增强型绿色荧光蛋白Word文档格式.docx

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增强型绿色荧光蛋白；

基因转染

　　［Abstract］Objective:

Todevelopanappropriatetracingmethodfortransplantedmarrowmesenchymalstemcells（MMSCs）invivo.Methods:

MMSCsofratswereisolatedfrombonemarrowandpurifiedbyadherentcultureinvitro,andthecellmembrane‘smarksweredetectedwithflow　cellsweretransfectedwithexpressingplamidofpEGFPC1mediatedbylipofectamine,andtransientexpressionwassubsequentlyobservedwithfluorescentmicroscopy.Results:

TheexpressionofpEGFPC1wasinitiallyfoundin24hafterthetransfection，reachedpeakin48～72h，andremainedstrongexpressfor12～14moredays.Conclusion:

LipofectaminemediatedtransfectioncanmakepEGFPC1expressedinMMSCssafelyandeffectively,whichshowsthatitisanidealmethodforstemcelltracking.

　　［Keywords］marrowmesenchymalstemcells;

enhancedgreenfluorescentprotein;

genetransfec-tion

　　骨髓间充质干细胞成为近年来干细胞研究的热点，其不仅本身可发挥治疗作用，同时也可作为外源基因的载体和表达场所[1]，是基因治疗理想的种子细胞。

2007年3月～2008年3月通过对大鼠MMSCs体外增殖培养，应用增强型绿色荧光蛋白C1基因表达的质粒转染MMSCs并筛选培养，旨在建立一个较好的基因标记条件，为MMSCs应用于后续基因治疗的可行性奠定基础，为MMSCs的生物学行为提供新的示踪方法。

　　1材料与方法

　　动物、试剂和仪器

　　清洁级近交系SD大鼠6只，雄性，体重（110±

10）g，健康。

质粒pEGFPC1由香港大学周中军教授惠赠，菌株E·

ColiDH5α由贵阳医学院分子生物学实验室保存并提供，LDMEM购自GIBCO公司，胎牛血清购自杭州四季青公司，离心柱型质粒小提中量试剂盒购自TIANGEN公司，HindⅢ限制性内切酶购自TakaRa公司，脂质体LipofectamineTM2000购自Invitrogen公司，G-418购自Solarbio公司，荧光显微镜购自Olympus公司。

　　大鼠MMSCs的体外分离、纯化、增殖培养及鉴定

　　取雄性SD大鼠颈椎脱臼法处死，分离股骨及胫骨，收集骨髓腔内细胞，接种于含10％胎牛血清的L-DMEM培养瓶中，37℃、饱和湿度、5％CO2培养箱中培养。

第3天后半量换液，以后每3d更换新鲜完全培养液，待细胞接近90％铺满瓶底时，倾去培养液，用％胰蛋白酶常温下消化并传代，用新鲜完全培养基重悬细胞，按照1∶2接种于培养瓶中继续增殖培养。

每日定时于倒置相差显微镜下观察，记录细胞形态的变化和增殖情况；

取传代培养至第5代的MMSCs制成单细胞悬液，应用流式细胞仪进行细胞膜表面分子CD29、CD34、CD45及CD71的水平检测分析。

　　质粒的扩增、提取及鉴定

　　取大肠杆菌DH5α用氯化钙法制备感受态细菌，将质粒pEGFPC1转化感受态细菌，37℃培养24h，挑取单菌落接种到含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃震荡培养过夜，取菌液ml，按照离心柱型质粒小提中量试剂盒说明书用碱裂解法提取质粒DNA。

紫外分光光度计测定质粒DNA浓度，取1μg质粒DNA用HindⅢ酶切，1%琼脂糖电泳鉴定酶切结果。

　　质粒pEGFPC1转染大鼠MMSCs

　　应用阳离子脂质体LipofectamineTM2000介导pEGFPC1转染MMSCs，以400mg/L的G418进行筛选，荧光显微镜下观察细胞并拍照。

为提高转染率，质粒DNA∶LipofectamineTM2000为2μg∶5μl，G418的筛选浓度为400mg/L，均为经优化后的最佳条件。

　　表达pEGFPC1基因的MMSCs的生长特性及细胞活力观察

　　在荧光显微镜和倒置相差显微镜下观察细胞生长及增殖特性。

取转染质粒pEGFPC1后1～3代的传代细胞，制成单细胞悬液，以％台盼蓝作为染色剂，用细胞计数板计数活细胞和死细胞，共计3次，取平均值计算，细胞活力＝/总细胞数×

100％。

　　2结果

　　形态学观察及鉴定

　　大鼠MMSCs原代培养的细胞呈圆形，呈悬浮状态，第3天有部分细胞贴于培养瓶底，呈圆形或类圆形。

第7～8天贴壁的细胞开始形成克隆集落，呈放射状或漩涡状生长。

第14天瓶底细胞密度达90％以上，呈融合状态，由形态均一的细胞组成增殖集落。

待细胞接近铺满瓶底时即可传代，第3～5代细胞已基本形成均匀一致的长梭形，排列成放射状或漩涡状，传代周期约为6～7d。

流式细胞仪检测发现，分离、纯化所得细胞表面CD29、CD71以阳性表达为主，CD45、CD34以阴性表达为主，符合MMSCs的生物学特征，见图1。

　　质粒pEGFPC1DNA的定量及鉴定

　　提取的质粒pEGFPC1，用分光光度计分别测出所提取质粒DNA溶液的A260和A280，根据公式计算出质粒DNA的纯度为～。

根据公式C（mg/L）=A260×

稀释倍数×

50，计算出质粒DNA的浓度为180～360mg/L。

所提取的质粒DNA在出现两条较为清晰的条带，质粒DNA的酶切产物在B泳道约4700bp处出现一条清晰的目的条带，证实所获质粒为pEGFPC1。

　　转染质粒pEGFPC16h后，MMSCs胞体内绿色荧光表达率较低，转染24h后MMSCs中可见特异性EGFP绿色荧光，少数细胞转染后呈圆形，未能贴壁而死亡；

48～72h后加入G-418进行筛选，7～8d后空白对照组MMSCs全部死亡。

转染pEGFPC1的大鼠MMSCs仍继续生长，细胞密度较低，荧光显微镜下可见到MMSCs胞体内有绿色荧光表达；

12～14d后荧光显微镜下可见到MMSCs胞体内有绿色荧光，细胞密度增高至80～90％，外形与未转染细胞相同。

　　表达pEGFPC1基因的MMSCs的生长特性及细胞活力

　　pEGFPC1在脂质体介导下转染MMSCs后，阳性细胞发绿色荧光，呈“全细胞型”，同一时间点观察，可见处于增殖、分裂状态的各期细胞的生长和增殖不受影响。

经台盼蓝染色后，表达pEGFPC1基因的第1～3代MMSCs的细胞活力大致相同，分别为96％、94％和93％，传代周期约为6d～7d，此时细胞呈融合状态，由形态均一的长梭形细胞组成增殖集落，排列成放射状或漩涡状。

将表达pEGFPC1基因的MMSCs共传至第5代，发现仍具较强的增殖活力，未出现衰老征象。

　　3讨论

　　应用pEGFPC1作为示踪分子时，不同的表达载体转染不同的细胞，效率不同，病毒载体转染效率较高，但有较强的免疫原性，表达质粒比病毒载体更为安全。

脂质体法是近年开发的更加简便高效的方法，能被DNA的磷酸根所吸附形成DNA-脂质体复合物，同样也能被表面带负电荷的细胞膜吸附将DNA导入细胞。

实验发现，质粒和脂质体浓度过低，转染效率降低；

而浓度过高时，不仅转染效率降低，且容易出现细胞脱落和坏死，说明高浓度对细胞存在毒性。

当脂质体-DNA复合物孵育时间过长时，可见细胞形态的变化，甚至细胞漂浮，同时转染效率也降低。

因此，转染效率与质粒浓度、脂质体的浓度及脂质体-DNA复合物孵育时间密切相关。

　　在质粒的转染过程中，认为有几点值得推荐。

（1）在开始准备DNA和阳离子脂质体试剂稀释液时要使用无血清培养基，因为血清会影响DNA－脂质体复合物的形成；

（2）在转染培养基中不能使用双抗，即青霉素和链霉素，它们是影响转染的培养基添加物，这些抗生素一般对于真核细胞无毒，但阳离子脂质体增加了细胞的通透性，使抗生素可以进入细胞，从而降低了细胞的活性，导致转染率降低；

（3）转染相同量的DNA所需的最佳阳离子脂质体的量会因细胞密度而异，质粒和脂质体浓度比例为1∶2～1∶3效果最佳。

经过优化条件后发现，对MMSCs进行转染前细胞密度在80%～90%时效果较好，这样可以确保细胞未长满或未处于静止期。

　　MMSCs由于取材方便，易于分离培养，体外扩增快，具有高度自我复制的能力，而且不存在免疫排斥和病毒威胁等因素[3,4]，被认为是较为理想的基因治疗的载体[5,6]。

在本实验中，将外源性基因EGFP转染大鼠MMSCs，以验证MMSCs作为基因转染载体的可行性。

实验发现，采用脂质体介导EGFP瞬时转染MMSCs，转染6h后，在MMSCs胞体内有报告基因产物的绿色荧光，此时表达率较低；

转染后72h左右对MMSCs进行加压筛选，12～14d后可见表达EGFP的MMSCs呈融合生长，而且转染该外源基因后MMSCs生长无明显改变，依然保持自我复制的能力。

　　本实验应用的突变型EGFP基因是在水母来源的野生型GFP基因的基础上，替换了影响荧光表达效率的88个密码子中的92个碱基所构建的合成基因，由于选用了动物细胞偏爱的密码子，可以显着提高其在动物细胞中的蛋白表达量和荧光效能。

EGFP是一种优化的突变型GFP，它将65位的丝氨酸用苏氨酸代替，64位的苯丙氨酸用亮氨酸代替，这种突变型EGFP基因保留了GFP作为报告基因和筛选标记的诸多优点，更易于在动物细胞中表达。

这种突变体蛋白表达量的增加及有效蛋白折叠的构象变化，使突变型EGFP基因荧光强度明显增强，发射出的荧光强度比野生型GFP高35倍，大大增强了该报告分子的灵敏度，使EGFP非常适用于荧光显微镜和流式细胞术分析。

因此，突变型EGFP基因比野生型GFP基因更适用于作为哺乳动物细胞的报告基因和筛选标记，可在多种异源细胞中表达[7,8]，可以广泛应用于细胞生物学、发育生物学、分子生物学、基因表达与调控、细胞分化及蛋白质的胞内定位与功能转化等诸多研究领域。

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