线粒体COI基因克隆Word文档格式.docx

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5、琼脂糖：

1.0%；

6、电泳缓冲液（50×

TAE电泳缓冲液取Tris24.2g，冰醋酸5.7ml，0.25mol/LEDTA（pH8.0）20ml，加蒸馏水至100ml）

7、溴化乙锭EB：

5µ

l/100ml

8、溴酚蓝指示剂

14、限制性内切酶BamHI、EcoRI、HindII、HindIII和Pstl，

16、氨苄青霉素（100ug/ml）的LB平板（胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，加水至1000ml,若配置固体培养基，则再加入15g 

Agar（琼脂）。

）

17、pUC19质粒DNA

19、杆菌HB101菌株，

20、感受态细胞HB101。

二、工具材料

1、剪刀5把不同大小

2、镊子5个不同大小

3、烧杯2个大的4个小的

4、移液管（一般用移液枪）

5、离心管10个最大的

6、培养皿5个小的10个大的

7、三角锥瓶4个

6、定容瓶2个50mL1个1L

7、试管架1个

三、设备材料

1、高压灭菌锅

2、无菌操作台

3、冰箱

4、水浴锅

5、离心机

6、玻璃匀浆器

7、凝胶电泳系统

8、紫外透射检测仪

9、PCR仪

9、缺口转译标记试剂盒，

10、质粒DNA限制酶消化分析及杂交探针系统

11、硝酸纤维素滤膜

13、同位素P32标记的水稻线粒体Col探针

紫外透射检测仪

四、实验步骤

（一）鱼肝线粒体DNA的分离与纯化

1、按上面所写准备实验材料

2、对实验器材灭菌

3、对鱼预处理

刮鳞消毒取鱼肝用STE缓冲液清洗

4、再加入STE缓冲液到玻璃匀浆器里冰浴中缓和匀浆

5、离心转头在3000g离心30分钟

6、除去上层脂肪和管底细胞碎片取上清液

继续离心20000g离心30分钟得到粗提的线粒体沉淀。

7、加入20mlSTM缓冲液2mgNasel25℃水浴中保温消化30分钟

8、取0.8ml0.5mol/LEDTApH8.0溶液加到消化液中，使终浓度为20mmol/L，终止酶解反应。

9、然后再加入160mlSTE缓冲液，20000g下离心20分钟，收集线粒体沉淀，重复用STE缓冲液漂洗线粒体二次，清除污染的核DNA

10、把离心所得的线粒体沉淀悬浮在20ml的NTE缓冲液，加入20%SDS溶液至终浓度为0.8%，放置在37℃水浴中保温10分钟。

11、用等体积的苯酚抽提脱蛋白二次，留水相，

12、用10分之1的3mol/LNaAC和二倍体积的冷乙醇（100%），混匀后放在一20℃冰箱中沉淀过夜。

13、离心收集mtDNA，真空干燥后溶于2.0ml的TE缓冲液,

加入40ul（10mg/ml）的DNA一freeRNaseA溶液置37℃水浴中保温60分钟。

14、消化液再用氯仿:

异戊醇抽提2一3次。

水相加乙醇沉.淀DNA，并将离心收集的mtDNA经真空干燥后，溶于适量的TE缓冲液中，贮于—20℃冰箱备用。

（2）线粒体COI基因的克隆

1．PCR扩增

（1）在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。

10×

PCRbuffer5μl

dNTPmix（2mM）4μl

引物1（10pM）2μl

引物2（10pM）2μl

Taq酶（2U/μl）1μl

DNA模板（50ng-1μg/μl）1μl

加ddH2O至50μl

视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油（防止PCR过程中蒸发）。

（2）调整好反应程序。

将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上，执行扩增。

一般：

在93℃预变性3-5min，进入循环扩增阶段：

93℃变性40s→58℃退火30s→72℃延伸60s，循环30-35次，最后在72℃保温7~10min。

2、1%的琼脂糖凝胶电泳：

（1）制胶（以60mL为例）

A、称取0.6g琼脂糖，加入60ml的TAE缓冲液（pH8.0），摇匀；

B、电炉加热，至琼脂糖完全溶解（要防止过热溢出三角瓶;

用东西盖上，防止挥发）；

C、将制胶板放入制胶槽中，插入适当的梳子，将溶解的琼脂糖（约50℃）加入2ulEB后，混均匀，倒入其中，直至厚度为4～6mm（如有气泡要把气泡赶出），在室温下冷却凝固（约30~45min）；

D、将制胶板置于电泳槽中，小心垂直向上拔出梳子，以保证点样孔完好。

（2）点样

（如在反应管中加有石蜡油，需用100μL氯仿进行抽提反应混合液，以除去石蜡油；

否则，直接取5-10μl电泳检测）

用移液枪将5µ

l含溴酚蓝的扩增产物加入点样孔下部。

（3）电泳

打开电源开关，调节电压至3~5V/cm（约100V），可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动，约30-40分钟后即可观察结果。

（4）观察

将电泳好的胶置于紫外透射检测仪上，打开紫外灯，可见到橙红色核酸条带，根据条带粗细，可粗略估计该样品DNA的浓度。

如同时有已知分子量的标准DNA（mark）进行电泳，则可通过性DNA条带的相对位置初步估计样品的分子量。

3、大肠杆菌感受态细胞HB101的制备及转化

准备：

一.材料

E.coliDH5α菌株:

Rˉ,Mˉ,Ampˉ；

pBS质粒DNA:

购买或实验室自制，eppendorf管。

　　二.设备　　

恒温摇床,电热恒温培养箱,台式高速离心机,无菌工作台,低温冰箱,恒温水浴锅,制冰机,分光光度计,微量移液枪。

3.试剂　　

1.LB固体和液体培养基

2.Amp母液　

3.含Amp的LB固体培养基:

将配好的LB固体培养基高压灭菌后冷却至60℃左右,加入Amp储存液,使终浓度为50ug/ml,摇匀后铺板。

4.麦康凯培养基（MaconkeyAgar）:

取52g麦康凯琼脂,加蒸馏水1000ml,微火煮沸至完全溶解,高压灭菌，待冷至60℃左右加入Amp储存液使终浓度为50ug/ml,然后摇匀后涂板。

5、0.05mol/LCaCl2溶液:

称取0.28gCaCl2（无水,分析纯）,溶于50ml重蒸水中,定容至100ml,高压灭菌。

6.含15%甘油的0.05mol/LCaCl2:

称取0.28gCaCl2（无水,分析纯）,溶于50ml重蒸水中,加入15ml甘油,定容至100ml,高压灭菌。

操作步骤：

（1）受体菌的培养　　

从LB平板上挑取新活化的E.coliDH5α单菌落,接种于3-5mlLB液体培养基中,37℃下振荡培养12小时左右,直至对数生长后期。

将该菌悬液以1:

100-1:

50的比例接种于100mlLB液体培养基中,37℃振荡培养2-3小时至OD600＝0.5左右。

（2）感受态细胞的制备（CaCl2法）　

A、将培养液转入离心管中,冰上放置10分钟,然后于4℃下3000g（离心力）离心10分钟。

B、弃去上清,用预冷的0.05mol/L的CaCl2溶液10ml轻轻悬浮细胞,冰上放置15-30分钟后,4℃下3000g离心10分钟。

C、弃去上清,加入4ml预冷含15%甘油的0.05mol/L的CaCl2溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。

D、感受态细胞分装成200μl的小份,贮存于-70℃可保存半年。

（3）转化　　

A、从-70℃冰箱中取200μl感受态细胞悬液,室温下使其解冻,解冻后立即置冰上。

B、加入pBS质粒DNA溶液（含量不超过50ng,体积不超过10μl）,轻轻摇匀,冰上放置30分钟后。

C、42℃水浴中热击90秒或37℃水浴5分钟,热击后迅速置于冰上冷却3-5分钟。

D、向管中加入1mlLB液体培养基（不含Amp）,混匀后37℃振荡培养1小时,使细菌恢复正常生长状态,并表达质粒编码的抗生素抗性基因（Ampr）。

E、将上述菌液摇匀后取100μl涂布于含Amp的筛选平板上,正面向上放置半小时,待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿,37℃培养16-24小时。

同时做两个对照:

对照组1:

以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,其它操作与上面相同。

此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现。

对照组2:

以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,但涂板时只取5μl菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。

（4）计算转化率　　

统计每个培养皿中的菌落数。

转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率，公式如下：

转化子总数＝菌落数×

稀释倍数×

转化反应原液总体积／涂板菌液体积　

转化频率（转化子数／每mg质粒DNA）＝转化子总数／质粒DNA加入量（mg）　　感受态细胞总数＝对照组2菌落数×

菌液总体积／涂板菌液体积　

感受态细胞转化效率＝转化子总数／感受态细胞总数　　

[注意]本实验方法也适用于其它E.coli受体菌株的不同的质粒DNA的转化。

但它们的转化效率并不一定一样。

有的转化效率高，需将转化液进行多梯度稀释涂板才能得到单菌落平板,而有的转化效率低,涂板时必须将菌液浓缩（如离心）,才能较准确的计算转化率。

14、pUC19质粒DNA的制备

16、southern转移及杂交系统的制备

注意

（A）加人适量的DNasel处理粗提的线粒体，以消除粘附在线粒体颗粒表面的核DNA;

（B）用新鲜的而不是用冰冻的鱼肝组织提取mtDNA。

因为我们在实验中注意到，用冰冻的肝组织往往得率低，而且核DNA的污染也更为严重，这可能同冰冻组织核膜容易破裂有关;

（C）选用疏松的玻璃匀浆器取代电动高速匀浆器作缓和的匀浆，一般上下匀浆3一4次即可。

如此操作既可使细胞膜破裂释放出线粒体颗粒，又可避免或减少细胞核膜的破裂。

这样便很好地解决了核DNA的污染问题，得到了纯化的草鱼和鲤鱼mtDNA。

纯化的mtDNA酶切效果好，经琼脂糖凝胶电泳后，DNA谱带清晰，明显无背景核DNA的污染。

此外，按我们发展的程序纯化鱼肝组织的mtDNA，通常每100克鲜肝组织的得率可达30一50微克mtDNA，而且避免了氯化艳密度梯度离心法药品昂贵、设备复杂、实验周期长等多方面的缺点。

琼脂糖凝胶电泳的制备

一、实验原理

溴化乙锭（EB）为扁平状分子，在紫外照射下发射荧光。

EB可与DNA分子形成EB-DNA

复合物，其发射的荧光强度较游离状态EB发射的荧光强度大10倍以上，且荧光强度与DNA

的含量成正比。

用肉眼观察，可检测到5ng以上的DNA。

1．影响DNA在琼脂糖凝胶中迁移速率的因素：

1）DNA分子大小迁移速率U与logN成反比（N为碱基对数目）。

分子大小相等，电荷基本相等（DNA结构重复性）。

分子越大，迁移越慢。

等量的空间结构紧密的电泳快（超螺旋>

线性DNA）

2）琼脂糖浓度：

不同的凝胶浓度，分辨不同范围的DNAAgarose：

0.5%：

1-30kb；

0.7%：

0.8-12kb1.2%：

0.4-7kb；

1.5%：

0.2-3kb.

3）DNA构象：

一般迁移速率超螺旋环状>

线状DNA>

单链开环

4）所加电压：

低电压时，线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。

使分辨效果好，凝胶上所加电压不应超过5V/cm

5）碱基组成与温度：

一般影响不大4-30℃

6）嵌入染料的存在：

降低线性DNA迁移率，（不提倡加在电泳液中）

7）电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的迁移率，无离子存在时，核酸基本不泳动，离子强度过大产热厉害，熔化凝胶并导致DNA变性，一般采用1×

TAE，1×

TBE，1×

TPE（均含EDTApH8.0）。

2．溴化乙锭（EB）为致癌剂，操作时应戴手套，尽量减少台面污染。

3．电泳指示剂：

核酸电泳常用的指示剂有两种，溴酚蓝呈蓝紫色；

二甲苯晴呈蓝色，它携带的电荷量比溴酚蓝少，在凝胶中的的迁移率比溴酚蓝慢。

4、电泳缓冲液：

TAETBE

TAE与TBE不同之处在于TBE用硼酸代替了TAE中的冰醋酸。

植物基因组DNA提取方法

植物基因组DNA的提取通常采用机械研磨的方法，由于植物细胞匀浆含有多种酶类（尤其是氧化酶类）对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂（如巯基乙醇）以降低这些酶类的活性。

在液氮中研磨，材料易于破碎，并可减少研磨过程中各种酶类的作用。

十二烷基肌酸钠（sarkosyl）、十六烷基三甲基溴化铵（hexadyltrimethylammomumbromide，简称为CTAB）、十二烷基硫酸钠（sodiumdodecylsulfate，简称SDS）等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。

再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸（DNA、RNA）水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。

上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物总DNA溶液。

一.CTAB法

CTAB（十六烷基三乙基溴化铵）是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（（0.7mol/LNaCl）是可溶的，当降低溶液盐浓度到一定程度（0.3mol/LNaCl）时，从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB-核酸的复合物与蛋白，多糖类物质分开。

最后通过乙醇或异丙醇沉淀DNA，而CTAB溶于乙醇或异丙醇而除去。

1.试剂准备

（1）2×

CTAB抽提缓冲溶液:

100mmol/LTris-HCl（pH8.0），20mmol/LEDTA-Na2，1.4mol/LNaCl，2%CTAB，使用前加入0.1%（V/V）的β-巯基乙醇。

（2）TE缓冲液：

10mmol/LTris-HCl,1mMEDTA（pH8.0）。

（3）DNase-freeRNaseA:

溶解RNaseA于TE缓冲液中，浓度为10mg/mL，煮沸10～30min,除去DNase活性，-20℃贮存。

（4）氯仿-异戊醇混合液（24:

1，V/V）：

240mL氯仿（A.R.）加10mL异戊醇（A.R.）混匀。

（5）3mol/L乙酸钠（NaAc，pH6.8）：

称取NaAc•3H2O81.62g，用蒸馏水溶解，配制成200mL，用HAc调pH至6.5。

2.实验步骤

（1）在2mL离心管中，加入500μl的2×

CTAB和20μlβ-巯基乙醇,65℃预热。

（2）称取新鲜叶片1-2g，用蒸馏水冲洗干净，再用无菌ddH2O冲洗2次，放入经液氮预冷的研钵中，加入液氮研磨至粉末状，用干净的灭菌不锈钢勺转移粉末到预热的离心管中，总体积达到1mL混匀后置65℃水浴中保温45-60min，并不时轻轻转动试管。

注：

冻存材料直接研磨，绝对不能化冻。

而且粉末应在化冻前转移否则内源性Dnase有可能降解基因组DNA。

（3）加入1/10体积的3mol/L的乙酸钠充分混匀，在冰浴中放置30min中，4°

C12000rpm离心5min，吸上清。

注意，对于幼嫩叶片此步可以省略。

对成熟的老叶片需采用。

（4）加等体积的氯仿/异戊醇（24：

1），轻轻地颠倒混匀，室温下12000rpm离心10min。

（5）移上清至另一新管中，用氯仿/异戊醇重复抽提一次。

（6）移上清至另一新管中，向管中加入1/10体积的RNaseA溶液，置37℃20-30min。

（7）氯仿/异戊醇抽提后，加入2倍体积的100%乙醇或0.7倍体积异丙醇，会出现絮状沉淀，-20℃放置30min，12000rpm离心10-15min回收DNA沉淀。

（8）用70%乙醇清洗沉淀两次，吹干后溶于适量的灭菌TE缓冲液中。

（9）0.8%琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的完整性。

用紫外分光光度计测定DNA浓度。

二.SDS法

SDS法的基本原理是研磨的组织细胞用热的SDS裂解后，加入高浓度的KAc，0℃放置以除去蛋白和多糖类杂质，最后用乙醇或异丙醇沉淀。

（1）提取缓冲液

Tris-HCl100mmol/L（pH8.0）

EDTA50mmol/L（pH8.0）

NaCl500mmol/L

灭菌后加β-巯基乙醇至10mmol/L

（2）裂解液20%SDS

（3）高盐溶液5mol/LKAc

（4）RNaseA10mg/ml

（1）取幼嫩的组织材料1-2g,用蒸馏水冲洗干净，再用灭菌ddH2O冲洗2次，放入经液氮预冷的研钵中，加入液氮研磨至粉末状，用干净的灭菌不锈钢勺转移粉末到加有500μL提取液的离心管中,轻轻混匀。

（2）向管中加入50μL20%SDS溶液，混匀，不可过于强烈震荡以防基因组DNA断裂，65℃保温10min，并不时摇动。

（3）加入150μL5mol/LKAc，混匀，置冰上20-30min。

（4）4℃,15000rpm离心15min,转移上清到另一离心管中，加入0.7倍体积的异丙醇，混匀，-20℃沉淀30min。

（5）12000rpm离心10min回收基因组DNA沉淀，吹干后加入适量的灭菌ddH2O或TE溶解DNA。

（6）加入1/10体积的RNaseA，37℃保温20min，除去RNA。

（7）氯仿抽提后，加2倍体积乙醇，-20℃沉淀30min。

12000rpm离心10min回收基因组DNA沉淀。

（8）用400μL70%乙醇洗两次后，吹干，加入适量的灭菌ddH2O或TE溶解DNA。

（9）琼脂糖凝胶电泳检测完整性。

PHS—3C型精密PH计安全操作规程 

一.PH计使用前准备的工作 

1.使用PH计之前先用三蒸水清洗电极，注意玻璃电极不要碰碎。

2.准备在平台PH计的旁边放至调节用的NAOH液和HCL液。

3.在冰箱中拿出定PH液（PH=7.0）,放与平台上。

4.打开PH计，调定PH值，按︿﹀键选择PH和CAL选项，选择其中的CAL项，调节插入到PH液（PH=7.0）中，按<

>

键选择数据值到7.0处，出现小八叉即可。

5.将玻璃电极插入到待测的溶液中，再放入另一电极，适当的搅动液面（注意：

不要碰碎玻璃电极）。

6.PH计的电子单元使用必须注意电路的保护，在不进行PH值测量时，要将PH计的输入短路，以避免PH计的损坏。

7.PH计的玻璃电极插座必须保持干净、清洁和干燥，不能接触盐雾和酸雾等有害气体，同时严禁玻璃电极插座上沾有任何的水溶液，以避免PH计高输入阻抗。

8.未到你需要的PH值时要小心的加如NAOH液和HCL液，（据调节范围不同可以选择不同浓度的调节液，浓度小时可以快加，浓度大时要加慢）。

9.加液时小心不要超过所需的定容量。

二.PH计使用方法 

1.后盖打开，装入电池一块。

2.装上复合玻璃电极注意：

（1）复合电极下端是易碎玻璃泡，使用和存放时千万要注意，防止与其它物品相碰。

（2）复合电极内有KCl饱和溶液作为传导介质，如干涸结果测定不准必须随时观察有无液体，发现剩余很少量时到化验室灌注。

（3）复合电极仪器接口决不允许有污染，包括有水珠。

（4）复合电极连线不能强制性拉动，防止线路接头断裂。

3.打开电源开关后，再打到PH测量档。

4.用温度计测量PH6.86标准液的温度，然后将PH计温度补偿旋钮调到所测的温度值下。

5.将复合电极用去离子水冲洗干净，并用滤纸擦干。

6.将PH6.86标准溶液2～5ml倒入已用水洗净并擦干的塑料烧杯中，洗涤烧杯和复合电极后倒掉，再加入20mlPH6.86标准溶液于塑料烧杯中，将复合电极插入于溶液中，用仪器定位旋钮，调至读数6.86，直到稳定。

应该注意以下两点：

（1）必须用PH6.86标准调定位。

（2）调完后，决不能再动定位旋钮。

7.将复合电极用去离子水洗净，用滤纸擦干，用温度计测量PH4.00溶液的温度，并将仪器温度补偿旋钮调到所测的温度值下。

8.将PH4.00标准溶液2～5ml倒入另一个塑料烧杯中，洗涤烧杯和复合电极后倒掉，再加入20mlPH4.00标准溶液，将复合电极插入溶液中，读数稳定后，用斜率旋钮调至PH4.00。

应该注意斜率钮调完后，决不能再动。

9.用温度计测定待测液温度，并将仪器温度补偿调至所测温度。

10.将复合电极插入待测溶液中，读取PH值，即为待测液PH值。

（1）测定时温度不能过高，如超过40℃测定结果不准，需用烧杯取出稍冷。

（2）复合电极避免和有机物接触，一旦接触或沾污要用无水乙醇清洗干净。

11.注意事项：

仪器在使用前必须进行校准，即以上4～8款操作。

如果仪器不关机，可以连续测定，一旦关机就要校准。

但12小时即使不关机也必须校准一次。

三.PH计使用时注意事项 

1.一般情况下，ph计仪器在连续使用时，每天要标定一次；

一般在24小时内仪器不需再标定。

2.使用前要拉下ph计电极上端的橡皮套使其露出上端小孔。

3.标定的缓冲溶液一般第一次用pH=6.86的溶液，第二次用接近被测溶液pH值的缓冲液，如被测溶液为酸性时，缓冲液应选pH=4.00；

如被测溶液为碱性时则选pH=9.18的缓冲液。

4.测量时，电极的引入导线应保持静止，否则会引起测量不稳定。

5.电极切忌浸泡在蒸馏水中。

PH计所使用的电极如为新电极或长期未使用过的电极，则在使用前必须用蒸馏水进行数小时的浸泡，这样PH计电极的不对称电位可以被降低到稳定水平，从而降低电极的内阻。

6.PH计在进行P