《环境微生物学》和《大气污染控制工程》实验教案Word格式.docx

《环境微生物学》和《大气污染控制工程》实验教案Word格式.docx

《《环境微生物学》和《大气污染控制工程》实验教案Word格式.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《《环境微生物学》和《大气污染控制工程》实验教案Word格式.docx（51页珍藏版）》请在冰点文库上搜索。

实验室中常用的还有热空气灭菌的方法，即将洗干净的待灭菌器皿均匀放入恒温干燥箱内，便不得与内层底板直接接触。

关闭箱门，开户电源开关，用恒温调节器，使温度上升至160-170℃，维持2h，即可达到灭菌目的。

灭菌完毕后，需关闭电源开关，待温度降至50℃以下时，方可开门取物，否则玻璃器皿可因骤冷而爆裂。

4.培养基的制备

配制一般培养基的主要程序可分为：

调配、溶化、调节Ph、澄清过滤、分装、灭菌、鉴定等步骤。

①调配：

按培养基配方准确称取各成分，用少量水溶解。

对于肉膏之类粘、胶状物，可盛在小烧杯或表面皿中称量，然后加水移入培养基中。

此外，也可放在称量纸上称量后直接放入水中，这时如稍微加热，肉膏便会与称量纸分离，然后立即取出纸片。

蛋白胨等极易吸潮物质，在称取时动作要迅速。

此外，维生素、氨基酸、无机盐等微量成分，可预先配制高深度的贮备液，在配制培养基过程中再按配方比例取一定量加入培养液中即可。

②融化：

将各成分混匀于水中，最好以流通蒸汽融化0.5h，如在电炉上融化应随时搅拌，如有琼脂成分时，应注意防止外溢。

融化后，应注意补充失去的水分，补足至原体积。

制备大量培养基时，除玻璃器皿外，还可用搪瓷桶、铝锅等容器加热融化，但不可用锅或铁锅，以免金属离子进入培养基中影响细菌生长。

③调节pH值：

一般细菌用的培养pH调整在6.8-7.2之间，但也有需要酸性或碱性的培养基。

培养基高压灭菌后，pH值约降低0.1-0.2，故调节时应比实际需要的pH值高0.1-0.2。

但有时也可降低0.4，因所使用的灭菌器不同而不同。

调节pH值，用盐酸和氢氧化钠，因为在相同pH值下，有机酸比无机更易抑制微生物生长，因此，除非特殊情况，最好不要用乙酸等有机酸来调节pH值。

一般用精密pH试纸调节（精确到0.1pH单位），必要时也可酸度计。

调节时需注意逐步滴加，勿使过酸或过碱而破坏培养基中某些组分。

④过滤澄清：

培养基配成后，一般都有沉渣或混浊，需过滤，使其清晰透明方可使用。

液态培养基常用滤纸过滤；

固态培养基如琼脂培养基，加热后需趁热用脱脂棉或多层纱布过滤。

⑤分装：

将调节pH值后的培养基按需要趁热分装于三角瓶或试管内，以免琼脂冷凝。

分装量不宜超过容器的2/3，以免灭菌时外溢。

分装时应注意勿使培养基粘附于管口与瓶口部位，以免沾染棉塞而滋生杂菌。

基础培养基一般常分装于三角瓶内，分装的量应根据使用目的和要求决定，但必须定量分装，以便灭菌后使用。

琼脂斜面分装量为试管容量的1/5，灭菌后须趁热放置成斜面，斜面长度约为试管长度的2/3。

半固体培养基分装量约占试管长度的1/3，灭菌后趁热直立，待冷却凝固。

高层琼脂分装量约为试管长度的1/3，灭菌后直立凝固待用。

琼脂平板是将灭菌后的培养基，冷却至50℃左右，在无菌条件下倾入灭菌平皿内。

内径9cm的平皿倾注培养基约15ml左右，使培养基平铺于皿底部，凝固后即成。

倾注培养基时，切勿将皿盖全部启开，以免空气中尘埃及细菌落入。

新制成的培养平板，表面水分较多，不利于细菌的分离，通常应将平皿倒扣置于37℃培养箱内约30min，待平板干燥后使用。

⑥灭菌：

加热配制培养基后，在2h内进行了灭菌处理。

不要把未灭菌的培养基冷藏或存放。

绝大多数培养基都应放在高压灭菌器内于121℃灭菌，并应在达到这一温度后持续15min。

糖类液态培养基或含有其他特殊成分的培养基，高压蒸汽灭菌会使其分解，一用滤膜过滤灭菌。

或者将不耐热物质用其他方法灭菌（如流通蒸汽灭菌）后，再加入已灭菌的培养基中。

⑦保存：

配制好的培养基，不宜保存过久，以少量勤配制为宜。

每批应注明制作日期。

已灭菌的培养基可在4-10℃存放1个月。

存放时应避免阳光直射，并且要避免杂菌浸入和液体蒸发。

当发酵管中的液体培养基存放在冰箱或者适中的低温时，可能有空气溶解进去，以致在37℃培养时，会在管内形成空气泡。

因此，凡存放在低温的发酵管，使用前应先予以培养过夜，弃去有气泡的管子。

液态培养基在室温下存放超过一周，可能有水分蒸发，如果管内液体损失10%，应弃去不用。

5.各种培养基的成分与制备

为减少配制中的误差，尽量选用市售已配好的综合培养基。

（1）营养琼脂培养基

蛋白胨　　　10ｇ　　　　　　　牛肉浸膏　　　3ｇ

氯化钠　　　5ｇ　　　　　　　　琼脂　　　　15-20ｇ

蒸馏水　　　1000ml

将上述成分混匀后，调节pH为7.4-7.6，过滤去除沉淀，分装于玻璃容器中，经121℃高压蒸汽灭菌15min，贮存于暗处备用。

（2）乳糖蛋白胨培养液

氯化钠　　　5ｇ　　　　　　　　乳糖　　　　5ｇ

1.6％溴甲酚紫乙醇溶液　　1ml

将蛋白胨、牛肉浸膏、乳糖、氧化钠加热溶解于1000ml蒸馏水中，调节pH为7.2-7.4，再加入1.6％溴甲酚紫乙醇溶液1ml，充分混匀，分装于含有倒置的小玻璃管的试管中，于高压蒸汽灭菌器中，在115℃高压蒸汽灭菌20min，贮于暗处备用。

此培养基适用于检验大肠菌群时作发酵试验用。

根据实际需要，也可按上述配方比例（除蒸馏水外）配成二倍、三倍或五倍浓缩的乳糖蛋白胨培养液，制法同上。

（3）品红亚硫酸钠培养基（多管发酵用）

蛋白胨　　　10ｇ　　　　　　　乳糖　　　10ｇ

琼脂　　　20-30ｇ　　　　　　磷酸氢二钾　3.5ｇ

无水亚硫酸钠　　5ml　　　　　蒸馏水　　　1000ml

5％碱性品红乙醇溶液　　20ml

①贮备培养基：

先将琼脂加至900ml蒸馏水中，加热溶解，然后加入磷酸氢二钾及蛋白胨，渴匀使其溶解，再以蒸馏水补足至1000ml，调节pH为7.2-7.4。

趁热用脱脂棉或多层纱布过滤，再加入乳糖，混匀后定量分装于烧瓶内，置高压蒸汽器中，在115℃高压蒸汽灭菌20min。

贮于暗处备用。

②平板培养基：

将上述贮备培养基加热融化。

以无菌操作，根据瓶内培养基的容量，用灭菌吸管按1：

50的比例吸取一定量的5％碱性品红乙醇溶液置于灭菌空试管中；

再按1：

200的比例称取所需的无水亚硫酸钠置于另一灭菌空试管内，加灭菌水少许使其溶解，再置于沸水浴中煮沸10min灭菌。

用灭菌吸管吸取已灭菌的亚硫酸钠溶液，滴加于碱性品红乙醇溶液内至深红色褪成淡红色为止（不宜多加）。

将此混合液全部加入已融化的贮备培养基内，并充分混匀（防止产生气泡）。

立即将此种培养基适量（约15ml）倾入已灭菌的空平皿内，待其冷却凝固后，倒置冰箱内备用。

此种已制成的培养基于冰箱内保存不宜超过两周，如培养基已由淡红色变成深红色，则不能再用。

（4）伊红美蓝培养基（ERB培养基）

琼脂　　　　20ｇ　　　　　　磷酸氢二钾　2.0ｇ

蒸馏水　　　1000ml　　　　2％伊红（曙红）水溶液　　20ml　　　　　

0.5％美蓝（亚甲基蓝）水溶液　　13ml

以无菌操作，根据瓶内培养基的容量，用灭菌吸管按比例吸取一定量的2％伊红水溶液及0.5％美蓝水溶液加入已融化的培养基内，并充分混匀（防止产生气泡）。

当混合好的培养基冷却至45℃，便立即将此种培养基适量（约15ml）倾入已灭菌的空平皿内，待其冷却凝固后，倒置冰箱内备用。

四、操作步骤

l．水样的采取

（1）自来水：

先将自来水龙头用火焰烧灼3min灭菌，再开放水龙头使水流5min后，以灭菌三角烧瓶接取水样，以待分析。

（2）池水、河水或湖水：

应取距水面l0～15cm的深层水样，先将灭菌的带玻璃塞瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻转过来，除去玻璃塞，水即流入瓶中，盛满后，将瓶塞盖好，再从水中取出，最好立即检查，否则需放入冰箱中保存

2．细菌总数测定

（1）自来水

①用灭菌吸管吸取lml水样，注入灭菌培养皿中。

共做两个平皿。

②分别倾注约15mL己溶化并冷却到45℃左右的肉膏蛋白胨琼脂培养基，并立即在桌上作平面旋摇，使水样与培养基充分混匀。

③另取一空的灭菌培养皿，倾注肉膏蛋白胨琼脂培养基15mL作空自对照。

④培养基凝固后，倒置于37℃ 

温箱中，培养24h，进行菌落计数。

⑤两个平板的平均菌落数即为lml水样的细菌总数。

（2）池水、河水或湖水等

①稀释水样：

取3个灭菌空试管，分别加入9ml灭菌水。

取lml水样注入第一管9ml灭菌水内、摇匀，再自第一管取1ml至下一管灭菌水内，如此稀释到第三管，稀释度分别为10-1、10-2与10-3。

稀释倍数看水样污浊程度而定，以培养后平板的菌落数在30～300个之间的稀释度最为合适，若三个稀释度的菌数均多到无法计数或少到无法计数，则需继续稀释或减小稀释倍数。

一般中等污秽水样，取10-1、10-2、10-3三个连续稀释度，污秽严重的取10-2、10-3、10-4三个连续稀释度。

②自最后三个稀释度的试管中各取lmL稀释水加入空的灭菌培养皿中，每一稀释度做两个培养皿。

③各倾注15ml已溶化并冷却至45℃左右的肉膏蛋白胨琼脂培养基，立即放在桌上摇匀。

④凝固后倒置于37℃培养箱中培养24h。

3．菌落计数方法

（1）先计算相同稀释度的平均菌落数。

若其中一个平板有较大片状菌苔生长时，则不应采用，而应以无片状菌苔生长的平板作为该稀释度的平均菌落数。

若片状菌苔的大小不到平板的一半，而其余的一半菌落分布又很均匀时，则可将此一半的菌落数乘2以代表全平板的菌落数，然后再计算该稀释度的平均菌落数。

（2）首先选择平均菌落数在30~300之间的，当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，则以该平均菌落数乘其稀释倍数即为该水样的细菌总数。

（3）若有两个稀释度的平均菌落数均在30～300之间，则按两者菌落总数之比值来决定。

若其比值小于2，应采取两者的平均数；

若大于2，则取其中较小的菌落总数。

（4）若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数。

（5）若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数。

（6）若所有稀释度的平均菌落数均不在30～300之间，则以最近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数。

五、实验报告

1．结果

2．思考题

（1）从自来水的细菌总数结果来看，是否合乎饮用水的标准？

（2）你所测的水源水的污秽程度如何？

（3）国家对自来水的细菌总数有一标准，那么各地能否自行设计其测定条件（诸如培养温度，培养时间等）来测定水样总数呢？

为什么？

实验二、实验室环境和人体表面微生物的检查

1.证明实验室环境与体表存在微生物。

2．比较来自不同场所与不同条件下细菌的数量和类型。

3．观察不同类群微生物的菌落形态特征。

4．体会无菌操作的重要性。

平板培养基含有细菌生长所需要的营养成分，当取自不同来源的样品接种于培养基上，在适宜温度下培养1～2d内每一菌体即能通过很多次细胞分裂而进行繁殖，形成一个可见的细胞群体集落，称为菌落。

每一种细菌所形成的菌落都有它自己的特点，例如菌落的大小，表面干燥或湿润、隆起或扁平、粗糙或光滑，边缘整齐或不整齐，菌落透明或半透明或不透明，颜色以及质地疏松或紧密等。

因此，可通过平板培养来检查环境中细菌的数量和类型。

肉膏蛋白胨琼脂平板。

2．仪器或其他用具：

无菌水，灭菌棉签（装在试管内），接种环，试管架，酒精灯或煤气灯，记号笔，废物缸。

每组在“实验室”和“人体”两大部分中各选择一个内容做实验，或由教师指定分配，最后结果供全班讨论。

l．写标签

任何一个实验，在动手操作前均需首先将器皿用记号笔做上记号，写上班级、姓名、日期，本次实验还要写上样品来源（如实验室空气或无菌室空气或头发等），字尽量小些，写在皿底的一边，不要写在当中，以免影响观察结果。

培养皿的记号一般写在皿底上。

如果写在皿盖上，同时观察两个以上培养皿的结果，打开皿盖时，容易混淆。

2．实验室细菌检查

（1）空气：

将一个肉膏蛋白胨琼脂平板放在当时做实验的实验室，移去皿盖，使琼脂培养基表面暴露在空气中；

将另一肉膏蛋白胨琼脂平板放在无菌室或无人走动的其他实验室，移去皿盖。

lh后盖上两个皿盖。

（2）实验台和门的旋钮

①用记号笔在皿底外面中央画一直线，再在此线中间处画一垂直线。

②取棉签：

左手拿装有棉签的试管，在火焰旁用右手的手掌边缘和小指、无名指夹持棉塞（或试管帽），将其取出，将管口很快地通过煤气灯（或酒精灯）的火焰，烧灼管口；

轻轻地倾斜试管，用右手的拇指和食指将棉签小心地取出。

塞回棉塞（或试管帽），并将空试管放在试管梁上。

③弄湿棉签：

左手取灭菌水试管，如上法拨出棉塞（或试管帽）并烧灼管口，将棉签插入水中，再提出水面，在管壁上挤压一下以除去过多的水分，小心将棉签取出，烧灼管口，塞回棉塞（或试管帽），并将灭菌水试管放在试管梁上。

④取样：

将湿棉签在实验台面或门旋钮上擦拭约2cm2的范围。

⑤接种：

在火焰旁用左手拇指和食指或中指使平皿开启成一缝，再将棉签伸人，在琼脂表面顶端接种，即滚动一下，立即闭合皿盖。

并按图27-2E和F，将原放棉签的空试管拨出棉塞（或试管帽），烧灼管口，插入用过的棉签，将试管放回试管架。

⑥划线：

另取接种环在火焰上灭菌，按图3—3方法进行划线，整个划线操作均要求无菌操作，即靠近火焰，而且动作要快。

3．人体细菌的检查

（1）手指（洗手前与洗手后）

①分别在两个琼脂平板上标明洗手前与洗手后（班级、姓名．日期）。

②移去皿盖，将未洗过的手指在琼脂平板的表面，轻轻地来回划线，盖上皿盖。

③用肥皂和刷子，用力刷手，在流水中冲洗干净，干燥后，在另一琼脂平板表面来回移动，盖上皿盖。

（2）头发：

在揭开皿盖的琼脂平板的上方，用手将头发用力摇动数次，使细菌降落到玻脂平板表面，然后盖上皿盖。

A.接种时，用左手将平皿开启一缝；

B.棉签伸入平板接种；

C.用己灭菌并冷却了的接种环划线；

D.第二部分划线；

E.最后部分划线

（3）咳嗽：

将去皿盖的琼脂平板放在离口约6～8cm处，对着琼脂表面用力咳嗽，然后盖上皿盖。

（4）鼻腔

①按照实验台检查法的步骤②和③，取出棉签，并将其弄湿。

②用湿棉签在鼻腔内滚动数次。

③按实验台检查法的步骤⑤和⑥，接种与划线，然后盖上皿盖。

4．将所有的琼脂平板翻转，使皿底朝上，放37℃培养箱，培养1～2d。

五、结果记录方法

（1）菌落计数 

在划线的平板上，如果菌落很多而重叠，则数平板最后1/4面积内的菌落数。

不是划线的平板，也一分为四，数l/4面积的菌落数。

（2）根据菌落大小、形状、高度、干湿等特征观察不同的菌落类型。

但要注意，如果细菌数量太多，会使很多菌落生长在一起，或者限制了菌落生长而变得很小，因而外观不典型，故观察菌落的特点时，要选择分离得很开的单个菌落。

菌落特征描写方法如下：

①大小：

大、中、小、针尖状。

可先将整个平板上的菌落粗略观察一下，再决定大、中、小的标准，或由教师指出一个大小范围。

②颜色：

黄色、金黄色、灰色、乳白色、红色、粉红色等。

③干湿情况：

干燥、湿润、粘稠。

④形态：

圆形、不规则等。

⑤高度：

扁平、隆起、凹下。

⑥透明程度：

透明、半透明、不透明。

⑦边缘：

整齐、不整齐。

六、菌落总数计算方法

T—平皿暴露时间（分钟）

七、实验报告

（1）将你自已的平板结果记录于下表中。

（2）与其他同学所做的结果进行比较

（1）比较各种来源的样品，哪一种样品的平板菌落数与菌落类型最多？

（2）人多的实验室与无菌室（或无人走动的实验室）相比，平板上的菌落数与菌落类型有什么区别？

你能解释一下造成这种区别的原因吗？

（3）洗手前后的手指平板，菌落数有无区别？

（4）通过本次实验，在防止培养物的污染与防止细菌的扩散方面，你学到些什么？

有什么体会。

实验三　大气环境中TSP的测定

大气环境中TSP是一种常规的污染物，它们对人体健康、植被生态和能见度等都有着非常重要的直接和间接影响。

因此，对TSP污染物的浓度监测是环境监测中一项重要的工作。

本实验在校园中及附近的工业区、公路傍进行采样分析。

通过本实验，应达到以下目的：

（1）掌握重量量测定大气环境中TSP浓度的方法；

（2）了解TSP污染物对人体健康的危害；

（3）学习环境监测中质量控制和保证的概念。

通过具有一定切割特性的采样器，以恒速抽取一定体积的空气，空气中粒径小于100μm的悬浮颗粒物被截留在已恒重的滤膜上。

根据采样前、后滤膜质量之差及采样体积，计算总悬浮颗粒物的浓度。

滤膜经处理后，可再进行组分分析。

本方法适用于大流量或中流量总悬浮颗粒物采样器（简称采样器）进行空气中总悬浮颗粒物的测定。

方法的检测限为0.001mg/m3。

总悬浮颗粒物含量过高或雾天采样使滤膜阻力大于10kPa时，本方法不适用。

三、实验仪器和材料

（1）大流量或中流量采样器：

1台，应按ＨＹＱ1.1-89《总悬浮颗粒物采样器技术要求（暂行）》的规定。

（2）大流量孔口流量计：

1个，量程0.7-1.4m3/min，流量分辨率0.01m3/min，精度优于±

2％。

（3）中流量孔口流量计：

1个，量程70-160L/min，流量分辨率1L/min，精度优于±

（4）U型管压差计：

1个，最小刻度0.1hPa。

（5）X光看片机：

1台，用于检查滤膜有无缺损。

（6）打号机：

1台，用于在滤膜及滤袋上打号。

（7）镊子：

1个，用于夹取滤膜。

（8）超细玻璃纤维滤膜：

10片，对0.3μm标准粒子的截留效率不低于99％，在气流速度为0.45m/s时，单张滤膜阻力不大于3.5kPa，在同样气流速度下，抽取经高效过滤器净化的空气5h，1cm2滤膜失重不大于0.012mg。

（9）滤膜袋：

10个，用于存放采样后对折的采尘滤膜，袋面印有编号、采样日期、采样地点、采样人等项栏目。

（10）滤膜保存盒：

1个，用于保存、运送滤膜，保证滤膜在采样前处于平展不受折状态。

（11）恒温恒湿箱：

1台，箱内空气温度要求在15-30℃范围内可调，控温精度±

1℃；

箱内空气相对湿度控制在（50±

5）％，恒温恒湿箱可连续工作。

（12）总悬浮颗粒物大盘天平：

1台，用于大流量采样器滤膜称量，称量范围≥10g，感量1mg，标准差≤2mg。

（13）分析天平：

1台，用于中流量采样滤膜称量，称量范围≥10g，感量0.1mg，标准差≤0.2mg。

四、实验方法和步骤

1.采样器的流量校准

新购置或维修后的采样器在启用前，须进行流量校准。

其校准方法按仪器使用说明书进行。

2.总悬浮颗粒物含量测试

（1）滤膜准备：

①每张滤膜均需用X光看片机进行检查，不得有针孔或任何缺陷。

在选中的滤膜光滑表面的两个对角上打印编号。

滤膜袋上打印同样编号备用。

②将滤膜放在恒温恒湿箱中平衡24h，平衡温度取15-30℃中任一点，记录下平衡温度与湿度。

③在上述平衡长期保持下称量滤膜，大流量采样器滤膜称量精确到1mg，中流量采样器滤膜称量精确到0.1mg。

记录下滤膜质量m0（g）。

④称量好的滤膜平展地放在滤膜保存盒中，采样前不得将滤膜弯曲或折叠。

（2）安放滤膜及采样：

①打开采样头顶盖，取出滤膜夹。

用清洁干布擦去采样头内及滤膜夹上的灰尘。

②将已编号并称量过的滤膜绒面向上，放在滤膜支持网上，放上滤膜夹，对正，拧紧，使不漏气。

安装好采样头顶盖，按照采样器使用使用说明，设置采样时间，即可启动采样。

③样品采完后，打开采样头，用镊子轻轻取下滤膜，采样面向上，将滤膜对折，放入号码相同的滤膜袋中。

取滤膜时，如发现滤膜损坏，或滤膜上尘的边缘轮廓不清晰、滤膜安装歪斜（说明漏气），则本次采样作废，需重新采样（记录表格见附录C）。

（3）尘膜的平衡及称量：

尘膜在恒温恒湿箱中，与二次滤膜平衡条件相同的温度、湿度下，平衡24h。

在上述平衡条件下称量滤膜，大流量采样器滤膜称量精确到1mg，中流量采样器滤膜称量精确到0.1mg。

记录下滤膜质量m1（g）（记录表格见附录D）。

滤膜增重，大流量滤膜不小于100mg，中流量滤膜不小于10mg。

（4）计算：

式中：

t――累积采样时间，min；

QN――采样器平均抽气流量，即式（1-3）或式（1-4）QHN或QMN的计算值；

K――常数，大流量采样器K=1x106,中流量采样器K=1x109。

（5）测试方法的再现性：

当两台总悬浮颗粒物采样器安放位置相距不大于4m，不少于2m时，同时采样测定总悬浮颗粒物含量，相对偏差不大于15％。

五、数据记录与处理

按下表进行。

六、问题分析与讨论

1.大气环境中的TSP的主要污染来源有哪些？

2.大气环境中的TSP有哪些危害？

3.如何预防TSP的污染？

实验四空气中甲醛污染的测定监测

室内空气污染对人体健康的影响最为显著，与大气环境相比有其特殊性。

室内空气污染监测是评价居住环境的一项重要工作。

本实验选择刚装修完和装修已久的不同房间，或者在一个刚装修完房间的不同通风条件下，进行采样分析。

通过本实验达