PCR技术的基本操作和应用 1.docx

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PCR技术的基本操作和应用1

PCR技术的基本操作和应用

【基础回顾】 

考点一、PCR原理 

DNA热变性原理，即：

考点二、PCR反应过程 

（1）变性：

当温度上升到90_℃以上时，双链DNA解聚为单链。

（2）复性：

温度下降到55_℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。

　（3）延伸：

温度上升到72℃左右时，溶液中的四种脱氧核苷酸（A、T、C、G）在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。

【技能方法】 

1．细胞内DNA复制与PCR技术的比较 

2．PCR的反应过程 

（1）变性：

当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链，如下图：

（2）复性：

温度下降到50℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合，如下图：

　（3）延伸：

温度上升到72℃左右，溶液中的四种脱氧核苷酸在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链，如下图：

3、PCR扩增易错点 

（1）DNA分子复制的人工控制 

　　解开螺旋：

在80～100℃时，DNA双螺旋打开，形成两条DNA单链，称为变性。

　　恢复螺旋：

在50℃左右时，两条DNA单链重新形成双螺旋结构，称为复性。

　　复制条件：

缓冲液、DNA模板、四种脱氧核苷酸、热稳定DNA聚合酶和两种引物。

　　反应场所：

PCR仪。

（2）PCR技术中的引物：

　①含义：

引物是一小段单链DNA或RNA分子。

　②作用：

为DNA聚合酶提供合成的3′端起点。

　③种类：

扩增一个DNA分子需要2种引物。

　④数目：

引物数目等于新合成的DNA子链数目。

　⑤与DNA母链的关系：

两种引物分别与DNA母链的3′端通过碱基互补配对结合。

【基础达标】 

1．PCR技术控制DNA的解聚与结合是利用DNA的（　　） 

　A.特异性　　　B.稳定性 

　C.热变性　　　D.多样性 

▼

【答案】C 

【解析】 

　　DNA分子在80～100℃的温度范围内变性,双链解开成单链,当温度慢慢降低时,又能重新结合形成双链。

故选C。

2．引物的作用是（　　） 

　A.打开DNA双链 

　B.催化合成DNA子链 

　C.使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始复制 

　D.提供模板 

▼

【答案】C 

【解析】 

　　DNA分子的复制具有方向性，即只能从子链的5′→3′方向进行复制。

当引物与DNA母链结合后，DNA聚合酶就能从引物的3′端开始延伸DNA链。

所谓3′、5′是指脱氧核糖上C原子的位置。

选C。

3．下列关于PCR引物的说法,不正确的是（　　） 

　A.引物是PCR过程中与模板DNA部分序列互补,并能引导模板DNA的互补链合成的核苷酸序列 

　B.引物常根据需要扩增的目标DNA的碱基序列用化学合成的方法获得 

　C.DNA聚合酶只能使DNA链从引物的3′端开始向引物的5′端延伸 

　D.引物的3′端必须具有游离的—OH 

▼

【答案】C 

【解析】 

　　A项正确：

所述是引物的特点和作用； 

　　B项正确：

引物是RNA或单链DNA片段，它能与母链的一段碱基互补配对，因此可根据扩增目标DNA的碱基序列用化学方法合成； 

　　C项错误：

DNA聚合酶使DNA链从引物的5′端向引物的3′端延伸； 

　　D项正确：

DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核酸片段的3′端末端的羟基上，形成磷酸二酯键。

4．下列操作过程的叙述中错误的是（　　） 

　A.PCR反应中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压蒸汽灭菌 

　B.PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份,并在-20℃储存 

　C.PCR所用的缓冲液和酶从冰箱拿出之后,迅速融化 

　D.在微量离心管中添加反应成分时,每吸取一种试剂后,移液器上的吸液枪头都必须更换 

▼

【答案】C 

【解析】 

　　A项正确：

为了防止外源DNA等因素的污染,PCR反应中所用的微量离心管、枪头、缓冲液及蒸馏水等,在使用前要进行高压蒸汽灭菌； 

　　B项正确：

PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份,并在-20℃储存； 

　　C项错误：

在使用前,将PCR所需试剂从冰箱内拿出来,放在冰块上缓慢融化；

　　D项正确：

使用一次性吸液枪头。

5．PCR技术扩增DNA，需要的条件是（　　） 

　①目的基因　　　　②引物 

　③四种脱氧核苷酸　④DNA聚合酶等 

　⑤mRNA　　　　　　⑥核糖体 

　A.②③④⑤　　　B.①②③⑥ 

　C.①②③④　　　D.①③④⑤ 

▼

【答案】C 

【解析】 

　　PCR技术需要目的基因作为扩增的模板，DNA聚合酶催化反应的进行，而引物是满足DNA聚合酶起作用的需要，四种脱氧核苷酸是该过程的原料。

故选C。

【能力提升】 

1．多聚酶链式反应（PCR技术）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法,由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期,循环进行,使目的DNA得以迅速扩增，其简要过程如图所示。

下列关于PCR技术叙述不正确的是（　　） 

　A.PCR技术是在实验室中以少量DNA制备大量DNA的技术 

　B.反应中新合成的DNA不能作为下一轮反应的模板 

　C.PCR技术中以脱氧核糖核苷酸为原料,以指数方式扩增 

　D.应用PCR技术与探针杂交技术可以检测基因突变 

▼

【答案】B 

【解析】 

　　A项正确：

PCR技术是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术； 

　　B项错误：

PCR技术需要模板DNA，且反应中新合成的DNA又可以作为下一轮复制的模板； 

　　C项正确：

PCR的原理就是DNA的复制，原料是脱氧核糖核苷酸，PCR技术使DNA以指数的方式扩增，即约2n； 

　　D项正确：

应用PCR技术与探针杂交技术可以检测基因突变。

2．DNA扩增过程中DNA片段经若干次扩增，其数目理论值变化应与下图中曲线相符的是（　　） 

▼

【答案】C 

【解析】 

　　DNA在扩增过程中呈指数式增长，即一个DNA分子连续扩增n次，理论上所产生的DNA分子数为2n个。

故选C。

3．PCR仪实质上是一台自动调控温度的仪器，它调控不同温度的目的是（　　）

　①95℃，使DNA分子变性，失去生物活性 

　②95℃，使DNA分子变性，解开螺旋 

　③55℃，使DNA分子开始复制、延伸 

　④55℃，使DNA分子恢复双螺旋结构，恢复活性 

　⑤72℃，使DNA分子开始复制、延伸 

　⑥72℃，使DNA分子恢复双螺旋结构，恢复活性 

　A.①③⑤　　　B.②③⑤ 

　C.②④⑤　　　D.②④⑥ 

▼

【答案】C 

【解析】 

　　PCR利用了DNA的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解旋与结合。

PCR仪实质上是一台能够自动调控温度的仪器。

①错误②正确：

当温度上升至95℃时，DNA分子变性，解开双螺旋结构；③错误④正确：

温度下降到50℃左右（55℃），引物与DNA单链结合，DNA恢复双螺旋结构，恢复活性；⑤正确⑥错误：

温度上升至72℃，DNA分子开始复制、延伸，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。

故选C。

4．PCR技术又称聚合酶链式反应，现在已成为分子生物学实验室的一种常规手段，它可以在体外很短的时间内将DNA大量扩增。

你认为下列符合在体外进行PCR反应条件的一组是（　　） 

　①稳定的缓冲液环境　　　②DNA模板 

　③合成引物　　　　　　　④四种脱氧核苷酸 

　⑤DNA聚合酶　　　　　　⑥DNA解旋酶 

　⑦限制性核酸内切酶　　　⑧温控设备 

　A.①②③④⑤⑥　　　B.①②③④⑤⑥⑦⑧ 

　C.③④⑤⑥⑧　　　　D.①②③④⑤⑧ 

▼

【答案】D 

【解析】 

　　在PCR技术中，需要的条件有模板、引物、脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶，此外还需要适宜的温度和pH（即稳定的缓冲液环境），故选D。

5．从2001年初到现在，青岛某实验基地已孕育出上百只转基因克隆羊，它们的体内分别携带包括β—干扰素、抗凝血酶素、乙肝表面抗原在内的多种药用蛋白基因。

这意味着，它们可以通过产奶的方式源源不断地提供药用蛋白基因，其应用前景非常光明。

在其实验研究过程中，经常利用PCR技术制取大量的有关药用蛋白基因来供实验用。

下列有关PCR技术的叙述中，不合理的是（　　） 

　A.PCR扩增反应中加人引物的作用是结合在模板DNA上，提供DNA延伸起始位点 

　B.DNA聚合酶的作用是从引物的5'端开始催化DNA链的延伸。

　C.PCR技术依据是DNA的热变性原理 

　D.PCR的反应过程一般经历三十多个循环，每次循环都包括变性、复性、延伸 

▼

【答案】B 

【解析】 

　　在PCR中引物能结合在模板DNA上，提供DNA延伸起始位点，故A正确；DNA聚合酶的作用是从3'端开始催化DNA链的延伸，故B错；PCR技术的依据是DNA的热变性原理，每次循环包括变性、复性和延伸，故CD均正确。

【终极闯关】 

1．（2015届江苏省四市调研）利用PCR技术将某小段DNA分子扩增n代，需（双选）（　　） 

　A.测定DNA分子两端的核苷酸序列，以便设计引物对 

　B.2n－1对引物参与子代DNA分子的合成 

　C.向反应体系中加入解旋酶、DNA聚合酶等 

　D.保持反应体系温度恒定，确保扩增的正常进行 

▼

【答案】AB 

利用PCR技术将某小段DNA分子扩增，必需测定DNA分子两端的核苷酸序列，以便设计引物对，才能按照碱基互补配对原则合成子链，A正确；DNA分子扩增n代以后，共合成了2n个DNA分子片段，除起始的两条模板链以外，其它链上都含有引物，所以共有2n－1对引物参与子代DNA分子的合成，B正确；PCR过程中利用高温解旋，不需要向反应体系中加入解旋酶，C错误；PCR包括三个阶段，即高温解旋、低温复性、中温延伸，所以反应体系温度不恒定，D错误。

2．（2015届安徽省蚌埠市高三检测）下列有关生物工程与技术的叙述不正确的是（　　） 

　A．PCR技术可用于目的基因的获取 

　B．选择单核居中期向单核靠边期过渡的花粉进行离体培养成功率高 

　C．在以尿素为唯一碳源的培养基上长出的菌落一定是尿素分解菌 

　D．“三北防护林”建设中，应遵循协调与平衡原理和物种多样性原理 

▼

【答案】C 

【解析】 

　　PCR可以用于外源目的基因的大量扩增，故A正确。

在花粉选择进行离体培养时应选择单核靠边期的成功率高，故B正确。

在以尿素为唯一碳源的培养基上长出的菌落有可能是尿素分解菌也有可能是以氮气为主的细菌，还要加入酚红指示剂进行鉴别，故C错误。

“三北防护林”建设中，应遵循协调与平衡和物种多样性原理，故D正确。

3．（2015届江苏省高三下学期第二次统考）如图表示细胞内DNA复制和细胞外PCR扩增两个过程,两反应过程的条件中相同的是（　　） 

　A.模板　　　B.原料 

　C.酶　　　　D.能量供应 

▼

【答案】B 

【解析】 

　　选项A模板不同,胞内DNA复制以整个DNA分子作为模板,PCR扩增却以一段目的DNA作为模板。

选项B原料相同,均以4种脱氧核苷酸为原料。

选项C酶不相同,胞内DNA解旋需要解旋酶,延伸需要DNA聚合酶等;胞外PCR扩增通过高温解旋而不需要解旋酶,延伸只需热稳定的Taq酶。

选项D能量供应不同,胞内DNA复制过程由ATP提供能量,而PCR扩增主要由外界供能。

4．（2015届江苏省扬州市高三月考）在PCR扩增DNA的实验中，预计一分子DNA经过30次循环后，应该得到230个DNA分子，但是结果只有约210个DNA分子，那么不是出现该现象的原因是（　　） 

　A．TaqDNA聚合酶的活力不够，或活性受到抑制 

　B．系统设计欠妥 

　C．循环次数不够 

　D．引物不能与亲链结合 

▼

【答案】D 

【解析】 

　　PCR扩增没有得到应有的DNA分子数，有可能是TaqDNA聚合酶活性不够或活性受抑制，可能形成的DNA少，故A正确。

系统设计欠妥会导致达不到预期的结果，故B正确。

循环次数不够会出现子代DNA分子数少，故C正确。

引物与亲链不能结合的情况下不会出现子代，而不是少，故D错误。

5.（2013江苏卷•22）小鼠杂交瘤细胞表达的单克隆抗体用于人体试验时易引起过敏反应，为了克服这个缺陷，可选择性扩增抗体的可变区基因（目的基因）后再重组表达。

下列相关叙述正确的是（双选）（　　） 

　A.设计扩增目的基因的引物时不必考虑表达载体的序列 

　B.用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列 

　C.PCR体系中一定要添加从受体细胞中提取的DNA聚合酶 

　D.一定要根据目的基因编码产物的特性选择合适的受体细胞 

▼

【答案】BD 

【解析】 

　　设计引物时应当与表达载体两端的序列进行互补配对A错误； 

　　PCR法扩增目的基因只需要知道基因两端的序列设计合适的引物即可，而不必知道其全部序列，B正确； 

　　PCR中应用耐高温的DNA聚合酶C错误； 

　　根据目的基因的编码产物选择合适的受体细胞，以有利于基因的表达，D正确，因此答案为BD。