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应当注意的是，继代培养时愈伤组织不能硬性分割，因愈伤组织生长时有一个生长核心，一旦破坏，愈伤组织就难以恢复分裂和生长。
因此，在分割愈伤组织时要根据具体情况，顺其自然进行分割，同时，还要选择新鲜健康的愈伤组织进行继代培养。
3.愈伤组织的生长周期
愈伤组织自原来的培养基上转移到新鲜的培养基上3～7天即可恢复生长，随后2～3周内生长达到高峰，愈伤组织细胞分裂处于最活跃时期。
到这一时期结束时，愈伤组织生长开始缓慢下来，此时愈伤组织体积达到最大。
因此，通常在愈伤组织生长达到高峰前进行继代培养，这时愈伤组织中的细胞处于旺盛分裂状态，继代后有利于愈伤组织的恢复生长。
否则，愈伤组织在停止生长较长一段时间后再转移到新鲜的培养基上，较难恢复细胞分裂。
研究表明，24C和弱光有利于愈伤组织的保存。
据报道，大豆细胞系的愈伤组织在这种条件下可以保存15年。
4.拟分生组织
一般认为愈伤组织是无任何组织结构的细胞团，但组织解剖学的研究表明，完全由均一薄壁细胞构成的愈伤组织极少存在。
愈伤组织在分裂期会出现导管细胞、筛管细胞、分泌细胞、毛状体细胞及木栓细胞等，同时还会出现由小而密集分裂细胞构成的细胞团，这些细胞团称为拟分生组织，并在以后的分化中成为形成芽原基及根原基的中心，此时的愈伤组织常呈颗粒状。
三、愈伤组织的继代时间与遗传稳定性和植株再生
愈伤组织经长期继代培养会出现遗传上的不稳定性和变异性，使染色体发生倍性和结构上的改变及分子水平上的变化。
由其诱导产生的再生植株，也会相应产生遗传上与用于培养的原始亲本不同的遗传变异和遗传组成的不一致性。
利用这种特性可进行作物品质改良及次生代谢产物的生产。
有些研究认为，愈伤组织经长期继代培养后会失去再生能力。
到目前为止，多数研究表明，经长期继代培养的愈伤组织仍有再生能力。
愈伤组织遗传上的不稳定性因基因型、外植体、培养基成分和培养时间的不同而异。
同基因型的同一种外植体在不同培养基上会产生不同的变异。
组织培养中涉及到的遗传变异，主要是细胞核组成的改变，且变异不可逆。
这种遗传上的改变包括染色体畸变、细胞核破碎以及由于细胞内复制引起的多倍性和分子水平上的改变等。
培养基成分中外源激素的成分与变异的产生密切相关。
此外，培养时间对变异的产生影响也很大，如烟草和胡萝卜的愈伤组织经几个月继代培养，细胞多倍性水平提高。
但也有例外，经长期继代培养后，愈伤组织细胞的倍性仍保持不变，处于稳定状态，如桉属愈伤组织经3年和10年的继代培养未发现多倍体和非整倍体细胞。
四、胚性与非胚性愈伤组织的特点
不同物种、基因型或外植体在不同培养条件下可以形成不同类型的愈伤组织，有的仅能诱导形成非胚性愈伤组织，而有的在适宜条件下则被诱导形成胚性愈伤组织，二者具有明显的不同特点。
例如，春小麦胚性和非胚性愈伤组织在颜色、表面光滑度、质地、胚性细胞的多少、细胞形态、细胞质和细胞核及核仁上，都表现出很大的差异（见表4.1）。
胚性愈伤组织是体细胞胚胎发生的前提和基础。
表4.1春小麦胚性与非胚性愈伤组织的特点
项目
胚性愈伤组织
非胚性愈伤组织
颜色
淡黄
白色
表面
光滑
粗糙
质地
坚硬但易碎
松散，水渍状
胚性细胞的多少
大量
极少或无
细胞形态
小，圆球形
管状或不规则形状
细胞质
浓厚，染色深
稀薄，染色浅
细胞核及核仁
核明显、大，核仁大
核小，核仁小，或无核
（东北农业大学小麦研究室，明凤，李文雄，曾寒冰，胡尚连等，1994）
第二节愈伤组织的形态建成
一、愈伤组织形态建成的方式
愈伤组织细胞分裂常以无规则方式发生，尽管此时发生细胞分化，但并无器官发生。
只有在适宜的培养条件下，愈伤组织才能进一步分化，进行器官发生，产生苗或芽的分生组织，进而再生植株。
愈伤组织的形态建成主要有以下几种方式（见图4.3）：
图4.3愈伤组织形态建成的主要方式
①通过产生单极性的不定芽，在不定芽的下方长出不定根，同时在二者之间形成维管束组织，进而形成完整植株。
多数植物属这种类型。
②通过产生单极性的不定根，在不定根的上方产生不定芽，并在二者之间分化出维管束组织，形成完整植株。
这种类型在双子叶植物中较常见，而单子叶植物中则少有。
③愈伤组织仅分化出不定根或不定芽，形成无根苗或无
苗根。
④在愈伤组织邻近部位分化出不定根和不定芽，然后两者再结合起来，形成完整植株，根和芽的维管束必须相连，否则植株不能成活（见图4.4）。
丛生苗属此种形成方式，根和芽的连接方式同正常胚胎形成。
⑤通过体细胞胚胎途径再生植株，这也是一种较为常见的
类型。
1—芽开始分化；
2，4—分化出不定芽；
3，7，8—丛生苗；
5—再生小植株；
6，9—再生植株
图4.4小麦愈伤组织形态建成与植株再生
二、具形态建成和不具形态建成能力的愈伤组织
外植体细胞经离体诱导所形成的愈伤组织并不全都具有形态建成的能力。
具有形态建成能力的愈伤组织有一定的形态结构特点。
但具形态建成和不具形态建成能力的愈伤组织之间的差异是相对的，有时通过调控培养条件，尤其是生长调节物质和继代方式，可以调控形态建成，将无形态建成能力的愈伤组织调控成具有形态建成能力的愈伤组织。
如调控不当，也可以使具有较强形态建成能力的愈伤组织变为具形态建成能力较弱的愈伤
组织。
三、愈伤组织诱导、增殖及其形态建成的调控
愈伤组织诱导、增殖及形态建成是一个连续的过程（见图4.5），主要受植物种类、基因型、外植体、培养基和培养环境等因素的调控（见图4.6）。
不定芽
不定根
图4.5小麦幼胚愈伤组织诱导与植株再生示意图
（东北农业大学小麦研究室，李文雄，曾寒冰，1990）
图4.6影响愈伤组织诱导、增殖和形态建成的因素
1.基因型
基因型是离体培养过程中影响愈伤组织的诱导、增殖和形态建成的一个重要因素，同一物种不同基因型作用明显不同。
例如，不同基因型春小麦成熟胚经离体培养后，愈伤组织的出愈率和增殖速度明显不同（见表4.2和表4.3），所有基因型的成熟胚几乎在接种后第2天开始萌动，第4天开始形成愈伤组织，基因型间出愈时间没有差异，但出愈率明显不同。
各基因型的出愈率高低顺序为：
辽10>
东农7742>
Roblin>
东农7757>
新克旱9。
方差分析结果表明，愈伤组织出愈率的基因型效应差异显著（F＝28.67**）。
表4.2不同基因型出愈率
基因型
出愈率
重复1
（％）
重复2
重复3
平均
F值
辽10
94.3
96.8
92.1
94.4
F＝28.67**
东农7742
91.0
89.5
89.7
90.1
Roblin
85.3
87.5
东农7757
85.7
88.2
86.4
86.8
新克旱9
78.2
76.9
78.8
78.0
注：
“**”表示差异显著。
表4.3各基因型愈伤组织生长势分析
继代天数
愈伤组织鲜重（g/单胚）
0d
0.003
0.002
10d
0.033
0.032
0.037
0.030
0.017
20d
0.054
0.049
0.052
0.039
0.028
30d
0.080
0.067
0.069
40d
0.107
0.093
0.034
50d
0.136
0.120
0.079
0.042
60d
0.171
0.149
0.15
0.048
70d
0.213
0.185
0.181
0.056
80d
0.253
0.227
0.219
0.124
0.063
90d
0.312
0.279
0.255
0.144
100d
0.390
0.361
0.329
0.165
0.078
相对生长率
130
120
110
82.5
39
生长势
＋＋＋＋
＋＋＋
＋＋
＋
S形曲线
拟合方程
y＝0.395/
[1＋33.27exp
（－5.48E-02x）]
F＝62.17**
y＝0.364/
[1＋32.16exp
（－0.053x）]
F＝62.33**
y＝0.333/
[1＋26.74exp
F＝53.08**
y＝0.168/
[1＋17.00exp
（－5.23E-02x）]
F＝42.60**
y＝7.96E-02/
[1＋10.33exp
（－4.78E-02x）]
F＝49.43**
“＋＋＋＋”表示强，“＋＋＋”表示较强，“＋＋”表示中度，“＋”表示弱。
从表4.3可以看出，各基因型在接种前单胚重量没有显著的差异（F＝2.15）。
但随着培养时间加长，基因型间单胚发生的愈伤组织鲜重出现明显差异，继代达100天时，各基因型间单胚愈伤组织鲜重差异极为显著（F＝20.94**）。
5个基因型在继代过程中，单胚愈伤组织鲜重虽均为上升趋势，但生长势强弱差异明显（见图4.7），基因型间生长势强弱顺序为东农7757>
东农7742>
Roblin>
新克旱9。
图4.7小麦不同基因型单胚愈伤组织在继代过程中鲜重变化
基因型对离体培养条件反应的差异在以往的报道中多有涉及，离体培养起始材料的选择十分重要。
曾寒冰（1988）对小麦未熟胚离体培养的研究表明，不同基因型差异明显，最终成苗率最少只有9.8%，最高达100%。
基因型是控制愈伤组织形态建成的关键，不同物种外植体诱导的愈伤组织器官分化明显不同，如烟草、胡萝卜、苜蓿等较易发生器官分化，而禾谷类、豆类、棉花等愈伤组织形态建成相对较难。
同属不同种，甚至同一物种不同品种的愈伤组织器官分化的能力也不一样，如高单宁含量的高粱栽培品种8个基因型幼花序外植体诱导的胚性愈伤组织，分化成植株的能力不同，最低者SC0167-14E仅获得11株，IS3150最高，达948株（见表4.4）。
表4.4高粱花序外植体供体基因型及其愈伤组织年龄对其分化成植株的影响
再生植株数
不同年龄的愈伤组织再生植株的数目
40～160/2～4
（天数/继代数）
160～220/5～6
220～310/7～9
IS3150
948
900
33
15
IS8260
599
154
163
282
IS0724
489
322
167
IS6881
516
118
76
IS2830
246
213
IS4225
520
446
73
1
IS8768
290
111
41
138
SC0167-14E
11
4
7
总数
3619
2472
635
512
（引自CaiandButler，1990）
2.外植体
一般而言，分化水平较低的薄壁细胞和处于分裂时期的分生组织细胞较易诱导出愈伤组织。
薄壁细胞分化水平较低，有较大发育的可塑性，进行分裂的潜力可保持很多年，如25年树龄的椴属茎的薄壁细胞仍可诱导形成愈伤组织。
分生组织细胞分裂潜能强，而细胞分裂是脱分化形成愈伤组织的前提。
以不同器官作为外植体诱导的愈伤组织，其器官发生能力因植物而异，有的植物差别不大，如烟草和水稻；
而有的则明显不同，如翅鞘莎，以根、茎和叶为外植体时，愈伤组织的分化带有器官来源的特征，如根外植体的愈伤组织易分化出根。
外植体的生理年龄也影响愈伤组织器官发生的能力，如油菜植株的茎段自下而上进行培养，下部茎段器官形成率较低，而上部茎段形成的愈伤组织，苗分化率则较高（见表4.5）。
表4.5油菜茎不同节位与苗分化的关系（品种23）
部位（由上而下）
分化苗频率（％）
每块苗数
73.3
4.0
2
53.9
2.1
3
22.2
0.5
7.1
0.1
5
0.0
6
（引自颜昌敬，1990）
3.愈伤组织在培养基上保持的时间
大多数物种基因型的愈伤组织经长期继代培养，其再生能力降低，且受遗传因素控制，依不同基因型而异。
但也有例外，有的基因型的植株再生往往出现在愈伤组织多次继代后。
高粱不同基因型幼花序外植体诱导的胚性愈伤组织，随继代时间延长，除IS8260和IS8768仍具有较高植株再生能力外，其他基因型植株再生能力均表现为降低，在继代220～310天内，有的基因型植株再生能力甚至为0（见表4.4）。
4.培养基类型
依培养基配方中含盐量多少可将目前培养基分为四类：
①含盐量较大的培养基，如Murashige和Skoog于1962年设计的MS培养基以及改良的MS培养基，这类培养基含较高浓度的硝酸盐、铵盐和钾盐，微量元素种类很多。
此外，LS（Linsmaier和Skoog，1965）、BL（Brown和Lawrence，1968）、ER（Eriksson，1965）培养基也属于这类培养基。
②硝酸钾含量较高的培养基，如B5（Gamborg等，1968）、N6（朱至清等，1975）、SH（Schenk和Hildebrandt，1972），这类培养基盐浓度也很高，其中
和
由NH4H2PO4提供。
③含盐量中等的培养基，如H培养基（Bourgin和Nitsch，1979），这类培养基中大量元素为MS的1/2，微量元素种类减少，但含量增加，维生素种类比MS多。
在Nitsch培养基中生物素的用量提高10倍。
④低盐浓度的培养基，如White培养基（1943）、WS（Wolter和Skoog，1966）和HE培养基（Heller，1953）。
以上四类培养基中，前两类培养基比较适合愈伤组织诱导和细胞培养，但选用哪一类培养基，应依植物种类、基因型和外植体等而定；
后两类培养基有利于根的形成。
诱导愈伤组织常用的培养基为MS和B5。
高盐浓度的培养基可能对培养过程中愈伤组织数量及鲜重的增加有利。
5.培养基成分
（1）生长调节物质
培养基中生长调节物质对愈伤组织诱导及增殖起重要调节
作用。
①生长素和细胞分裂素。
在愈伤组织诱导、增殖和形态建成过程中，调控幅度最大的是植物生长调节物质，主要调节生长调节物质的种类、浓度和比例，其中生长素和细胞激动素的浓度和配比对外植体愈伤组织的诱导、增殖和形态建成的调控起重要作用。
表4.6表明，各种生长素对同一基因型黄瓜的各种外植体愈伤组织的诱导作用不同，其中2，4-D对愈伤组织的诱导作用优于其他生长素。
大量研究证明，对绝大多数培养物而言，2，4-D是诱导愈伤组织和细胞悬浮培养的最有效物质，常用浓度为0.2～2mg/L。
同时，为促进细胞和组织的生长，还需要加入0.5～2mg/L的细胞激动素（KT）。
提示：
a.2，4-D对禾本科植物愈伤组织诱导及增殖具有特殊作用，如甘蔗在不含有2，4-D培养基中不能诱导形成愈伤组织，而在含有0.5～3.0mg/L的2，4-D培养基上则很快诱导出愈伤组织。
表4.6各种生长素对黄瓜各外植体愈伤组织诱导的效应
（各种生长素浓度为10mol/L）
生长素
愈伤组织形成
种子
下胚轴
果皮
IBA
无愈伤组织形成
愈伤组织增殖强
IBA浓度为100mol/L时愈伤组织生长良好
NAA
所有外植体均
产生愈伤组织
2，4-D
2，4-D浓度为1mol/L
时愈伤组织生长良好
NOA（萘氧乙酸）
愈伤组织增殖中等
NOP（萘氧丙酸）
（引自SekiyaJ,etal，1985）
b.KT对禾本科植物愈伤组织的形成具有抑制作用，即使浓度低至0.47mg/L都能抑制小麦、大麦、水稻及许多牧草的愈伤组织诱导。
c.所有植物生长调节物质的种类、浓度和比例对植物材料愈伤组织诱导、增殖及形态建成的调控作用与植物种类、外植体类型、生理状态及其对生长调节物质的敏感性密切相关。
d.大量研究表明，愈伤组织的诱导、增殖和器官发生及植株再生的基本培养基可相同，但对生长素和细胞激动素的数量和比例以及其他生长调节物质的种类，在愈伤组织的各阶段有不同要求。
一般高浓度生长素和低浓度的KT有利于愈伤组织的诱导和增殖。
e.对双子叶植物而言，外植体愈伤组织的诱导和生长往往需要适当比例的生长素和细胞激动素配合。
如银胶菊（Partheniumargentatum）茎段愈伤组织的诱导、生长及其分化取决于生长素和BA的比例（见表4.7）。
表4.72，4-D和BA浓度对银胶菊茎段愈伤组织生长的影响
处理（2，4-D:
BA）
愈伤组织形成情况
0∶0
仅有，不生长
0∶0.1
有限生长，绿色
0∶0.2
生长不良
0.05∶0
大块、绿色，平均直径10mm
0.05∶1
生长不良，略带褐色
0.05∶2
0.1∶0
大块，绿色至浅褐色
0.1∶0.1
0.1∶0.2
略小于0.1∶0.1比例，变褐
（引自StoutmyeyerandBritt，1970）
f.对愈伤组织形态结构的调控。
在愈伤组织诱导和增殖后，形态结构各异，有的质地松软，有的坚实，它们之间在培养过程中可用生长调节物质进行调控，使其互相转换。
如N6培养基上
2，4-D为1～10mg/L时适合鹅观草、双穗雀稗愈伤组织形成，多数愈伤组织呈松散粒状，具胚胎和器官发生的能力，而在含NAA、IAA、IBA的培养基上愈伤组织诱导较弱，愈伤组织多呈硬块状。
生长调节物质对愈伤组织形态结构的调控，可以通过内源生长调节物质种类和浓度变化及其形态结构的相关性加以反映。
g.对愈伤组织形态建成的调控，植物生长调节剂起重要调节作用。
Skoog和Miller（1951）提出“激素平衡”假说，即高浓度的生长素有利于根的形成，而抑制芽的形成；
反之，高浓度的激动素促进芽的形成，而抑制根的形成。
众多的研究表明，这一观点对组织培养的器官分化，尤其是对双子叶植物仍具有重要的指导意义。
但后来一些研究的结论与之相矛盾，如苜蓿外植体对生长素和细胞分裂素的反应很特殊，在含有2，4-D和细胞分裂素的培养基中，可形成愈伤组织，转入无激素的培养基中则开始器官分化，但芽的分化必须先在含有2，4-D的培养基中培养。
细胞分裂素与生长素的比例高时易生根，反之易生芽。
莴苣在MS培养基上培养，不论生长素与细胞分裂素的比例高（BA/NAA＝2.0mg/L/0.2mg/L）或低（BA/NAA＝0.2mg/L/2.0mg/L）均有利于苗的形成和体细胞胚胎的发生。
②乙烯。
愈伤组织在培养过程中可产生大量乙烯，而且受培养基中生长调节物质的调节。
生长素和细胞分裂素对愈伤组织的某些生理作用可通过乙烯起作用，而外加乙烯对愈伤组织的形态结构和形态建成也具有调节作用。
（2）抗生素物质
研究表明，某些抗生素对一些植物外植体愈伤组织的生长有促进或抑制作用。
①Camus和Lance（19
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