基于新型纳米材料的电化学免疫传感器及其在食品安全检测中的应用Word下载.docx
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1电化学免疫传感器的原理
根据2001年国际纯粹与应用化学联合会
（InternationalUnionofPureandAppliedChem-
istry,IUPAC的定义,电化学生物传感器是一个独
立的集成器件,通过生物识别元件进行定量或半定量的特异性分析。
它是一种能够连续和可逆地感受化学量和生物量的装置,主要由接受器、换能器和电子线路3部分组成[1]。
1990年Henry等[2]提出了免疫传感器的概念,根据换能器将其划分为:
电化学免疫传感器、质量检测免疫传感器、光学免疫传感器和热量检测免疫传感器等。
其中,电化学免疫传感器原理是基于抗体-抗原相互作用影响电极或缓冲液的电性,可以通过测量由免疫反应而引起的电势、电流、电导或阻抗变化来确定目标的含量。
主要包括电位型[3]、电流型[4]和阻抗型免疫传感器[5]。
食品中污染物大都是通过间接竞争法来实现检测,以微囊藻毒素的检测为例（图1,首先在玻碳电极表面修饰一层碳纳米角来增强电极表面电子传递,然后通过活泼酯的方法活化碳纳米角来固定一定数量的微囊藻毒素,而后同时在修饰电极表面滴加酶标抗体和样品液,结果就是和样品液中微囊藻毒素结合的抗体“离开”电极表
收稿日期:
2014-11-27
基金项目:
国家“973”课题（2012CB720803;
广东省自然
科学基金研究团队项目（S2013030013338;
广州市珠江科技新星项目（2014J2200043
作者简介:
董秀秀,女,1991出生,硕士生通讯作者:
孙远明
Vol.15No.4Apr.2015
JournalofChineseInstituteofFoodScienceandTechnology
中国食品学报
第15卷
第4期
2015年4月
第15卷第4期面,与电极表面上微囊藻毒素结合的抗体“存在”电极表面,进而通过检测峰电流的变化来判断样品液中微囊藻毒素的含量。
电化学免疫传感器重要元件的制备
2.1
抗体的制备与标记
高质量的抗体是免疫分析的核心材料。
第1
代抗体多克隆抗体和第2代抗体单克隆抗体是目前应用在免疫分析中最常见的抗体。
然而,多克隆抗体和单克隆抗体的性能受限于半抗原结构以及
动物免疫过程,常常难以满足实际检测需求。
基因工程抗体是继多克隆抗体和单克隆抗体之后的第
3代抗体,可以在单克隆细胞株的基础上进行基
因扩增与拼接获得,也可以通过抗体库的筛选获得,其最大的特点之一就是可以通过宿主菌表达制备,保证抗体质量的稳定性[7],其次是由于抗体序列易于获得,可以在分子水平对抗体进行改造,以提高抗体性能[8],因此越来越受到研究者的青睐
（图2a。
此外,一些具有特殊功能的抗体也逐渐被用于免疫检测,例如通过杂交-杂交瘤制备的双特异性抗体,可以同时检测2个以上对象[9]（图
2b;
来源于骆驼或鲨鱼的只有重链没有轻链的纳
米抗体,具有分子质量小,可操作性高,稳定性好等优点,也被逐渐应用于免疫分析领域[10]（图2c;
通过化学合成手段将模板分子与一些特殊功能单体进行合成而制备的“塑料抗体”[11],也被称为“仿生抗体”,具有刚性、柔韧性、力学性能、热稳定性、亲和位点可接近等特点[12],这种抗体适合竞争和非竞争两种模式对目标分析物进行免疫检测（图
2d。
作为分子印迹聚合物,它具有受理化因素干
扰小,灵敏度高,制备简单,低成本等优势,近年来多用于生物传感器进行痕量检测[11,13-14]
。
图1
微囊藻毒素免疫传感器制备和检测原理图[6]
Fig.1Schematicrepresentationofthepreparationand
detectionprocedureofMC-LRimmunosensor[6]
（a基因工程抗体（b杂交杂交瘤抗体
（c重链抗体（d分子印迹聚合物
图2抗体制备原理图
Fig.2Aschematicrepresentationofdifferenttypeofantibody
电化学免疫生物传感器的构造,另一重点在于电极表面生物膜的修饰和抗体的标记。
目标分
析物是像大肠杆菌等大分子,通常会选择夹心法固定抗体在电极表面,那么电极生物膜的构造（即
基于新型纳米材料的电化学免疫传感器及其在食品安全检测中的应用进展
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2015年第4期
抗体的固定化是非常重要的步骤。
而食品中的污染物大都是像三聚氰胺、瘦肉精、雌激素等小分子,通常是通过间接竞争法来进行检测,为了提高检测灵敏度,还需要进一步对抗体进行标记。
目前研究者大都是通过化学方法对抗体标记（图3a。
Freitas等[15]利用镉标记抗体进行信号放大制备电
流型免疫传感器对牛奶中的沙门氏菌进行检测,检测限可达到13cells/mL。
Sun等[16]用DHC-
NTs@PDOP和辣根过氧化酶同时标记抗体对溴联苯进行检测,检测限可以达到2.25pmol/L。
采用化
学法对抗体进行标记虽具有简便、快速、低成本等特点,但是受限于方法本身及人为操作的影响,不同批次标记抗体性能往往不尽相同,导致所建立
的传感器方法稳定性受影响。
此外,化学标记可能对抗体活性产生影响,导致抗体应用性能下降。
近年来,随着分子生物学技术的飞速发展,在分子水平将抗体活性片段与标记物特征片段（如碱性磷酸酶活性片段进行融合表达,可以制备性能均一,稳定且可大量表达的抗体标记产物（图3b。
例如,Xu等[17]将有机磷农药多特异性抗体片段与碱性磷酸酶（AP抗体片段进行融合表达,制备获得了同时具有抗体活性和AP酶活性的标记产物。
通过生物法对抗体进行标记,具有准确性高,稳定性好,适合批量生产等优点,应用于生物传感器具有很大前景
（a化学法标记抗体（b生物法标记抗体[17]
图3抗体标记原理图
Fig.3Schematicrepresentationofdifferenttypeoflabeledantibody
2.2新型纳米材料的制备
在传感器的构建中,为了提高灵敏度,往往会
使用纳米材料进行信号放大。
纳米技术主要是针对尺度为1~100nm之间的分子世界的一门技术。
纳米材料是指三维空间尺寸至少有一维处于纳米级（通常为1~100nm的材料。
纳米材料具有表面效应、小尺寸效应、量子效应和宏观量子隧道效应,表现出一系列独特的力学、电学、光学、磁学以及催化性能,被誉为“21世纪最有前途的材料”[18]。
功能化的纳米复合材料不但有各种协同作用,如催化活性、导电性和生物相容性来加速信号传导,还可以提供高载的信号标签来放大识别过程。
此外,纳米材料可以结合生物传感器进行生物分子中的单分子检测[19]。
2.2.1单组分纳米材料碳纳米管是一维纳米材
料,具有完整分子结构的新型碳材料。
它是由碳原子形成的石墨片卷曲而成的无缝、中空的管体。
根
据石墨片的层数不同可分为单壁碳纳米管和多壁碳纳米管[20]。
一些未经功能化的纳米材料并不适合直接应用于传感器,而羧基化碳纳米管修饰的电极不仅利于酶的固定,而且可以加速酶与电极间电子传递。
Sotiropoulou等[21]选用羧基化碳纳米管修饰的铂电极检测葡萄糖,检测限可以达到
0.19nM/L,而且所制备的电极在4℃缓冲液中浸泡24h后,仍有较高的灵敏度。
氮化的碳纳米管
具有更低的细胞毒性和更好的生物相容性,使得它们更适合免疫传感器。
Zhang等[22]等将氮化的碳纳米管-纳米金复合物来固定抗体制备免疫传感器检测微囊藻毒素,检测限可以达到0.002μg/L,远远低于世界卫生组织制定的要求。
石墨烯只有一层原子,其电子密度和导电性很容易被外加电压控制,是目前最理想的二维纳米材料。
功能化的石墨烯可以增大表面积来吸附固定更多的蛋白,从而放大信号。
Du等[23]将功能化
138
第15卷第4期氧化石墨烯和多酶标记结合进行双重放大信号检测磷酸化的蛋白（Phosphorylatedp53,与传统电化学免疫传感器相比,检测限降低10倍。
不过,由于共轭网络受到严重的官能化,氧化石墨烯薄片导电性并不是很好。
而还原型的氧化石墨烯不仅表面积大,而且具有优良的电化学性质。
Srivastava等[24]在电极表面沉积还原型氧化石墨烯制备免疫传感器对食品中的黄曲霉毒素进行检测,检测限可以达到0.12ng/mL。
纳米金、纳米银和四氧化三铁等纳米颗粒,是零维纳米材料[25]。
Sun等[26]电沉积纳米金晶体于金电极表面对果蔬中克百威进行检测,检测限可以达到0.06ng/mL。
Jin等[27]在玻碳电极表面自组装壳聚糖-纳米金复合膜制备阻抗型免疫传感器对食品中氨基脲进行检测,检测可以达到1.0ng/
mL。
Regiart等[28]在丝网印刷电极表面电沉积一层
纳米金颗粒对牛毛发中的克伦特罗进行检测,检测限可以达到0.008ng/mL
图4（a碳纳米角的透射电镜图[6];
（bZnO纳米棒的扫描电镜图[29]
Fig.4Transmissionelectronmicroscopy（TEMimageofaSingle-walledcarbonnanohorns[6]
andScanningelectronmicroscopy（SEMimageofbZnONanorods[29]
（a（b
除此之外,还有一些单组分纳米材料可以应用于电化学传感器,像碳纳米角、ZnO等。
碳纳米角具有不规则结构,如图4a所示,具有优于单壁碳纳米管的电化学特性。
Zhang等[6]用碳纳米角修饰的玻碳电极对微囊藻毒素进行检测,检测限可达0.03μg/L。
而ZnO纳米棒,如图4（b所示,具有比表面积大,生物相容性好,无毒,成本低,易合成等优良特性,非常适合用来固定蛋白类物质,例如酶、DNA、抗体等,近年来得到很多研究者的关注。
2.2.2纳米合金不同单组分纳米金属的性能存
在差异,将两种或多种纳米金属（尤其是贵金属与非贵金属通过二次凝聚可以生成更优良的复合物来修饰电极进行信号放大,从而优化传感器的性能。
双金属纳米粒子,也称为“纳米合金”。
由于协同作用,合金极大地提升了金属的某些性能,使其在电子、催化等方面具有很大的应用前景,已成为近几年来纳米材料领域的研究重点[30,31]。
Zhang等[32]
利用氧化金核铜壳纳米颗粒标记抗体修饰氧化铟硒电极制备电化学免疫传感器对大肠杆菌进行检测,检测限可达到30CFU/mL。
Freitas等[15]利用磁性Fe@Au纳米粒子修饰电极表面,并用镉标记抗体,进行信号放大制备电流型免疫传感器对牛奶中的沙门氏菌进行检测,检测限可达到13cells/
Jamali等[33]用铂-钴纳米合金修饰碳糊电极对食品中的维生素B9进行检测,检测限可以达到4.0×
10-8mol/L。
另外,Zhao等[35]利用Au@Pd纳米晶体,标记
抗体制备非酶电化学免疫传感器对甲胎蛋白进行检测,检测限可以达到0.005ng/mL（图5a。
而
Pd@Pt纳米晶体,如图5b所示,目前还没有广泛
地应用于生物传感器中。
类似这种有着非常好的电化学性能新型纳米材料很适合应用于生物传感器,虽然目前在制备上存在一些难题,但是随着科技的不断进步,在不远的将来,其必将应用于生物传感器并发挥巨大优势。
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2015年第4
期
（aAu@Pd（bPd,Pd@Pt
图5纳米晶体透射电镜图[34]
Fig.5TEMimagesofnanocrystal
2.2.3聚合物基纳米复合材料聚合物基纳米复合材料是一种以高聚物为基体,与金属、无机非金属以及有机物纳米粒子等进行复合而得到的材料。
这种复合材料既拥有高聚物本身的优点,又兼备了纳米粒子的特异属性,在力学、催化、功能材料（光、电、磁、敏感等领域内得到应用,有着广阔的发展前景[36]。
聚合物纳米复合材料可分为聚合物/无机物纳米复合材料和聚合物/聚合物纳米复合材料,其中聚合物/无机物纳米复合材料在传感器中应用广泛。
Cai等[37]利用二氧化铈-壳聚糖纳
米复合材料修饰玻碳电极制备电化学免疫传感器检测牛奶、蜂蜜、鸡蛋等中的磺胺喹恶啉,检测限可以达到3.25×
10-7mg/mL。
Zang等[38]利用聚吡咯-纳米金簇修饰玻碳电极制备电化学免疫传感器检测氧氟沙星,检测限可以达到0.03ng/mL。
Dong等[39]将纳米金颗粒/聚氨基树脂-多壁碳纳米管-壳聚糖复合材料修饰玻碳电极制备阻抗型免疫传感器检测牛奶中的沙门氏菌,检测限可以达到5.0×
102CFU/mL。
该生物传感器的制备过程,如图6所
示
图6一种阻抗型免疫传感器的制备流程图[39]
Fig.6Schematicprocessesoftheimmunosensorfabricationprocess[39]
3电化学免疫传感器在食品安全检测中的应用
由于不同蛋白质的等电点不同,因而发生免疫反应前后电极表面上所带电荷的极性和密度会
发生相应变化,使电极电位发生变化。
Ercole等[40]利用电位型传感器检测食品中的大肠杆菌,检测限可以达到10cells/mL。
虽然电位型免疫传感器可以像离子选择性电极一样,无需外加试剂,无需
140
第15卷第4期
目标分析物
抗体
纳米材料电极检测限样品传感器类型
参考
文献
农药
对氧磷单克隆抗体碳纳米管玻碳电极2ng/mL
-电流型
[51]
甲基毒死蜱酶标抗体
纳米铂/SiO2粒子丝网印刷电极
22.6ng/L
-
电流型
[52]
啶虫脒核酸适配体
纳米金颗粒
金电极1nmol/L
废水,番茄
阻抗型
[53]
西维因分子印迹聚合物壳聚糖-纳米金铂合金/石墨烯-纳米金
玻碳电极8.0nmol/L
卷心菜,苹果皮等
[14]
氨基脲单克隆抗体纳米金-壳聚糖复合物玻碳电极
1.0ng/mL
肉松,蜂蜜等
[27]
抗生素
氯霉素单克隆抗体纳米金颗粒
金电极1.0×
10-16mol/L
虾
[54]
链霉素单克隆抗体
纳米金-二氧化硅
玻碳电极
5pg/mL
蜂蜜,牛奶等电流型
[55]
氧氟沙星单克隆抗体聚吡咯-纳米金簇/纳米金棒
0.03ng/mL
电流型/阻抗型
[38]
四环素核酸适配体
—
金电极
牛奶
[56]
毒素
葡萄球菌B型肠毒素多克隆抗体
磁性纳米粒子
0.017ng/mL
[57]
微囊藻毒素酶标多克隆抗体
碳纳米角
0.03μg/L
[6]
黄曲霉毒素B1酶标单克隆抗体
纳米金颗粒/多功能纳米磁珠
氧化铟锡电极
6.0pg/mL
[58]
赭曲毒素A单克隆抗体
纳米金/胶体金
丝网印刷电极
0.10ng/mL
小麦
[59]
赭曲霉素A核酸适配体
纳米金颗粒-石墨烯
0.3pg/mL
[60]
致病菌大肠杆菌O157:
H7多克隆抗体磁性Fe3O4
叉指阵列微电极8.0×
105CFU/mL
牛肉
[61]
大肠杆菌O157:
H7单克隆抗体
50CFU/strip
[62]
沙门氏菌单克隆抗体
磁性Fe@Au纳米粒子
13cells/mL
[15]
激素
炔诺酮多克隆抗体
石墨烯/纳米金/介孔SiO2粒子玻碳电极
3.58pg/mL
鸡肝
[63]
双酚A分子印迹聚合物
多壁碳纳米管
碳糊电极
0.022μmol/L
水样
[13]
雌二醇多克隆抗体
0.25pg/mL
[64]
雌二醇适配体
二硫化钨和纳米金复合物
2.0×
10-12mol/L
[65]
其他
克伦特罗单克隆抗体
0.32ng/mL
动物饲料
[66]
克伦特罗单克隆抗体多壁碳纳米管
[67]
酪蛋白多克隆抗体纳米金颗粒/聚精氨酸-多壁碳纳米金/多壁碳纳米管
5×
10-8g/mL
奶酪
[68]
人免疫球蛋白多克隆抗体纳米铂颗粒玻碳电极
2.0pg/mL
-电位型
[69]
表1部分电化学免疫传感器在食品安全检测领域中的应用
Table1
Examplesoftheapplicationofelectrochemicalimmunosensorinthefieldoffoodsafety
141
中国食品学报2015年第4期
对抗体（或抗原进行酶标记,可直接对抗体（或抗原进行快速检测,仪器简单,成本低廉,易于实现微型化,但是早期的研究[
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