构建重组质粒基本方法.doc

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构建重组质粒基本方法

1.cDNA编码区片段的PCR扩增

50ul×2

模版1

5‘引物1

3‘引物1

dNTP1

10×buffer5

Taq1

MilliqH2O40

2．PCR产物纯化

1、加5倍体积的PB

2、将Spin柱放于2ml收集管上

3、加样液，14Krpm，离心1min

4、弃去排出液

5、加0.75mlPE,14Krpm，离心1min

6、弃去排出液,14Krpm,离心1min

7、将Spin柱放在洁净1.5ml的Epp管中

8、往Spin柱的膜中央加入50μl的EB（或milliqH2O）,静置2min,14Krpm，离心1min

3．双酶切

载体和PCR产物分别用一下条件进行双酶切（反应体系均为30ul，37℃，酶切n小时）：

载体

10ul

PCR产物

20ul

10xbuffer

3ul

10xbuffer

3ul

100xBSA

0.3ul

100xBSA

0.3ul

酶1

1ul

酶1

1ul

酶2

1ul

酶2

1ul

MilliQH2O

14.7ul

MilliQH2O

4.7ul

4．双酶切后的载体用试剂盒割胶回收

1.割胶并称重，加3倍体积的QG（胶块每100mg约合100μl的体积）

2.50℃，恒温10min，等到胶完全被溶解

3.将一个Spin柱放在一个2ml的收集管中

4.加样液，14Krpm，离心1min

5.弃去排出液

6.加0.75mlPE,14Krpm，离心1min

7.弃去排出液,14Krpm,离心1min

8.将Spin柱放在洁净1.5ml的Epp管中

9.往Spin柱的膜中央加入50μl的EB（或milliqH2O）,静置2min,14Krpm，离心1min

5．连接

上述双酶切产物经过纯化（其中载体酶切产物割胶回收，PCR片段酶切后纯化步骤与上述PCR产物纯化步骤相同），在T4DNA连接酶作用下16℃连接过夜。

连接体系如下：

载体2ul

PCR片段6ul

10xT4buffer1ul

T4DNAligase1ul

6．转化

取上述连接液5μl转化到预先制备的DH5α化学感受态细胞中，冰浴30分钟，42℃热激2min,置冰上5min，加入1mlLB培养液37℃摇床45min，离心5000rpm，1-5min（不要离心太久，以免太实），最后均匀涂布在含有100ng/ml抗生素的LB平板上（100-150ul）。

将平板在37℃倒置培养过夜。

挑取阳性克隆菌落转划到另一块含有100ng/ml抗生素的LB平板上，并对之进行编号，37℃倒置培养过夜。

7．菌落原位PCR

挑取转划后长出的阳性克隆菌落，加入3ul细菌DNA提取液破细胞。

将细菌裂解液作为PCR模板，其他PCR组分及PCR条件同上。

PCR产物在2%凝胶上进行电泳分析。

8.QIAGEN试剂盒抽提质粒

1）用1.5ml管离心收集细菌，两次，共3ml左右。

2）加入250ul的预冷的P1，打匀后在震荡仪上高速震荡1min。

3）加入250ulP2，温和颠倒数次混匀。

4）（在5min内）加入冰上预冷的溶液N3350ul，迅速温和颠倒混匀，至出现分散的絮状沉淀。

5）冰上静置2min后离心，13，000rpm，10min。

6）小心吸取上清于蓝色的spin柱中（勿吸到沉淀）

7）离心13，000rpm，1min，弃流出液

8）加入750ulPE，离心13，000rpm，1min，弃流出液

9）再离心一次，离心13，000rpm，1min，弃流出液。

以让管内彻底干燥。

10）将spin柱拿出，置于一干净的1.5ml管中，小心的在spin柱中央加入30ulMilliQH2O，或者ElutionBuffer，室温静置2min。

11）离心13，000rpm，1min，收集质粒，测浓度，电泳检测。