miRNA的作用机制及功能研究进展Word文档下载推荐.docx

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研究发现，miRNA与siRNA有很多相似之处，但也有很大的不同，二者的区别将在以下文中进行论述。

最近又有文章报道了一种新的小分子RNA的发现[25]——piRNAs（piwi-interactingRNAs）,他们特异地在小鼠的生精细胞中大量表达。

这些RNAs比以前发现的大多数小RNAs较大，约26–31nt（nucleotides），并与Argonaute蛋白家族的Piwi亚枝（Piwi-subclade）成员相联系。

Argonaute蛋白大约100KD，具有PAZ（PiwiArgonautandZwille）和PIWI结构域。

一种小RNA分子引导Argonaute蛋白识别靶分子并介导基因沉默。

Argonaute家族被分为Ago和Piwi两个亚枝。

一般，Ago成员广泛存在并与miRNAs和siRNAs有关，而Piwi成员则限制在种系细胞和干细胞中表达。

克隆的piRNAs在染色体中表现出极不均匀的分布，大多数piRNAs簇集于染色体中相对较小的基因座位，大小约1kb到100kb包含10–4500个小RNAs。

尽管目前对这些RNAs的生物发生和功能还不清楚，但这些发现为小RNA生物学和种系细胞生物学增加了新的内容。

本文将重点论述miRNA的最新研究进展，miRNA自被发现，迅速成为近几年生命科学领域的研究热点。

对它的研究将会对转录后基因调节领域的发展产生深远影响。

miRNA是一类长度约为22nt的小分子非编码单链miRNA，由具有发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体（pre-miRNA）加工而来，能够和互补或部分互补的靶mRNA的3＇末端非翻译区（3′untranslationalregion,3′UTR）结合，使mRNA降解或介导其翻译抑制。

miRNA家族的成员是在研究秀丽线虫的发育转变过程中作为小分子短暂RNA（stRNA）被发现的。

研究发现，miRNA是stRNA中的一个大家族，并且在线虫、果蝇、植物、哺乳动物、甚至病毒中均有发现。

这类小RNA在表达上具有组织和时间的特异性，是调节其他功能基因表达的重要调节分子，在生物体的各种生命活动过程中发挥着重要作用。

1miRNA的发现及命名

早在1993年Lee等[20]利用遗传分析的方法已经在线虫中发现一个22nt的小分子非编码RNA:

lin-4。

Lee等注意到，lin-4或lin-14突变后造成线虫发育差时表型（heterochronicphenotype），在线虫发育早期起作用的lin-4基因的突变使线虫中应该在早期出现的发育事件延迟发生，而lin-14基因的缺失突变却造成了完全相反的结果。

后来证明，这种lin-4基因编码的约22个核苷酸的单链RNA通过不完全互补的方式结合到靶mRNA（targetmRNA）lin-14的3＇末端非翻译区（3′untranslationalregion，3′UTR），短暂下调lin-14蛋白的水平，促使线虫从L1期向L2期的过渡，但并不影响mRNA的水平。

2000年Reinhart等[22]发现了另一个类似的具有转录后调节功能的小分子RNA:

let-7。

第二个miRNAlet-7的发现掀起了寻找miRNA的热潮，拟南芥、线虫、果蝇、小鼠、以及人类等各种生物及病毒中都相继有miRNA的报道,且主要以模式生物为主。

miRNA种类的普遍性及多样性预示着它在生物界中具有更广泛的功能。

miRNA的命名，除最早发现的几种miRNA（如：

lin-4和let-7等）以外，其他发现的都用“miR-#”来表示[12]，“#”为阿拉伯数字（如miR-1，miR-2），对应的基因也用这三个字母后缀加数字命名，具体根据不同物种的命名习惯采用连字符、斜体或大写（如线虫和果蝇中的mir-1，水稻和拟南芥中的MIR-156）。

2miRNA的特征及与siRNA的比较

2.1miRNA的特征

2.1.1结构特征长度为~22nt是miRNA一个最基本的特征,且具有能形成分子内茎环结构的前体。

在动物中,前体的长度一般在70～90nt,而在植物中前体的长度可变性很大,可以从几十到数百nt。

2.1.2miRNA的存在形式miRNA基因常以单拷贝、多拷贝或基因簇等多种形式存在于基因组中,在基因组中有固定的基因座位，70％~90％位于蛋白基因的基因间隔区（intergenicregion,IGR），其余在内含子，还有个别在编码区的互补链，说明它们的转录独立于其他的基因,具有本身的转录调控机制。

最近有研究[21]发现，25%的人类已知miRNA位于蛋白质编码基因的基因内区域（intronicregions），其中大约50%定位于内含子（introns）中,这些miRNA都具有独立的转录单元，可以作用于其主基因（hostgene）的非翻译区（untranslatedregion，UTR）下调其蛋白质编码基因的表达水平，并且还可以作为重要的负反馈调节子。

2.1.3保守性miRNA不仅在结构上保守而且在物种间具有高度的进化保守。

结构上，miRNA在颈部的保守性较强，而环部可以容纳较多的突变位点的存在。

种系上，有些miRNA在一些物种中是高度保守的。

约12％的miRNA在线虫、果蝇、哺乳动物和植物中呈现保守性，经序列比较发现，这些保守片断的碱基差异仅为1~2nt；

miR-1、miR-34、miR-87在非脊椎动物和脊椎动物中高度保守。

在线虫中,发现85%的miRNA在C.briggsaze基因组序列中是有同源物的[18]。

最具有miRNA保守性的是let-7RNA,let-7在C.elegans和人类中完全保守；

大约40％的C.elegans中的miRNA在人类中也是保守的。

线虫C.elegans中的let-7miRNA可以在果蝇基因组,人的第9、11和22条染色体上各找到一个与之完全一致序列,另外在人的第9条染色体上还有一个仅差1个核苷酸的序列[10]。

2.1.4时空特异性目前研究较清楚的lin-4与let-7呈时间特异性表达。

在C.elegans中，lin-4只在幼虫的第一期和第二期存在;

let-7却存在第三、第四期及成虫期,在第一和第二期并不存在；

在拟南芥中，miR157在幼苗中高表达，miR171则在花中高表达[23]。

同时,miRNAs的表达具有组织特异性。

例如，mir-290~mir-295只在鼠胚胎干细胞中表达，而在成体组织主要在胸腺和骨髓中表达[14]。

最近一项研究[28]发现，miRNA靶目标在成熟小鼠和果蝇组织中的表达水平要比在胚胎中低，同时，miRNA更倾向于靶向广泛表达的而不是组织特异性表达的基因，这项结果表明了miRNA广泛地参与胚胎发育及成体组织特性的维持。

2.2miRNA与siRNA的比较

miRNA与siRNA的根本区别是他们来源不同，而二者的作用机制相通。

首先，miRNA与siRNA之间有许多相同之处：

1.二者的长度都约在22nt左右。

2.二者都依赖Dicer酶的加工，是Dicer的产物，所以具有Dicer产物的特点:

5＇端磷酸，3＇端均有2个游离核苷酸。

3.miRNA和siRNA合成都是由双链的RNA或RNA前体形成的。

4.二者都是RISC（RNAinducedsilencingcomplex）组分，都具有组成RISC复合体的Argonaute蛋白家族，其功能界限已变得不清晰，如二者在介导沉默机制上有重叠。

miRNA和siRNA也有区别。

1.根本区别是miRNA是内源的，在基因组中有固定的基因座位；

siRNA可以是人工体外合成的，也可以是基因组的转录片断，降解片断和转座片断，病毒基因组转录片断等，关键在于siRNA没有固定的基因座位，本身不是基因组的功能片断，是随机产生的，即加工位点不是保守的。

2.二者结构上没有本质区别，功能分子都是单链RNA，miRNA转录出来时必然是发夹状的，siRNA可以由完全互补的双链切断而来，也可以从发夹来。

3.本质区别在于作用位点上，miRNA作用于固定的靶基因，有特定的作用位点，一般在靶基因3′-UTR区，而siRNA由于是随机产生的或者人工设计的，因此作用位点可以设计或改变，可作用于mRNA的任何部位。

4.在作用方式上，没有本质区别，是否降解或翻译抑制取决于互补程度，siRNA也可抑制靶标基因的翻译。

5.miRNA的生理功能在于调控发育分化和调亡，适时调节内源基因表达，而siRNA是生物抵抗外来核酸片断入侵的一种方式，原始作用是抑制转座子活性和病毒感染。

miRNA与siRNA的区别总结于表1[2]。

表1miRNA和siRNA的区别

特性miRNAsiRNA

来源内源转录本转基因、病毒RNA

大小约22nt约22nt

前体茎环状的pre-miRNA双链结构的dsRNA

催化酶Drosha、Dicer或类似Dicer

Dicer的酶复合体

RISC复合体含Argonaute蛋白家族含Argonaute蛋白家族

匹配方式不完全互补（动物）或完全互补

完全互补（大多数植物）

作用目标的专一性相对较低高

（特异性）

续表1

特性miRNAsiRNA

作用点蛋白质合成水平转录后水平

靶基因的命运抑制转录或者被降解被降解

功能发育过程中调节抑制转录活性、病毒

内源基因的表达感染、表型遗传

3miRNA的生物发生

目前，关于miRNA的生物发生的研究已经取得较大进展。

动物（尤其是人）miRNA的生物合成过程已经初步得到了诠释。

miRNA的生物发生过程如图1[4]所示。

图1miRNA的生物发生过程

3.1细胞核中miRNA基因的转录与加工

大多数miRNA是由基因间DNA序列编码的,转录方向与相邻的基因往往相反,被认为是与基因表达不同的独立单位。

基因组DNA在RNA聚合酶Ⅱ的作用下产生原始miRNA转录本（primarytranscripts,Pri-miRNA）。

Pri-miRNA在5′端具有甲基化的鸟嘌呤,而3′端具有多聚腺嘌呤碱基。

另外一类miRNA是位于基因的内含子中,并会随着信使RNA（mRNA）转录,包含在mRNA的前体中。

这一类miRNA的转录方向是和对应的mRNA转录方向一致的,因此一般认为此类miRNA的表达和对应的mRNA一样具有组织特异性[11]。

pri-miRNA在一种叫做微处理器的复合体的作用下，剪切为约70个核苷酸长度，一端5＇磷酸，一端3＇端两个悬垂，且具有茎环结构的miRNA前体（precusorofmiRNA,pre-miRNA）。

细胞核中的微处理器在不同的生物体中，所包含的成分不尽相同。

在线虫、果蝇及哺乳动物体内，该复合体至少包含有两种蛋白质成分，分别为Drosha和Pasha（PartnerofDrosha）。

Drosha的主要作用是剪切pri-miRNA形成3＇端2nt悬垂的pre-miRNA，Pasha为dsRNA结合蛋白，参与Drosha对底物的识别[6]。

在人类，Pasha又称为DiGeorge综合征关键区域基因8（DGCR8）。

对DGCR8的研究结果显示,DGCR8是由染色体22q11.2的一个基因编码,对miRNA在发育过程中有重要调节作用。

3.2pre-miRNA的出核转运

在最初的剪切后，pre-miRNA在Ran-GTP依赖的核质/细胞质转运蛋白Exportin5的作用下，从核内运输到细胞质中。

Exportin5与Ran-GTP以及pre-miRNA形成异三聚体，通过核孔到达胞浆，然后，Ran-GTP转变为Ran-GDP，释放pre-miRNA。

3.3细胞质中miRNA的成熟

一旦pre-miRNA被运送到细胞质中,第二种RNA内切酶Ⅲ,称为Dicer（双链RNA专一性RNA内切酶）,对茎环前体一端5＇磷酸，一端3＇端两个悬垂的结构有特殊亲和力，在Dicer进一步的作用下，miRNA前体被剪切成21~25个核苷酸长度的双链miRNA。

起初，成熟miRNA与其互补序列互相结合成所谓miRNA:

miRNA*双螺旋结构（miRNA*是miRNA的互补序列）;

随后，在解旋酶的作用下，双螺旋解旋，其中一条结合到RNA诱导的基因沉默复合物（RNA-inducedsilencingcomplex，RISC）中，形成非对称RISC复合物（asymmetricRISCassembly）。

该复合物会结合到目标靶mRNA上，从而引起靶mRNA的降解或者翻译抑制。

在miRNAmiRNA*双螺旋中，只有其中一条单链可以选择性结合到RISC上去而成为成熟miRNA，然后另一条立即被降解。

尽管从理论上来说成熟miRNA的产生是随机选择的结果，但由于两条链的稳定性有所不同，导致机会的不等。

如图2[3]所示miRNAmiRNA*双螺旋结构中两条链的3＇端均有2个游离核苷酸。

此外，它的两条链是不完全对称的：

miRNA链上靠近5＇端有一个不与miRNA*链相应位置配对的小突起。

这个小突起显著地减弱了miRNA5＇端的稳定性。

由于成熟的miRNA产生总是趋向于选择更不稳定的5＇端，因此miRNA链被选中的机会要大大多于miRNA*链（大约100倍）。

结果往往是双链解开后miRNA链结合到RISC中以做靶识别,而miRNA*则被迅速降解。

这样极度不对称的选择性的好处是，不会因为miRNA*链结合到RISC中的比例过多而显著降低miRNA对翻译的抑制效率[3]。

图2miRNAmiRNA*双螺旋结构示意图

由上可知，miRNA成熟过程中的连续加工，需要至少两种核糖核酸内切酶-Ⅲ（RNAaseⅢ）：

Drosha和Dicer催化，两者都是特定dsRNA的RNA内切酶。

近年来对核糖核酸内切酶-Ⅲ[8]的研究也有了一定进展。

核糖核酸内切酶Ⅲ家族依据其蛋白结构域的组成不同，可以分为3个种类。

第一类包括一个保守的核糖核酸内切酶Ⅲ结构域（RNaseⅢdomain,RⅢD）和一个dsRNA结合结构域（dsRNAbindingdomain,dsRBD），在细菌和酵母中有发现。

如E.coli中的核糖核酸内切酶-Ⅲ。

第一类除了参与rRNA前体的加工成熟过程以外,还参与mRNA、tRNA前体的加工成熟过程。

体内外实验都证明,无论是外源性还是内源性的dsRNA,均可以被机体的核糖核酸内切酶Ⅲ识别并且进行切割,产生约为12~15个核苷酸长度的siRNA。

此siRNA的特点是5＇端有磷酸基团,3＇端有羟基基团,并且3＇端突出2~3个核苷酸长度,5＇端凹陷。

由核糖核酸内切酶Ⅲ产生的siRNA与机体内的一些酶等辅助因子形成蛋白质-RNA复合物,即为RNA引导的沉默复合物（RISC）。

在RISC的指导下,siRNA中的反义链寻找与其同源的mRNA区域,并且在RISC内的核酸内切酶的作用下降解同源mRNA,使相应基因封闭。

第二类包括2个RⅢD（RⅢa和RⅢb）和1个dsRBD，如Drosha及其同源物，仅在动物细胞中有发现。

Drosha定位于细胞核内,可以识别核内的pri-miRNA并将其切割成发夹样结构,约含有70个核苷酸长度的miRNA前体（pre-miRNA）,然后通过转运蛋白exportin-5,结合形成exportin-5、Drosha、pre-miRNA的蛋白-RNA复合物,将pre-miRNA由细胞核转运至细胞质。

第三类如Dicer及其同源物，广泛存在于原核、真核及植物当中,由多个结构域组成，除了有2个RⅢD（RⅢa和RⅢb）和1个dsRBD外，还有1个长的N末端，此末端中含有1个DExHRNA螺旋酶/ATP酶结构域、DUF283结构域和PAZ结构域,这种酶可以和含有PP结构域（PAZPiwidomain,PPD）的蛋白质相互作用。

这种核糖核酸内切酶-Ⅲ在真核细胞内定位于细胞质中,分散地分布于核糖体上,并且参与miRNA的加工成熟过程。

它可以识别具有茎-环样结构约含有70个核苷酸长度的pre-miRNA,并且对其进行切割产生成熟miRNA。

4miRNA的作用机制

miRNA在发挥作用之前，需要同细胞内一些协同因子结合形成蛋白质-RNA复合物（miRNA-containingribonucleoprotin，miRNP），在miRNP的作用下指导其识别同源mRNA。

在Hela细胞裂解液中发现这类核糖核酸蛋白复合物的大小在15S左右，其主要成分为Germin3、Germin4和Argonaute蛋白家族成员eIF2C2因子,后两种蛋白质与运动神经元的存活（survivalofmotorneurons,SMN）有关[10]。

研究认为，miRNP即为RISC.

miRNA与靶mRNA作用的典型方式主要有两种（如图3，图4[16]）：

在大多数情况下（例如在动物中），复合物中的单链miRNA与靶mRNA的3'

UTR不完全互补配对，阻断该基因的翻译过程，从而调节基因表达。

这种方式只影响蛋白表达水平，并不影响mRNA的稳定性。

目前，该翻译抑制的详细机理尚不清楚。

最近有研究对此提出质疑，他们[24]认为，正常衰退途径引起的mRNA降解速度的升高也会导致蛋白质表达水平的下降，且miRNA不仅能作用于翻译起始后的延长阶段，还能够抑制翻译的起始。

被抑制的靶mRNAs和miRNAs共同聚集于胞浆中被称为P-bodies的区域，这个区域还浓缩了许多参与mRNA降解的酶类。

然而，P-bodies可能是作为未翻译mRNA进行暂时的可逆储存的容器，并且，减少一些特定P-body组成蛋白的表达能够缓和miRNA介导的基因表达抑制。

Pbodies[13]是胞浆中的一定区域（如图3），它包含参与多种转录后过程的蛋白质，例如：

mRNA降解（mRNAdegradation）、无义介导mRNA衰退（nonsense-mediatedmRNAdecay,NMD），转录抑制及RNA介导的基因沉默（RNA-mediatedgenesilencing）。

尽管Pbodies不是介导基因沉默所必需的，但阻断siRNA或miRNA基因沉默途径的任何一步都会阻碍P-body的形成，这表明P-body是基因沉默的结果。

因此，尽管P-body成分在mRNA沉默及衰退中起重要作用，但P-body中的这种聚集并不是介导基因沉默机制所必需的，而只能作为他们活动的结果。

图3Pbodies的作用机制

另一种作用方式是，当miRNA与mRNA完全互补配对时，引起目的mRNA在互补区的特异性断裂，从而导致基因沉默，这种作用方式与siRNA类似。

如大多数植物在可读框（ORF）中与它的靶位点几乎完全配对。

这种mi/siRNA介导的基因沉默机制已得到了相关的阐释。

以siRNA参与的RNAi为例进行说明，siRNA可与RISC结合,作为模板识别mRNA靶子，通过碱基互补配对原则，mRNA与siRNA中的反义链结合，置换出正义链。

双链mRNA在Dicer酶、ATP和解旋酶共同作用下产生22nt左右的siRNA，siRNA继续同RISC形成复合体，与siRNA互补的mRNA结合，使mRNA被RNA酶裂解。

这个过程也称为转录后基因沉默（PTGS）。

miRNA以何种方式与目的基因作用和miRNA与目的基因的配对程度有关。

MiRNA与目的基因配对不完全时，miRNA就以抑制目的基因的表达方式作用；

miRNA与目的基因某段序列配对完全时，就可能引起目的基因在互补区断裂而导致基因沉默。

图4miRNA的两种作用机制

这两种作用机制是最早被发现和熟知的，除此之外，近期，PNAS刊载一项最新的发现：

快速脱腺苷酸化（accelerateddeadenylation）是miRNA抑制基因表达的新机制[26]。

Wu等以miR-125b和let-7两种代表性的miRNA为研究对象，在哺乳动物细胞中发现它们能够促进mRNA聚腺苷酸尾巴（polyAtail）的去除。

他们认为miRNA去除聚腺苷酸尾巴的能力不是由于降低翻译水平或需要poly（A）为存在的翻译抑制。

为证明这点，Wu等用3′组蛋白茎-环结构取代聚腺苷酸尾巴，结果发现不但可以消除miR-125b对mRNA含量的影响，还可以降低对蛋白质合成的作用。

由此可知，miRNA通过降低翻译效率和聚腺苷酸化mRNA的浓度来抑制基因表达远比阻遏翻译强而全面，而且，不像翻译阻遏那样导致mRNA的解体是不可逆转。

总之，miRNA与靶mRNA不完全互补后有两种转录后作用机制，除了阻遏翻译外还可引起mRNA快速脱腺苷酸化而被降解以抑制基因表达。

对miRNA作用机制的不断深入研究不仅在理论上丰富了我们对基因调控的认识，miRNA应该具有潜在的多种调节基因表达方式，这还有待于实验技术的进步和人们的进一步发现。

5miRNA的功能及意义

高等真核细胞中，miRNA基因占已知基因的~1%，目前估计哺乳动物细胞中有600多个miRNA，30%的基因要受到miRNA的调节。

miRNA的多样性与进化保守性决定了其在生理生化功能上的重要性与普遍性。

然而只有少数miRNA的已经明确，许多miRNA的功能还尚待深入研究。

表2[1]列出了几种已知功能的miRNA，现在已经认识到这类小分子miRNA在生物体发育、细胞增值与分化、激素分泌、肿瘤形成等过程中扮演者重要角色。

表2已知功能的miRNA

miRNA名称物种生物学功能靶基因

lin-4线虫发育时序调节lin-14,lin-28

let-7线虫发育时序调节lin-41,hbl-1

lsy-6线虫神经细胞化学感受器cog-1

不对称性调节

miR-273线虫神经细胞化学感受器die-1

不对称性调节

miR-165/166拟南芥叶子近轴与离轴细胞的分化PHV/PHB

miR-172拟南芥花朵发育APETALA2（AP2）

Bantam果蝇调节细胞增殖和凋亡hid

miR-14果蝇调节细胞凋亡和脂类代谢caspaseIce?

续表2

miR-15a/哺乳动物B细胞慢性淋巴细胞白血病Bcl-2