细胞实验技术新1Word文件下载.docx

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是将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质沉淀。

由于不同的蛋白质其溶解度与等电点不同，沉淀时所需的pH值与离子强度也不相同，改变盐的浓度与溶液的pH值，可将混合液中的蛋白质分批盐析分开，这种分离蛋白质的方法称为分段盐析法（fractionalsaltingout）。

摩尔吸光系数：

物质对某波长的光的吸收能力的量度。

指一定波长时，溶液的浓度为1mol/L，光程为1cm时的吸光度值，用ε或EM表示。

ε越大，表明该溶液吸收光的能力越强，相应的分光度法测定的灵敏度就越高。

预杂交及其作用：

预杂交（Prehybridizaiton）是减低背景染色的一种有效手段。

预杂交液和杂交液的区别在于前者不含探针和硫酸葡聚糖（Dextransulphate）。

将组织切片浸入预杂交液中可达到封闭非特异性杂交点的目的，从而减低背景染色。

细胞系（cellline）:

原代培养细胞成功传代即为细胞系。

细胞株（cellstrain）:

从培养细胞中筛选出的具有特定性质或标志的细胞群。

流式细胞术（FlowCytometry,FCM）：

利用流式细胞仪对处于快速流动的细胞或生物颗粒进行多参数、快速（每秒可达1000-10000个）的定量分析和分选（纯度可达99%以上）的技术。

二、问答题

1.什么是柯勒照明？

简述柯勒照明的方法与步骤。

柯勒照明：

光源经集光器将视场光阑像呈到标本平面上，灯丝成像于孔径光阑。

柯勒照明五步走：

1将目镜屈光度调节环放置零位。

2用10X物镜将标本调焦清晰。

3把灯丝成像于聚光镜孔径光阑的下表面上。

4收小视场光阑。

5通过聚光镜调节旋钮将视场光阑调清晰，使用对中旋钮将视场光阑对中。

6放大视场光阑至外切于视野位置

7取下目镜，检查物镜的后焦面处光是否均匀。

缩小孔径光阑，直到其出现在物镜后焦面上。

调整孔径光阑，使它的直径为物镜后焦面直径的7／8。

放回目镜，检查成像质量。

8为了得到合适的对比度及景深，需要调节孔径光阑。

8在更换过物镜以后，需要调整视场光阑（控制照明区域），以及孔径光阑

2.试述一般光学显微镜的基本构造。

系统构成：

①照明系统②光学放大系统③机械装置

目镜（放大物象）镜筒（连接目镜与物镜）转换器（调换物镜）粗准焦螺旋（升降镜筒）细准焦螺旋（升降镜筒）镜臂（连接）镜柱（支持）物镜（放大物象）载物台（放置玻片）通光孔（光线通过）压片夹（固定玻片）反光镜（反射光线）

3.电子显微镜与光学显微镜主要的区别：

①照明源不同。

电镜所用的照明源是电子枪发出的电子流，而光镜的照明源是可见光（日光或灯光），由于电子流的波长远短于光波波长，故电镜的放大及分辨率显著地高于光镜。

②透镜不同。

电镜中起放大作用的物镜是电磁透镜（能在中央部位产生磁场的环形电磁线圈），而光镜的物镜则是玻璃磨制而成的光学透镜。

电镜中的电磁透镜共有三组，分别与光镜中聚光镜、物镜和目镜的功能相当。

③成像原理不同。

在电镜中，作用于被检样品的电子束经电磁透镜放大后打到荧光屏上成像或作用于感光胶片成像。

而光镜中样品的物像以亮度差呈现。

④所用标本制备方式不同。

电镜观察所用组织细胞标本为超薄切片。

而光镜观察的标本为一般载玻片上，如普通组织切片标本、细胞涂片标本、组织压片标本和细胞滴片标本等。

4.如何在石蜡切片中显示细胞中的糖类、蛋白质、核酸等物质？

糖类：

固定→石蜡切片→脱蜡→过碘酸酒精液中氧化→水洗→Schiff试剂染色→亚硫酸水洗→苏木精染色→自来水分色→脱水→透明→封片→观察。

结果：

动物细胞中的糖元呈紫色颗粒状。

DNA：

卡诺固定液→石蜡切片→复水→Schiff染色→亚硫酸水洗→1%亮绿复染→脱水→二甲苯透明→封片→观察,结果：

DNA呈紫红色，细胞质呈绿色。

蛋白：

取材固定（4℃冷丙酮冰箱中）→石蜡切片→脱蜡→复水→蛋白作用液（pH=5）1-2hr.→水洗→2%醋酸→水洗→1%硫化铵→水洗→脱水→透明→封片→观察。

依其在细胞中的含量多少呈现黄棕色至棕黑色不等。

5.冰冻蚀刻技术制备电子显微镜标本的基本过程。

标本置于干冰或液氮中冰冻→升温至-100℃→切割→升温→断面喷涂铂-碳膜→铂-碳膜（复型膜）→铜网→观察。

优点：

不经固定、脱水、包埋，有利于保持天然特征。

尤其适于显示各类膜结构。

分辨力强，反差好。

图像立体感强。

样品可长期保存

缺点：

易产生冰晶，技术难度大。

6.试述CO2临界点干燥法的基本原理及简单流程。

就是利用物质在临界状态下液体表面张力被消除的特性，克服样品干燥过程中的变形，保持样品原状，达到干燥的目的。

利用液态CO2与气态交换出现临界点状态时表面张力为零的现象（31.1℃,72.9大气压），保持临界温度，缓慢排气，当CO2气体排完时，样品即干燥。

流程：

样品整理（3-5mm）→2-3%戊二醛固定1-2hr.（或与1-3%四氧化锇（锇酸）双固定1-2hr.）→磷酸缓冲液或超声清洗→丙酮梯度脱水→100%乙酸戊酯2次各10-20min→高压容器中加液态CO2进行临界干燥。

7.试比较沉降速度法和沉降平衡法，各有何特点？

各有哪些类型？

分别用于哪些物质的分离？

包括差速离心法和区带离心法。

沉降平衡法:

根据被分离物质的密度不同来分离物质。

梯度中最大的密度要大于样品中最大颗粒密度。

包括：

差速离心，速度区带（或速度梯度）离心，沉降平衡离心。

8.如何利用联苯胺反应对样品中的过氧化酶进行定位？

原理：

细胞内的过氧化物酶能把联苯胺氧化为蓝色或者棕色络合物，根据蓝色或者棕色的出现位置来显示细胞内过氧化物酶的存在。

（1）把洋葱根尖徒手切成20-40μm的薄片，再用镊子撕取洋葱鳞茎内表皮一小块；

（2）把上面两个材料浸在含有0.1％钼酸铵的0.85％盐水溶液10ml中5min（钼酸铵的作用是催化剂）；

（3）浸在10ml联苯胺溶液内5min以上，直到切片出现蓝色；

（4）用0.85%盐水10ml清洗3次，每次5min；

（5）将样品置于载波片上展开，盖上盖玻片，显微镜观察

9.如何利用间接免疫荧光技术显示胞质微管？

用对应于细胞内的微管蛋白抗原的特异抗体，与体外培养细胞一起温育，使抗体与微管特异地结合。

然后用异硫氰酸荧光素（FITC）标记在抗球蛋白抗体上，温育样品，使两种抗体结合，使微管间接地标记上荧光素。

在荧光显微镜下即可看到胞质内的微管网络。

细胞培养→PBS漂洗→-20℃甲醇固定→冷丙酮提脂→第一抗体→温育→PBS→第二抗体→温育→PBS-甘油封片→观察

荧光显微镜下，蓝光激发，微管网络呈亮黄色。

10.常用的蛋白质分离技术有哪些？

1根据溶解度不同的分离纯化方法：

盐析、有机溶剂沉淀、等电点沉淀

2根据分子大小不同的分离纯化方法：

透析、超滤、凝胶层析、离心

3据电离性质不同的分离纯化方法：

电泳、离子交换层析

4根据配体不同的分离纯化方法：

亲和层析

11.简述植物细胞培养的主要类型及特点

外植体培养:

诱发产生愈伤组织。

用于研究植物的生长发育、分化和变异；

进行无性繁殖；

制取代谢产物。

悬浮细胞培养:

适合于进行产业化大规模细胞培养，制取植物代谢产物。

原生质体培养:

培养脱壁后的细胞，特点:

①比较容易摄取外来的遗传物质，如DNA；

②便于进行细胞融合，形成杂交细胞；

③适宜条件下可产生细胞壁，经诱导分化成完整植株。

单倍体培养:

通过花药或花粉培养可获得单倍体植株。

12.光学显微镜按光学原理和所用光源可分为哪些主要类型？

各有何特点和功能？

适用于何种研究工作？

普通光学显微镜特点：

物体的光线通过物镜后在目镜焦点（f）稍内方形成一个倒立的放大实像（BA）。

一般的低倍物的观察

荧光显微镜特点及功能：

光源为短波光；

有两个特殊的滤光片；

照明方式通常为落射式是利用一定波长的光激发标本发射荧光，通过物镜和目镜系统放大以观察标本的荧光图像

用途：

用于观察能激发出荧光的结构。

免疫荧光观察、基因定位、疾病诊断。

激光共聚焦扫描显微镜特点：

用激光作扫描光源，逐点、逐行、逐面快速扫描成像。

借助计算机分析和模拟，能显示细胞样品的立体结构。

用途：

用于观察细胞形态，也可以用于细胞内生化成分的定量分析、光密度统计以及细胞形态的测量。

暗视野显微镜特点：

采用特殊的中央有挡光片的聚光镜，斜射照明。

视野背景是黑的，被标本反射和衍射的光线进入物镜，物体边缘是亮的用途：

适用于观察活细胞的结构与细胞内微粒的运动

相差显微镜特点：

把透过标本的可见光的光程（波长）差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。

用途：

用环状光阑代替可变光阑，用带相板的物镜（通常标有PH的标记）代替普通物镜，并带有一个合轴用的望远镜。

偏光显微镜特点：

光源前有偏振片（起偏器），进入显微镜的光线为偏振光，镜筒中有检偏器（与起偏器方向垂直的偏振片）。

载物台可以旋转。

用于检测具有双折射性的物质，如纤维丝、纺锤体、胶原、染色体等。

微分干涉差显微镜特点：

利用两组平面偏振光的干涉，加强影像的明暗效果，能显示结构的三维立体投影。

标本可略厚一点，折射率差别更大，故影像的立体感更强。

倒置显微镜特点：

物镜与照明系统颠倒；

物镜工作距离较长。

用于观察容器培养的活细胞，

三、论述与实验设计题

1.设计一个研究方案利用光学显微镜观察细胞中的骨架系统即微管系统。

2.试述聚丙烯酰胺凝胶电泳体系组成及其三种效应。

聚丙烯酰胺凝胶电泳体系组成：

1．不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。

2．浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶,凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HC1

3．分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9Tris-HC1。

4．电极缓冲液是pH8.3Tris-甘氨酸缓冲液。

5.2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。

三种效应：

1）样品浓缩效应（a）凝胶孔径不连续性：

（b）缓冲体系离子成分及pH值的不连续性（c）电位梯度的不连续性：

（2）分子筛效应:

由于分子筛表面积的95％位于孔径内需要通过筛选来甄别邻近分子的大小只有小分子才能通过晶体的孔径开口进入分子筛的内吸附表面这种有选择的吸附现象被称为分子筛效应

（3）电荷效应：

各种酶蛋白按其所带电荷的种类及数量，在电场作用下向一定电极，以一定速度泳动。

3.试设计去壁低渗法制备植物染色体标本的实验方案。

实验原理

低渗法原为人类和哺乳动物染色体标本的制备方法，后引用于植物。

植物根尖分生组织细胞，经果胶酶和纤维素酶处理后，其中胶层的果胶质及纤维素构成的细胞壁被消化，成为游离的原生质体。

然后用低渗溶液处理，使细胞核中的染色体，向细胞质中自然扩散，经固定、火焰干燥、染色，即可制备出染色体长度适中、集中而不重迭、各部分形态结构清晰的优良染色体标本。

避免了压片法的缺点，特别适于染色体小且多的植物。

实验方法和步骤

1.材料培养种子在恒温条件下发芽培养，待根尖长至0.5～1厘米时进行前处理。

2.前处理切取0.5厘米长的根尖，用0.2％秋水仙素处理2小时，或用0.002M8-羟基喹啉处理2～4小时。

3.前低渗吸干预处理液，滴入0.075MKCL溶液，在室温下处理30分钟，其中更换低渗液两次。

4.去壁吸干低渗液，用蒸馏水洗一次，滴入2.5％果胶酶和纤维素酶混合液，以全部材料浸没为度，加盖，在30℃条件下处理2～5小时，其中将材料瓶轻轻摇动数次，促使酶反应充分。

5.后低渗吸干酶液（将酶液放到另一棕瓶置冰箱内保存，可反复使用），用蒸馏水慢慢洗2次，然后在蒸馏水中静止10～20分钟，进行后低渗。

6.固定吸干蒸馏水，加入新配制的甲醇:

冰醋酸（3:

1）固定液3毫升。

7.制片取根尖1～3个，放在清洁的载片上，加一滴固定液，用镊子将根尖挟碎，如太干，可再滴一滴固定液再行挟碎，去掉残渣。

8.火焰干燥将载片在酒精灯焰火上微微烘烤。

9.染色用10％Giemsa染液染20分钟，也可用改良苯酚品红染色液染色。

10.镜检将载片水洗后稍干，用显微镜找出分散好的染色体中期分裂相。

4.什么是细胞融合技术？

有什么应用价值？

试述其基本过程。

细胞融合（cellfusion）又称体细胞杂交（somatichybridization）或细胞杂交（cellhybridization），是指在离体条件下用人工方法将不同种生物或同种生物不同类型的单细胞通过无性方式融合成一个杂合细胞的技术。

应用：

细胞融合能重新组合两个亲本细胞的优良遗传信息，是研究细胞间遗传信息传递、基因在染色体上定位、改良动物遗传特性、及创造新的符合人类需要的新的细胞系的极为有效的手段。

过程：

1.抗原提纯与动物免疫:

选择与所用骨髓瘤细胞同源的BALB/c健康小鼠，可同时免疫3～4只小鼠,免疫过程和方法与多克隆抗血清制备基本相同,以获得高效价抗体为最终目的。

2.骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备:

选择瘤细胞株,须与待融合的B细同源。

融合细胞应选择处于对数生长期、细胞形态和活性佳的细胞3.细胞融合：

细胞融合是杂交瘤技术的中心环节，基本步骤是将两种细胞混合后加入PEG使细胞彼此融合。

4.筛选：

筛选阳性株一般选用的骨髓瘤细胞为HAT敏感细胞株，所以只有融合的细胞才能待续存活一周以上。

5.单克隆抗体的制备和冻存6.单克隆抗体的纯化

以下题目可作为课题论文提前查阅资料，写出完整方案。

从本人的研究方向出发设计一个完整的利用某种细胞生物学实验技术进行课题研究的实验方案。