细胞培养中霉菌污染问题Word下载.docx

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你在救细胞上花的功夫还不如重新养，霉菌真的不好处理，况且放在培养箱里还有可能污染其他的细胞，更可怕的是换液时把培养基也污染了，那你就等着更多的麻烦吧！

dongshiwu：

照着二楼的方法有效,我曾经仅用二性霉素就将霉菌污染的293细胞救回来过.

linbmm：

细胞培养过程中，通常有意想不到的状况发生。

昨天观察我的细胞时，发现皿中有黄色斑点形成，斑点边缘不是很清楚，培养液未发生变化，细胞形态也没受影响。

其实这就是霉菌污染的早期现象。

今天再观察时，斑点已扩散，而且皿中斑点数量也增多了。

大家遇到过这种情况吗？

怎样消除霉菌污染现象？

juju：

如果发现霉菌污染，尽早把细胞扔了，如果是细胞培养板一孔或几孔污染，小心吸除后加高浓度氢氧化钠封闭。

避免污染扩大，害及其他孔或培养瓶中细胞。

已经发现污染再加两性霉素是没有用的。

供参考。

jzyxynwm：

霉菌污染不要吝惜细胞,坚决丢弃,复苏冻存细胞,还要注意要把孵箱和整个培养间做彻底消毒,用甲醛熏蒸,孵箱用苯酚彻底搽净!

!

对于两性霉素等药物的挽救措施建议你不要采用,因为任何一种外来药物对细胞都会产生不良,甚至未知的影响,包者对实验严谨的态度,一切从新开始!

做细胞培养要抱着平和的心态去做,不可急功近利,这样往往事半功倍!

soso_fan：

一般出现霉菌污染，如果不是非常珍贵的细胞一般都是扔掉，而且连相关的容器都要做严格的处理。

两性霉素B可以起到抑制霉菌的作用，一般只是培养前把标本短时间的浸泡，培养液里一般不加，因为抗真菌药物的细胞毒性还是比较大的，一旦出现了污染还是早点扔掉为好，以免污染其他细胞造成更大的损失。

即使用高浓度的抗真菌药物处理过，细胞估计也不会好到哪里了。

drhl：

我的细胞最近也出现了霉菌污染，不知道怎么回事。

以前是偶尔有一瓶污染，现在却是大批量的污染。

我初步估计实验时吸管不干净，因为那批吸管没有泡酸就高压了。

maokai123：

酶菌厉害得原因是霉菌会产生孢子，孢子空气传播，比一般接触传播的细菌厉害的多，楼上同学的吸管我想不是问题，霉菌一般是人带到细胞房的，到细胞房最好换衣服换鞋。

污染发生了除了常规的处理以外，一定要彻底处理污染材料，焚烧，不要留在实验室，不然容易重复污染，空气要甲醛熏蒸消毒。

孢子对紫外的抗性很强。

人员的个人卫生也重要，试验服洗洗晒晒吧，不留长发，常洗澡

zhizuchangle：

我们是采用在水盘里加硫酸铜来预防霉菌！

wangzhua：

我们几乎所有细胞均有如图片中的污染存在,开始时只有较少小黑点粘附在部分细胞上,后来几乎所有细胞身上都长满了如此的小黑点,这个周期要三两个月的时间,小黑点长得不是很快,好象开始时对细胞状态也没有太大影响,但传代时可见瓶底有很多细胞碎片似的东西,这个东西多了以后,细胞长势缓慢.心疼啊,哪位高手有好的办法?

前两在清理培养箱,发现箱体上有霉菌斑,送检以后说是毛霉菌,如何解决?

有时候消化细胞的时候可见到这些小东西从细胞的残骸里跑出来,很恐怖，但活动不是很剧烈,只在原位振动,这也是它长得慢的原因吧。

所有照片在Nikon倒置相差显微镜40倍物镜下用数码相机拍摄,放大倍数约800倍

哈佩雕：

你这下就惨了，长了霉菌细胞只能扔了，而且整个实验室和培养箱都要消毒啊。

我们实验室液发生过类似事件，我把我们处理过程告诉你，希望对你有帮助：

首先消毒培养箱，如果你们有两个或以上培养箱就好办了，如果只有一个且还有很多其他细胞就麻烦点。

只能暂时的放在超净台上。

具体如下，中午将空调温度打到最高（也只有31度），超净台开紫外。

下午早点来关紫外，将细胞转到超净台内，用75％酒精擦洗培养箱，再用无臭氧型可移动的紫外等照射半小时，然后将细胞放回即可（切记CO2瓶子阀门要关紧啊，不然气全跑光了）。

再消毒实验室，先把室内空调和消毒柜过滤网都拆下清洗，在锥形瓶内加点高锰酸钾，放在实验室地上，然后倒入甲醛，立马关门走人就可以了。

2天后再开门装好东西，和往常一样开始工作了。

由于2天不能做事，个人细胞要先计划好，大家都可以休息两天。

shaverwoo：

确实应该仍了，否则挽救只会浪费你更多的时间。

我也遇见过，还曾经挽救过，我用了制霉菌素来反复洗涤细胞，并在培养液里也加了，看着细胞长好了，还以为成功了，接着传了二代，还冻了些，可是之后，仍然不断的有霉菌污染发生，取出冻的细胞一复苏，根本不贴壁，一查，是真菌，所以赶紧消毒实验室还有你用的所有材料吧，一定要全部重新彻底消毒

jcl738：

三天之内竟然发现有两瓶LB培养基出现了霉菌污染（一瓶加了氨苄），很郁闷，今天不得不把摇的菌倒掉了.使用时严格按照无菌操作了，但为什么还是被污染了呢？

我爱标标：

霉菌污染是防不胜防的,你的培养基被污染了,只能说明一个问题:

你的实验技术还不过关.再继续努力吧!

frederick：

可能是周围的空气中有霉菌，你那操作台附近最近有没有搬过什么中大型的东西，或移动了什么。

我们这里前几天移了一下冰箱，那个星期的平板摇瓶全染霉菌了，所以你在接种或培养的的时候千万要注意环境的变化，霉菌就是在不经意见进入了你的摇瓶或平板。

我配的培养基不是我一个人用，我实验室人都用啊！

我是新手，可能是我的问题！

没有搬过什么东西，不过我们的超净台就在门口附近。

实验室用紫外照可以杀霉菌么？

趙子植：

LB被霉菌污染的原因有

1、制作时灭菌不完全,可以增加灭菌的时间到40分钟试试看

2、灭菌完全但是灭菌后无适当保存,可以将LB保存在4度的环境要使用时再回温并且注意瓶盖是否有完全密闭

3、操作不当,操作时未按照无菌操作原则保持无菌环境或者是操作人员双手未先以70%的酒精消毒

4、菌种受到污染,所种的菌种已经受到霉菌的污染,建议换掉菌种

5、不论是受到何种因素污染皆可以利用简单的对照组实验来找出污染的原因为何,建议可以自己试试看

freechange：

我作了这么多次还没有被霉菌污染过，可能使我侥幸。

但我想主要原因是因为我注意了一下操作：

1、我操作的时候，总是在灭菌同时超净台外侧窗口处，喷一些医用酒精，以控制周围附近的空气中漂浮菌。

2、在做完试验后，超净台里喷一遍医用酒精，然后严格按照紫外灭菌等操作。

3、还有，超净台长时间使用了的话，要把里面的防尘过滤网拆下来，用吸尘器或者其他东西吸净，洗净。

wang_gost：

培养箱中放一些饱和硫酸铜溶液可以防止霉菌污染细胞

Reesei我做的是霉菌，我也很担心染菌，不过我是担心把别人的培养基染上我的菌，呵呵

有霉菌的话紫外杀菌要长一些，三十分钟左右；

超净工作台霉菌与细菌最好分开用，如果超净工作台系统染菌的话，恐怕要进行一次彻底杀菌了；

培养基ph值可以适当调高一些，霉菌一般喜欢偏酸性。

mjing：

我觉得还有可能是你们实验室还有人正在做霉菌的,如果产孢子的话,紫外消毒的时间应相对长些.还有你可以加青霉素或链霉素在培养基中,效果可能会更好.

gleydream：

有一个方法可以试试紫外开的时间久一些同时一定要有些间隔比如开20分钟，然后关掉10分钟再开20分钟记得我得老师以前说过的因为有时候孢子可能没有完全杀死两次这样的话就可以了。

还有就是，尽量不要再太潮湿的空气操作，同时不要裸手经过瓶口。

最好是能直接放在无菌室。

一般很少染菌吧。

我得LB没有加氨卞的，放了1个月都不长菌。

可能和就放在无菌室有关，或是超净台

neighboour：

我养的VM总是出问题，原代培养后1-2天内没有什么问题，换液一次后1天毛病开始出现。

（1）加血清的VM细胞出现丝状漂浮物质，生长快速，培养液不混浊，细胞生长差。

贴图1

（2）不加血清培养的VM细胞没有出现这种情况；

（3）两者均出现散在的黑色“细胞形状”的物质，（贴图2）经观察未见明显增长和数量增多。

我师姐说可能是霉菌污染，并告知我严重的后果，我不知道是不是

我的血清有问题？

但是我师姐也用同一大瓶分装的血清，她没有这种情况出现。

而且上次出现过一次污染之后，我抛弃了我原有的DF12和血清，重新配置和分装

（2）是否为我换液过程中操作不慎？

我以前在其他试验室也是如此操作，没有出现过问题的呀。

（3）黑色的小颗粒物质是否和使用酒精灯过火玻璃吸管有关？

我师姐的细胞有时也出现过这种情况。

在以前的培养室（用液化气）内没有出现过这种情况。

我不敢肯定这次的污染是否和这些物质有关。

（4）如果是霉菌污染，该如何消毒呀？

？

fancychen_78：

你的真的是真菌污染，链状的菌珠是真菌的菌丝，你的培养液中加了双抗吗，一般双抗终浓度为：

青霉素100U/ml,链霉素100u/ml，市售的青霉素为80万U/瓶，溶于4ml体积内，每1000ml培养液中取0.5ml，链霉素为100万u/ml，溶于5ml体积内，每1000ml培养液中取0.5ml。

污染严重时可以采用5-10倍的冲击剂量。

已经吸取过细胞或培养液的吸管不要放在过分烧，甚至可以不少，否则，蛋白烧后，会释放有毒物质

midas：

建议可以先把液体过滤一下，在悬浮细胞，如果还有问题的话，就怀疑是在操作中有问题－－这时最好先看看别人的操作！

midas是说我把DF12过滤，还是说把培养皿内的培养液过滤，另外，如果是真菌感染的话，双抗是否没有作用呀。

当然是把加了血清的DF12过滤！

生物迷：

介绍点我的经验：

真菌大多悬浮于液体表面,如果发现有少量真菌污染可用大量PBS或D-HANKS冲洗,加含有双抗的培养基培养观察3天,然后看有没有真菌.我用这种方法救了一瓶非常宝贵的细胞（用GIBCO胎牛血清外加FGF-2培养了一个月的MSC）.

seaman_wang：

如果你霉菌污染，有两种方法，一种是你制备一些小鼠的饲养细胞加入板上，一起培养，让饲养细胞中的巨噬细胞吃到霉菌。

第二种，在培养基中加入制菌霉素。

PINX：

是真菌污染，可以用两性酶素B试试看，不要用国产的，因为试剂不纯，有较大毒性，GIBCO有商品化的两性酶素，我师妹用过效果不错。

heimukai13：

请问:

我先配置DMEM,然后过滤,吸3ml检菌三天,若无菌,添加FBS和双抗,过滤后贮存备用.（不知这样对否?

因为我是从别的实验室学的,我连续几次配,检菌时都发现培养基表面有一层薄薄的如雪花形状的东西,它在配完培养基第二天下午六七点还看不到,而到九十点就能看到好多,非常迅速,但往后几天却又不怎么长了,培养液一直是清澈的,很纳闷,不知是什么东西,）

若配置DMEM后不检菌,而直接加FBS和双抗,成为全培养基,过滤备用,可以吗?

asd1191：

双抗要在配DMEM时就要加，然后过滤！

过滤后最好在DMEM中加一点血清在培养，这样长菌的话快！

过滤前是不加血清的，因为血清是很难过滤的！

培养基表面的如雪花形状的东西可能是长菌的，你摇晃一下瓶子，若浑浊了，则很有可能污染了！

另外培养基最好不要反复过滤！

这样营养成分会丢失的！

另外反复过滤的话会偏碱！

哦,原来要先加双抗的!

加了双抗,还需要检菌吗,我想一般就生不了细菌了吧!

我不加血清都有漂浮物了,会不会是真菌呢,是的话,怎么防止呢?

那些雪花状的东东,摇一下,还是在表面荡来荡去,培养液清澈.（见图）我过滤加FBS后的培养液很好过滤的!

怎么回事呢?

hualey：

加双抗也只是防止一般染菌，但像支原体等污染就很难起作用，所以加了双抗之后还是要验菌的。

感觉你那东西像染菌，因为1）你没加双抗；

2）开始没有，第二天才出现（除非你的培养基pH发生大的变化，一般不可能）。

鉴于你每次都出现这种情况，你是否可考虑环境或操作有问题，你也没说具体，所以只能作为建议。

小牛血清不好滤是相对的，我滤过小牛血清，只是比不加血清的培养基难滤，有时含血清培养基用久了，我还用滤器滤过呢！

我第一次配时没有发现这种情况,后面三次操作都一样,而且用的都是刚灭过菌的东西,而出现照片上这种东西了,会不会是培养液里的氨基酸什么的析出来了呢,因为这雪花样东西过上几天还是这么多,是菌的话应该长疯了吧!

而如果是支原体的话,应该肉眼看不见的了.

scp：

应该不是氨基酸析出，若是氨基酸析出的话沉淀是在底部的。

漂浮在上面会不会是霉菌呀？

你有没有用这种培养基养过细胞呀？

不妨尝试一下看看有没有污染，如果没有污染的话，大可继续使用。

还有。

双抗一定要在过滤之前就加上，血清最好也是这样（虽然过滤速度会慢一些）。

应该不是霉菌吧,霉菌是丝丝连连的,绒球球样,长起来好多就悬浮在培养液里了,有一瓶细胞曾经污染过,这个就不一样了!

我试试看用它来培养细胞!

朱晶：

：

双抗一定在要滤之前加，对于DMEM培养基我建议在-20冻存后，如果想用最好提前一天化出来，放到4度里放一天再用，这样比较好，因为这种培养基极愿意产生一些析出物，放置一天会就会溶开了。

而且我觉得血清最好还是不要过滤，里面含有一些大分子的营养成份，如果过滤的话对血清本身来说是一种损失。

szmengjie：

我第一次培养T淋巴细胞，加了PHA刺激其生长。

发现显微镜下它们长得特别快，昨天还是密度适中的圆圆，亮亮的小豌豆一样的游离的细胞。

细胞中间有些聚集成团的颜色较深的象一堆血小板一样的东西。

今天一看，已是长得平铺了一视野的密密麻麻的看不出单个细胞的形态，大小。

呈向心性分布，即中间密度尤高，而越到边缘，则稀疏点。

在稀疏处可看到圆圆，亮亮的小豌豆一样的游离的细胞。

肉眼培养液里有白色絮状物。

白色絮状物究竟是污染还是细胞数太多？

菊花与刀：

是不是霉菌感染呢，我前段时间培养的细胞最后就是感染霉菌了，就是一团一团的漂在上面，中间密度高，周围稀疏，高倍镜下可以看到菌丝。

我想霉菌污染是有可能，我用的是24孔培养板，因为标本是断断续续地来，一次只能用其中几个，将那些细胞悬液吸走后，因还有没用过的孔，舍不得丢掉培养板。

过一天，看那些曾用过的孔，孔底部长出象雪花一样的，也可说象海藻一样，每个枝象细胞生物学上分子筛的图像一样。

我想问：

1细胞太多能出现白色沉淀吗？

2霉菌污染除开看到菌丝，还有其他方法证明其存在吗？

早期有什么补救措施吗？

3我对细胞培养时出现的污染实在没有概念。

有没有哪里提供图谱，让我们这些新手认认敌人的面貌呢？

culture-spirit：

1、可以，镜下可见此处细胞程大团分布

2、如果霉菌污染已经到了出现白色沉淀的时候，一般能够看到菌丝了，镜下相当明显

3、这个我也没有找到，好象一些细胞培养的书付页里有，可以请教其他战友

qjzhou2000：

1、不会是沉淀的，仔细看应该还是可以看到细胞形态的，你用的是不是olmpus的相差境？

那种倒置境的相差效果很好，细胞看起来有点象珍珠。

2、霉菌看到菌丝的时候就很厉害了，早期不容易发现，可以加两性霉素之类的抗霉菌的抗生素，具体请在该区搜索，很多都讲到了。

3、现在还没找到，不过一些描述还是很直观的。

细胞数太多会出现片状的脱落，所以白色絮状物污染的可能性大些！

独上高楼：

霉菌污染后细胞多生长很慢，象你这种情况，细胞一夜就长满，霉菌污染的可能性不大。

另外，霉菌污染也不能一下就看出白色絮状物，而是先在镜下看到较稀少的短小黑色分枝串珠，再看到较密集的短小黑色分枝串珠，最后才能肉眼看到白色絮状物，这个过程大约要1个星期左右，而且在这期间细胞几乎不生长。

前段时间我老被这种在细胞培养液中白色的象一片白膜的东西困扰。

40倍镜下同“细胞污染讨论区”贴出的图片一样。

上周我送了个培养，结果证实是真菌污染。

显微镜下（100倍油镜）染色后可见到一颗颗象红色的南瓜子一样的东西（真菌孢子）。

据细菌室的老师说还可在这些“红南瓜子”间见到丝一样的东西。

可能就是菌丝了。

我已经非常注意实验器材的消毒灭菌，操作应该也没问题。

于是将试剂一个一个吸取了放在显微镜下观察，发现是洗细胞的HANK'

S液被真菌污染了!

现在我已经换了HANK'

S液，这种污染可以说被控制了。

yoyo781206：

我想应该是污染了，因为我也遇到过，过几天就看到放射状的菌丝了

topgun：

象霉菌的菌丝，但应该观察其数量是否增多？

因为霉菌污染在2-3天内可见大量的菌丝！

如果是不小心带进去的棉絮则不会有数量的增加且培养基也不会变混浊。

yuandong：

我想应是霉菌，白色，絮状，培养基变成了黄色。

apple800828：

不象霉菌污染。

前两天我培养的内皮细胞被霉菌感染了，好典型的树枝分叉样。

象抽丝一般。

chenting100：

是霉菌，我们的细胞就经常出现这种污染，实验室老师说霉菌有好多种变异呢。

huvec：

其中有多细胞真菌污染的特征性标志：

菌丝！

wujinghui：

我得细胞培养液中不知道是什么东东，它漂浮生长，在瓶底是白色的，在低倍境下就能看到，在培养瓶里边呈葡萄状，还有的呈树枝状，刚开始时候生长的不快，但是很快就长得很快。

不知道这个东西是什么东西，英文名字怎么写，最好能告诉以下如何控制！

ya2cyto：

霉菌感染。

霉菌是以孢子在空气中传播，细胞肯定是不能要的了，一旦污染很难控制

用环氧乙酸熏蒸培养箱，最后再对培养箱进行无菌实验方可使用

不是霉菌，因为霉菌不用显微镜就能看得到的。

我这个不用显微镜是看不到。

shyaroom：

不信？

你再放个三天，肯定就能用肉眼看到啦，呵呵。

不过建议你换个地方放，别把其它细胞再给污染了。

ylh1976：

霉菌，树枝状的东西是菌丝，葡萄状是霉菌。

赶紧处理掉细胞，培养箱、操作台还有整个培养室好好消毒一下。

梅雨季节要千万小心，空气中到处都有霉菌孢子。

深谷幽兰：

各位，有时鸡胚成纤维细胞也连在一起，呈树枝分叉状，而正常的细胞单个散在，这是怎么回事？

junny999：

我的一个同事养的细胞被霉菌污染，我与她共用一个培养箱，为防止交叉污染，我想在我的培养基里加点抗霉菌的药，请教加哪一种药物比较好？

剂量怎样添加？

我养的是MSC

XTYang：

Invitrogen公司的Fungizone,1%（v/v）的用量。

对有些细胞有毒害作用。

renjiaqiang：

我觉得你最好不要加，我加过抗霉菌药物后细胞生长很慢，而且形状也发生改变，不得已重新买了一株细胞，你现在可以先把细胞冻存，将培养箱消毒后继续进行实验。

lingzhiting：

最好不要用吧！

我用过nystatin，40Iu/mL。

霉菌没长起来，不过也许是不溶的缘故，细胞生长很慢，而且还引入了不明杂质，洗了几次，才逐渐洗去。

wuguojun680510：

如果没有长真菌就不要加抗真菌药物，因抗真菌药物有较强的细胞毒性，加了结果会适得其反。

最好能把环境处理一下。

qianyimei：

星期一复苏了一支细胞株，养到星期三还好好的。

心太急。

老希望它能长的快些，所以，将一瓶配成三瓶用，结果倒好，今天早上一来，就发现里面长了很多成团的碎片状的东西，众师兄都说是霉菌，叫我倒掉，好可惜，好郁闷！

早知道就不换液了，这一换，全军覆没。

那位能有更好的办法吗。

zhaoqingshan：

用含双抗的PBS洗几遍，换上好的培养液（比如用点好的胎牛血清）；

每天洗1-2次，只要细胞状态还好，洗几天，就能把霉菌去除。

然后，检查霉菌污染的原因，清除污染源。

zjuaxiu：

根据经验霉菌污染了用双抗的pbs冲洗基本是没什么作用，只能是浪费双抗pbs时间

那只是说明你的经验，不巧的很，我的细胞（细胞很娇贵，培养液价值约10元/ml）去年七月霉菌污染了一次，全部抢救过来。

不可否认很多时候是抢救不回来，前提条件是早发现污染，霉菌对细胞还没有构成太大伤害时候，是可能抢救回来的。

当然，最重要的是不要有污染了，预防最重要，即无菌观念要强。

flyingpumc：

用3微克每毫升的两性霉素杀杀试试!

eweiren：

如果不是唯一的一管细胞，我觉得没有必要费这么大力气去挽救，因为有了霉菌，基本上是无法去除的，通过换液只能达到抑制真菌的生长，在镜下看不到不代表不存在，只是由于少或者芽孢看不到，一段时间后它可能还会出来，耽误试验啊！

zhaoqingshanRe:

碧海娃娃

双抗PBS是指含有双抗（青链霉素）PBS（磷酸盐缓冲液，也不能杀死霉菌，杀霉菌应该用两性霉素或制霉菌素），使用双抗PBS冲洗仅仅是预防其它细菌的污染而已。

Re:

eweiren，你说的是很对的，真正严格的实验是不应该有污染的。

细胞株拿来后，传代几次，细胞多了，就应该冻存一些，一方面以免细胞传代次数多了变成非二倍体或者其它变异，另外就是以防污染。

如果自己培养的原代细胞，可以挽救一下试试，大部分情况是难以回天的，看运气了。

不过，我那次污染正是霉季，一般实验室在这个时候，可能就不养细胞了，我们实验室是我们院里无菌观念最严格的一个实验室，在这以前，细胞从来没有污染过。

那时候可能是因为空调很久没有擦洗消毒了，而我又太大意，因此感染霉菌了。

不过，那次我还真的就救回来了，因为我的培养液中，营养条件特别好，而且我每天洗几次，换液，细胞没有任何的受影响的表现，我做的是原代细胞传代到第三代，刚好该做实验，因此就全部用来做了同一批的实验。

避免真菌污染的几个措施：

1、严格的无菌操作;

2、无菌间定期打扫、消毒，保持干燥；

3、各种培养液、培养器皿的严格消毒；

4、温箱中消毒水中放置过饱和的消毒的磷酸氢二钠或者硫酸铜。

eyeball：

霉菌污染了用双抗的pbs冲洗基本是没什么作用，只能是浪费。

关键是液体一定要保持无菌。

培养液过滤后要取一点先放培养箱预培养三天，无菌生长后再用。

我曾经就回来过遭霉菌污染了的细胞。

如果细胞好养或有存货的话，干脆从头作起，要是舍不得可以用PBS液洗3遍，在新的培基中加两性霉素。

最好弃掉，要不在以后的培养基中加Invitrogen公司的Fungizone，多换几次后也可。

wangfx_vet：

我最近养的细胞总是出现空泡并且不