疯牛病是该种病毒最具有代表性的疾病，具有传染性，其病原是错误折叠的蛋白质。
构成朊病毒的蛋白质形式有PrPC/PrPSC，朊病毒就是PrPSC的蛋白颗粒。
2）老年痴呆症：
也是由于蛋白质错误折叠所引发的疾病。
老年痴呆症病人脑中有淀粉样BETA蛋白和TAU蛋白两类蛋白质的沉淀，其两者都是脑中正常产生的蛋白质转化而来，淀粉样BETA蛋白形成淀粉样斑，TAU蛋白则能引起神经细胞内自损伤。
8、磷酸化、乙酰化、泛素化
磷酸化：
是指在蛋白激酶的催化下，将ATP分子中r-磷酸基团转移至蛋白质分子中Ser/ThrorTyr残基侧链的羟基上，使ATP转为ADP，形成磷酸化衍生物的过程。
乙酰化：
在乙酰基转移酶的催化下，将乙酰CoA的乙酰基转移到蛋白质分子中，使蛋白质乙酰化的过程，称为蛋白质的乙酰化修饰。
泛素化：
相当于给需要降解的蛋白质贴标签，细胞内的蛋白质通过泛素-蛋白质酶复合体途径被降解，即在E1，E2，E3连续催化下使蛋白质泛素化标记，在被26S蛋白酶体降解。
。
9、信号肽、核转位信号
信号肽：
分泌蛋白新生肽链N端的一段能被细胞转运系统所识别的特征性（保守性）氨基酸序列，该序列大约16-30个氨基酸残基，分为N末端碱性区、疏水核心区和加工区三段，是内质网的靶向信号。
核转位信号：
核定位信号是另一种形式的信号肽，它是所有靶向运输的胞核蛋白多肽链都具有的相类似的信号序列，它由4-8个氨基酸残基组成，富含带正电荷的Lys、Arg，并含有Pro，可位于肽链的不同部位，无位置特异性。
它的作用是帮助亲核蛋白进入细胞核。
入核信号的特点在于：
a、由含水的核孔通道来鉴别；
b、入核信号是蛋白质的永久性部分，在引导入核过程中并不被切除，可以反复使用，有利于细胞分裂后核蛋白重新入核。
10.磷酸化级联以及信号分子的特征？
信号转导途径涉及信号转导分子组成主要包括受体和配体两种类型。
特点饱和性（受体数量有限）、特异性、可逆性（复合物形成核解离），失敏现象（受体长期暴露于配体的环境中，反应性下降）和受体内化（受体长期暴露于配体中，受体-配体复合物进入胞质）
11、信号转导途径涉及的信号转导分子类型及特点？
第二信使非蛋白信号分子;
多数涉及G蛋白偶连受体的信号转导;
重要的有：
Camp、cGMP、IP3、DAG、Ca+、PIP3和NO.
蛋白激酶和蛋白磷酸化酶级联是最重要的细胞内信号传递系统包括蛋白苏氨酸激酶;
蛋白酪氨酸激酶;
对应的磷酸化酶
G蛋白三聚体G蛋白属于膜结合蛋白由三个亚基构成alpha亚基结合GTP活化后，可激活膜上的腺苷酸活化酶等小分子G蛋白其中ras/rap蛋白在信号转导过程中的地位最为重要.
答：
信号转导途径涉及的信号转导分子组成主要包括受体和配体两种类型。
他们的特点如下：
饱和性（受体数量有限）、特异性、可逆性（复合物形成和解离）、失敏现象（受体长期暴露于配体的环境中，反应性下降）和受体内化（受体长期暴露于配体中，受体-配体复合物进入胞质）
11.第二信使的种类：
12.E2F与RB的关系，以及上游调节因素：
关系：
RB蛋白与转录因子E2F-DP1的结合对G1期进展产生负调节作用；
在G1早期，低磷酸化的RB与E2F-DP1复合物结合，抑制它的转录因子功能；
在G1中期及晚期，周期蛋白D-Cdk4-6和E/Cdk2先后磷酸化RB，磷酸化的RB失去活性，释放E2F-DP1，游离的E2F-DP1活化靶基因转录。
上游调节因素：
？
13.细胞内凋亡途径和细胞外凋亡途径
细胞内凋亡途径：
最初凋亡信号在细胞内产生，如P53蛋白受DNA损伤的激活以及胞内氧化损伤信号。
Bcl-2家族蛋白通过控制线粒体的通透性来控制CytoC的释放，Bcl-2和Bcl-xl结合与线粒体膜抑制凋亡；
Bad/bid/bax/bim位于胞浆，在接到凋亡信号后转位到线粒体膜，促进释放；
P53因子可上调Bad/bid/bax/bim的表达，促进凋亡。
许多生长因子和细胞因子在促进DNA复制的同时可通过磷酸化抑制Bad蛋白
细胞外凋亡途径：
细胞外凋亡信号通过不同的信号转导激活凋亡效应分子，死亡受体包括FAS,TNFR,DR3,DR4,DR5;
通过FADD连接并激活caspase8,10.作用于线粒体，线粒体Cytoc+Apaf1释放，在细胞质结合caspase9,称凋亡小体，激活其他caspase导致多数蛋白分解。
TNFR和DR3可通过RIP活化NF-KappaB抑制凋亡。
14.重组DNA技术（过程，目的基因序列的筛选与鉴定，限制性核酸内切酶Ⅱ型的特性）？
流程
（1）产生DNA片段（目的基因的获取）：
通过构建基因组DNA文库、构建酶cDNA文库、PCR扩增、化学人工合成等方法，通过限制性核酸内切酶、聚合酶、修饰酶等催化获得目的基因的序列
（2）DNA片段与载体DNA分子相连接:
分离的基因和核苷酸序列自身不能繁殖，需要载体携带他们到适合的细胞中复制和表现功能。
目的基因或序列插入载体，主要靠DNA连接酶和双链DNA粘末端单链序列互补结合的配合使用。
常用的载体有质粒，噬菌体、和病毒载体。
（3）将重组的DNA分子导入宿主细胞：
载体外源DNA或质粒DNA携带导入宿主细胞（4）选出含有所需要的重组DNA分子的宿主细胞进行扩增和表达：
DNA重组筛选、鉴定。
常用的筛选与鉴定：
①根据重组载体的标志作筛选②b-半乳糖苷酶显色反应选择法③用核酸杂交法进行筛选④PCR法进行筛选⑤免疫学方法进行筛选⑥核苷酸序列测定⑦DNA限制性内切酶图谱分析
限制性核酸内切酶Ⅱ型酶的特点:
只有一条肽链构成，切割DNA特异性最强，在识别位点范围内切断DNA。
通常在重组DNA技术使用的限制性核酸内切酶。
其中II型酶，由于其核酸内切酶活性和甲基化作用活性是分开的，并且核酸内切作用具有序列特异性，故在基因克隆中有特别广泛的用途。
II型酶的特点
（1）识别序列：
4-6碱基对，识别序列往往是旋转对称回文结构的双链DNA。
（2）切割方式：
平末端或粘末端。
（3）同裂酶：
识别位点相同，切割位点相同或不同。
（4）同尾酶：
来源不同，识别序列不同，但产生的粘性末端相同。
I类限制性核酸内切酶由三种不同亚基构成，兼有修饰酶活性，随机切割在识别位点1000bp以为的DNA序列。
Ⅲ类限制性内切酶：
由两种不同的亚基组成，兼有内切酶活性和修饰酶活性，切割位点在识别序列周围25-30bp范围内。
⏹星活性（staractivity）
——非最适条件下酶的识别特异性降低，产生非特异的切割现象。
⏹引起Star活性的原因
1.较高的甘油浓度（>
5%v/v）。
2.酶与底物DNA比例过高（不同的酶情况不同，通常为>
100U/μg）。
3.低盐浓度（<
25mM）。
4.高pH值（pH>
8.0）。
5.存在有机溶剂（如DMSO、乙醇、乙烯乙二醇、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺等）。
6.用其他二价离子替代镁离子。
Star活性是内切酶的一种普遍现象，但是大多数可以控制，正常情况下使用提供的缓冲液就不会出现Star活性。
15.P53，RB作用机制，哪些情况下导致保护作用丧失？
抑癌基因概念：
指能够抑制细胞癌基因活性的一类基因，其功能是抑制细胞周期，阻止细胞数目增多以及促使细胞死亡。
通常是一对等位基因突变或缺失时，细胞发生癌变。
癌基因：
是一类会引起细胞癌变的基因。
其实，癌基因有其正常的生物学功能，主要是刺激细胞正常的生长，以满足细胞更新的要求。
当癌基因发生突变后，才会在没有接受生长信号的情况下仍然不断地促使细胞生长或使细胞免于死亡，最后导致细胞癌变。
P53基因作用：
人类p53基因定位于17p13，全长16-20kp，含有11个外显子，转录2.8kb的mRNA，编码的蛋白质为p53，有一种核内磷酸化蛋白。
P53基因是人类迄今为止发现的与人类肿瘤相关性最高的基因，起癌基因作用的是突变型p53，野生型p53是重要的抑癌基因。
机制：
野生型p53蛋白在维持细胞正常生长、抑制肿瘤增殖中起着重要作用，一单细胞DNA遇到损害，p53蛋白与基因DNA相应部位结合，其特殊转录因子作用，活化p21基因转录，使细胞停滞于G1期；
抑制解链酶活性，并与复制因子A相互作用于DNA的复制有修复；
若失败，p53蛋白立即启动程序性死亡过程诱导细胞自杀，阻止癌变倾向突变细胞生成，从而防止细胞恶变。
P53发生突变后自身空间构象发生变化，影响转录活化功能，从而突变型p53蛋白与野生型蛋白p53结合，形成寡聚蛋白不能结合DNA，使癌变基因转录失控导致肿瘤。
P53作用机制：
野生型P53蛋白在维持细胞正常生长/抑制恶性增殖中起重要作用。
P53基因时刻监控基因的完整性，一旦细胞DNA遭到损害，P53蛋白与基因的DNA相应部位结合，起特殊转录因子作用，活化P21基因转录，使细胞停滞于G1期；
抑制解链酶活性；
并与复制因子A相互作用参与DNA的复制与修复；
如果修复失败，P53蛋白即启动程序性死亡过程诱导细胞自杀，阻止有癌变倾向突变细胞生成，从而防止细胞突变。
P53致瘤因素：
一些蛋白质能与P53作用，导致其正常生物学功能丧失，DNA肿瘤病毒如：
HPV16,18,SV40和腺病毒编码癌蛋白，引起宿主细胞的恶性突变，这些癌蛋白如SV40T抗原，腺病毒ELa,ELb,HPVE6能与RB,P53结合，从而降低P53正常功能，而SV40T，腺病毒ELb没有发现这种降解方式。
此外，P53还可以被细胞基因产物相互作用而失活
P53基因突变
RB作用机制：
控制细胞周期进展的各种因子在肿瘤的发生中起中枢的作用.pRB蛋白在细胞周期从G1到S期的进展中起调节作用。
G1到S期的过渡是一个主要的调控点，而且这种过渡伴随一些与细胞周期进展有关的基因的激活。
激活这些基因的转录因子是E2F家族成员，这些家族成员是pRb蛋白的靶分子。
RB致瘤因素：
缺失无正常RB基因
RB蛋白高磷酸化状态，不能与E2F结合
致瘤病毒蛋白与RB蛋白结合
突变的RB基因不能与E2F蛋白结合
16.两种a地贫基因组合四种表现型？
静止型α地贫:
α+地贫杂合子（α+/αA）四个α基因只有一个缺失或功能障碍
标准型α地贫：
α0地贫杂合子（α0/αA）α+纯合子引起α链轻度合成减少
HbH：
α+地贫和α0地贫双重杂合子，只能合成少量α链，多余的β链聚合形成HBH（β4）
HbBart’Sα0地贫纯合子（α0/α0）完全不能合成α链，γ链形成4个亚单位（γ4）
17.核酸分子杂交的原理，影响因素？
杂交技术的方法种类与检测对象？
定义：
具有互补序列的两条单链核酸分子在一定条件下（适宜的温度及离子强度等）碱基互补配对结合，从新形成双链；
在这一过程中，核酸分子经历了变性和复性的变化，以及在复性过程中分子间键的形成和断裂。
杂交的双方待测核酸的已知序列。
原理：
一DNA变性1方法：
热变性：
90~100℃，酸碱变性：
常采用碱变性，化学试剂变性：
尿素、甲酰胺、甲醛等。
2特点：
粘度增加、密度增加、增色效应、溶解温度（meltingtemperature,Tm）影响因素：
1核酸分子的浓度和长度2温度3.离子强度4.杂交液中的甲酰胺5.核酸分子的杂交性，非特异性杂交反应。
方法：
Southern印迹法杂交：
检测经酶切、凝胶电泳分离的，已转移到膜上的DNA。
Northern印迹法：
检测凝胶电泳分离的，已转移到膜上的RNA
斑点印迹杂交：
检测未经凝胶电泳分离的，固定在膜上的DNA或RNA。
原位杂：
直接检测细胞或组织中的DNA或RNA。
Western印迹法：
检测经电泳分离的，转移到固相载体上的非标记蛋白质，用特异的抗血清对蛋白质进行鉴定及定量的方法
液相杂交：
核酸分子和核酸探针存在于杂交液中
Western印迹法和液相杂交。
菌落印记杂交（检测细菌固定在膜上后，经裂解释放的DNA）
18.DNA芯片的原理？
DNA芯片技术就是一种大规模的集成的固相核酸分子杂交，以大量已知碱基序列的寡核苷酸片段为探针，检测样品中哪些核酸序列与其互补，然后通过定性定量分析得出待测样品的基因序列以及表达的信息。
其方法包括芯片的制备，样品的准备，分子杂交和检测分子DNA。
19.核移植技术原理和方法流程?
核移植是指利用显微外科手术的方法将胚胎细胞或成体细胞的细胞核移人去核的卵母细胞中，构建成重组胚，通过体内或体外培养、胚胎移植，产生与供体细胞基因型相同的后代的技术过程，又称为动物克隆技术。
根据核供体的来源不同，可将其分为胚胎细胞克隆动物和体细胞克隆动物技术。
通常所说的动物克隆指体细胞克隆，即动物的无性繁殖.
方法流程：
㈠目的基因的获取。
1．化学合成法。
2．基因组DNA文库。
3．cDNA文库。
4．PCR。
㈡克隆载体的选择和构建。
㈢外源基因和载体的连接。
1．粘性末端连接。
2．平端连接。
3．同聚物加尾连接。
4．人工街头连接。
㈣重组DNA导入受体细胞。
转化：
是指将质粒或其他外源DNA导入处于感受态的宿主菌，并使其获得新的表型的过程。
感染：
λ噬菌体、粘性质粒和真核细胞病毒为载体的重组DNA分子，在体外包装成具有感染能力的病毒或噬菌体颗粒，然后才能感染适当的细胞，并在细胞内扩增。
转染：
转染是转化和感染两个词构成的新词，指真核细胞主动摄取或被动导入外源DNA片段而获得新的遗传表型的过程。
常用方法有：
电穿孔法、磷酸钙共沉淀法和脂质体融入法等。
㈤目的基因序列的筛选与鉴定：
①根据重组载体的标志作筛选
b-半乳糖苷酶显色反应选择法③用核酸杂交法进行筛选④PCR法进行筛选⑤免疫学方法进行筛选⑥DNA限制性内切酶图谱分析⑦核苷酸序列测定㈥克隆基因的表达
20.转基因技术、基因敲除技术与siRNA技术的异同
转基因技术：
是指将外源性基因导入受精卵或胚胎干细胞中，通过外源性基因与细胞染色体DNA的随机重组，而将外援基因插入到受体染色体DNA中，并随细胞分裂而遗传给后代，使遗传物质得到改造的生物在性状、营养和消费品质等方面向人类需要的目标转变。
基因敲除：
通过DNA同源重组，定向将外源性基因插入宿主细胞染色体DNA，从而使特定基因在细胞内或生物体内失活的过程。
基因敲除的基本程序：
1打靶载体的构建2.胚胎干细胞的体外培养3.打靶载体带入胚胎干细胞4.同源重组胚胎干细胞的筛选5.基因敲除胚胎干细胞注射入胚泡6.胚泡植入假孕小鼠的子宫内7.杂交育种获得纯合的基因敲除动物。
siRNA：
siRNA技术是用目标RNA合成siRNA，用siRNA干涉目标RNA，以抑制目标RNA的表达，进而研究目标RNA的功能，从而描绘支配从细胞形态到信号系统的遗传网络
21.病毒与其他微生物
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