马铃薯组培苗工厂化高效快繁规程.docx
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马铃薯组培苗工厂化高效快繁规程
马铃薯组培苗工厂化高效快繁技术
马铃薯组培苗工厂化高效快繁技术
摘要：
本文介绍了我系在脱毒马铃薯快繁上的生产技术，较常规马铃薯快繁技术有所改进，本文就马铃薯从培养基制作、接种技术到温光湿控制到瓶装苗及其污染控制、消毒灭菌和日常管理等方面介绍了马铃薯脱毒苗快繁生产管理技术要点和应注意的问题，以求达到工厂化高效快繁目的。
关键词：
马铃薯，组培苗，高效，快繁，工厂化生产
江苏农林职业技术学院
农艺系王宇
二0一一年七月十五日
马铃薯组培苗工厂化高效快繁技术
一、前言
马铃薯是无性繁殖的，以前主要以营养器官薯块播种，极易感染病菌，种薯年年退化，种薯“退化”主要是由病毒引起的，通过茎尖分生组织培养及后期的良繁体系能够获得“无病毒”的“复壮”健康种薯。
我国从上世纪70年代初开始研究推广这一技术，现已作为一种成熟技术被广泛应用，实践证明用高质量的脱毒种薯可使产量增加30%-50%，我国近两年已加大生产和推广脱毒薯力度，无毒种薯已渐渐在主产区普及，推广种植面积达66．67万hm2，每年增效2．5亿元以上。
组织培养技术繁殖速度是一般常规方法所不能比的，它能在较短的时间20～25d内和较少的空间内由1瓶增殖至4～7瓶，马铃薯组培苗快繁技术是脱毒马铃薯原种大规模产业化生产的前提。
二、组培实验室的合理设计
（一）组培实验室组成：
母液配制室、培养基配制室、灭菌室、准备室、缓冲室、无菌操作室、培养室、药品存放室、储物室等。
（二）设计具体原则：
流水线设计布局合理，符合生产工艺流程和工作程序，便于操作，有利于提高生产效率、防止污染。
1.洗涤室洗涤各种玻璃器皿、培养瓶、试管和各种用具以及进行植物材料预处理的场所。
要求通风、干燥，室内要有上、下水设施，地面防潮防滑并便于清洗；内做大水槽若干。
2.培养基配制室配制化学试剂、培养基母液、培养基以及分装培养基和制备纯水和蒸馏水等的场所。
通风、干燥，配备大容量用电专用线路；上下水道畅通。
3.灭菌室进行培养基、无菌水和器械等高压灭菌的场所。
要求地面与墙壁必须能够忍受高湿状态，地面防滑、白瓷砖墙面；配备大容量用电线路等。
4.接种室接种室也称无菌操作室，是外植体的灭菌、培养材料的接种、转移、继代增殖、生根等无菌操作以及进行过滤灭菌和分装过滤灭菌培养基等工作的场所。
（1）接种室宜小不宜大，一般7～8平米，要求地面、天花板及四壁尽可能密闭光滑，易于清洁和消毒。
配置拉动门，以减少开关门时的空气扰动。
（2）接种室要求干爽安静，清洁明亮。
在适当位置吊装1～2盏紫外线灭菌灯，用以照射灭菌。
最好安装一小型空调，使室温可控，这样可使门窗紧闭，减少与外界空气对流。
（3）接种室应设有缓冲间，面积1m2为宜。
进入无菌操作室前在此更衣换鞋，以减少进出时带入接种室杂菌。
缓冲间最好也安一盏紫外线灭菌灯，用以照射灭菌。
5.培养室
培养材料和组培苗在人工控制温度、相对湿度和光照等条件下培养和生长的场所。
（1）大小：
根据需要培养架的大小、数目、及其他附属设备而定。
其设计以充分利用空间和节省能源为原则。
高度比培养架略高为宜，周围墙壁要求有绝热防火的性能。
（2）主要设备：
培养架（控温控光控湿）、摇床、培养箱、紫外光源等。
培养材料放在由金属制成培养架上培养。
（3）培养架一般设5层，最低一层离地高约lOcm，其他每层间隔30cm左右，培养架高1．7m左右。
其长度根据日光灯长度而设计，如采用40W日光灯，则长I．3m，30W的长lm，宽度一般为60cm。
（4）培养室最重要的因子是温度，一般保持在20—27℃左右，具备产热装置，并安装窗式或立式空调机。
（三）我系组培室平面简图
三、实验室设备配制
在植物组织培养过程中，所使用的器材种类较多，但它们通常可以分为通用器具、盛具、计量器械、灭菌器械、接种器械、培养器械等几种类型。
在使用这些容器、设备时，必须要了解它们的基本用途，并学会它们的基本用法。
例如，不能给容量瓶加热；必须用磨砂玻璃灯罩来熄灭正在燃烧的酒精灯；应该定期更换超净工作如的无菌滤膜等等。
详细操作可参考具体设备、容器的使用说明。
（一）通用器械
1.烧杯：
用来盛放、溶解化学药剂等。
常用的规格有50ml、100ml、250ml、500ml、1000ml。
2.烘箱：
用来烘干器械。
3.恒温水浴：
用来溶解琼脂等物质。
4.玻璃搅拌棒：
用来配制培养基。
5.洗耳球：
用来辅助吸取、转移少量液体。
6.冰箱：
用来贮存化学药剂、植物材料等。
7.牛角勺：
用来转移化学药剂。
8.玻璃漏斗：
用来过滤溶液。
9.剪刀：
用来修剪外植体或剪切嫩茎。
10.器械架：
在无菌操作期间用来放置灭菌的器械。
（二）各种盛具
1.搪瓷浅盘：
用来承载各种器械容器。
2.塑料盆：
用于清洗培养容器。
3.塑料筐：
用来盛放灭菌容器等物品。
4.纯水水桶：
用来存放去离子水或蒸馏水。
常用的规格有10L、20L。
5.塑料桶：
用来存放洗涤溶液、废弃溶液。
6.各种规格的磨砂试剂瓶：
用来盛放培养母液，以及各种植物生长物质。
（三）计量器械
1.量筒：
用来量取一定体积的液体。
常用的规格有25ml、50ml、100ml、500ml、1000ml。
2.容量瓶：
用来配制标准溶液。
常用的规格有50ml、100ml、500ml、1000ml。
3.大肚移液管：
用来吸取定量溶液。
常用的规格有1ml、5ml、10ml。
4.刻度移液管：
用来吸取定量植物生长物质溶液。
常用的规格有1ml、5ml、10ml。
5.移液管架：
用来放置、固定移液管。
6.酸度计：
用来检测培养基的pH。
7.药物天平：
用来称取配制培养基的药品。
8.分析天平：
用来称取少量有化学试剂，进行化学分析。
（四）灭菌器械
1.全自动高压灭菌锅：
对培养基、接种器材进行灭菌处理。
采用全自动高压灭菌锅会自动排气，传统高压灭菌锅需有专人看锅，否则灭菌完成后不及时排气会导致培养基过软。
2.酒精灯：
用来进行接种器材的表面灭菌。
3.细菌过滤器：
用来过滤不能进行高温灭菌的试剂溶液。
4.无菌滤纸：
用来汲取器材、植物材料表面的水分。
5.无菌脱脂棉：
用来进行器械、植物材料表面的灭菌处理。
6.真空泵：
用来吸滤灭菌。
7.紫外线灭菌灯：
用来对接种室、培养室、操作室等工作环境进行灭菌处理。
（五）接种器械
1.超净工作台：
用来过滤通过接种工作台面的空气，以便进行无菌操作。
采用洁净等级为100级的双人超净工作台，有效的降低了组培苗的污染率。
并带有高温灭菌器，替代了传统的用酒精灯来给剪刀镊子灭菌，大大提高了接种效率。
2.小型喷雾器：
装载灭菌药液，来给超净工作台等处喷雾灭菌。
3.钝头镊子：
在接种操作、继代培养时移取植物材料。
4.尖头镊子：
用来分离植物材料。
5.解剖刀：
用来切割植物材料。
6.打孔器：
用来切取大小一致的圆柱形植物材料。
7.双目显微镜：
在解剖较小的外植体时，用来观测材料。
8.细菌滤膜：
用来进行溶液的常温除菌。
9.接种针：
用来转移细胞团、愈伤组织。
（六）培养器械
1.直径15cm的广口型塑料培养瓶
（1）我们采用直径15cm的广口型塑料培养瓶，相比以前的125ml三角瓶、200ml玻璃瓶和250ml的塑料瓶，接种更便捷、迅速，单瓶接种量提高5～10株，又可提高培养基配制速度和接种速度。
（2）广口瓶口径大，瓶盖透光性好，有效灯光大部分是从上方直射下来；而三角瓶与250ml的塑料瓶瓶盖透光性差，有效灯光大部分是从瓶壁侧面折射进来，损失较多。
广口瓶瓶盖松，透气性好。
因此观察发现广口瓶中的马铃薯苗叶片较250ml塑料瓶中的大而浓绿。
2.LED灯管
采用LED红蓝光灯管，发热低、光效率高、能耗小。
而传统的荧光灯光谱广，大部分为植物不需要的光能，且散热量大，在夏天对空调的功率要求较大，小匹量空调难以将室内温度降低到适宜范围内。
（七）其它设备
1.自动灌装机
我们采用灌装机HT-50型灌装机，容积50升，三个人一天可配80升培养基。
如果完全采用人工的话，三人一天最多只能配制30～40升。
效率提高2倍以上。
2．洗瓶机
我们采用PLT-100组培专用洗瓶机，洗瓶能力：
采用清水里外冲冼，40-50瓶/分钟，适应50-350ml，PE瓶、玻璃瓶，半自动,每小时洗瓶1500只。
一般只需两个人。
而如果完全人工洗瓶子的话，四个人大约三个小时才洗1500只瓶子。
利用洗瓶机不仅节约了时间还节省人力，是人工洗瓶效率的近六倍。
四、培养基的制作
（一）培养基成分
快繁用培养基：
MS+蔗糖3%+琼脂0.7%，PH5.8。
蔗糖可使用食用白砂糖代替，以节约成本。
（二）MS母液配制与保存
母液（号）
成分
规定浓度（mg/L）
称取量
g/L
每升吸取量ml
母液1
（50倍液）
NH4NO3
1900
82.5
20
KNO3
1650
95
MgSO4·7H2O
370
18.5
蒸馏水
1000ml
母液2
（100倍液）
CaCl2·2H2O
440
44.0
10
蒸馏水
1000ml
母液3
（100倍液）
KH2PO4
170
17.0
10
蒸馏水
1000ml
母液4
铁盐
（100倍液）
EDTA-Na2
37.3
3.73
10
FeSO4·7H2O
27.8
2.78
蒸馏水
1000ml
母液5
微量元素
（100倍液）
H3BO3
6.2
0.62
10
MnSO4·H2O
22.3
2.230
ZnSO4·7H2O
8.6
0.86
KI
0.83
0.083
Na2MoO4·2H2O
0.25
0.025
CuSO4·5H2O
0.025
0.0025
CoCl2·6H2O
0.025
0.0025
蒸馏水
1000ml
母液6
有机物
（100倍液）
肌醇
100
10
10
甘氨酸
2
0.2
烟酸
0.5
0.050
盐酸吡哆（V.B6）
0.5
0.050
盐酸硫胺（V.B1）
0.1
0.010
蒸馏水
1000ml
1.配制培养基母液时注意事项：
①一些离子易发生沉淀，可先少量水溶解，在按配方顺序依次混合；
②配制母液时用蒸馏水或重蒸馏水；
③药品应用化学纯或分析纯；
④溶解生长素时，可用少量0．5–1N的NaOH或95%酒精溶解，溶解分裂素类用0．5–1N的HCl加热溶解。
如再加蒸馏水，易产生白色沉淀，此时可加入热水。
2.母液的保存
装瓶：
将配制好的母液分别装入试剂瓶中，贴好标签，注明各培养基母液的名称、浓缩倍数、日期。
贮藏在4℃冰箱中。
（注意将易分解、氧化者，放入棕色瓶中）
（三）培养基的配制
1.量取母液、白砂糖、琼脂
（1）在使用提前配制的母液时，应在量取各种母液之前，轻轻摇动盛放母液的瓶子，如果发现瓶中有沉淀、悬浮物或被微生物污染，应立即淘汰这种母液，重新进行配制；
（2）用量筒或移液管量取培养基母液之前，必须用所量取的母液将量筒或移液管润洗2次；
（3）量取母液时，最好将各种母液按将要量取的顺序写在纸上，量取1种，划掉1种，以免出错。
2.混合、定容
生产上可用普通的自来水代替蒸馏水定容。
3.调节PH
PH如果较低，培养基过稀（成糊状），影响接苗质量和幼苗生长；相反，如果PH较大则使培养基较硬，茎段不易插入培养基中，且阻碍营养物质的扩散吸收。
PH以5.8为宜。
采用PH计，与PH试纸相比可更加精确。
配制10升以上的大量培养基时，可滴加1mol/LNaOH和1mol/LHCl。
4.培养基的分装
可省去加热熬制琼脂过程，可节约电能且不影响培养基质量。
采用灌装机，一次可配40升培养基，且分装均匀，效率高。
5.培养基的灭菌
（1）灭菌条件：
121℃108kPa20min。
（2）我们采用自动式立式高压灭菌锅，自动排气，可防止灭菌结束后排气不及时而导致PH下降使培养基过软的情况。
排气完后及时从高压灭菌锅中取出培养基，及时推进培养室内的架子上晾干，三天后确定无污染再使用。
五、接种操作
（一）准备工作
1.进入操作间前更换工作服，戴上口罩、鞋套。
2.准备75%酒精、灭菌用脱脂棉以及准备接种工具、无菌纸、待接培养基、接种母苗等。
3.打开超净工作台紫外灯、风机和灭菌器，将剪刀镊子插入加热器。
15min后关闭紫外灯。
10min后再进入正式接种。
（二）接种步骤
1.接苗前用棉球蘸酒精擦拭双手、台面，用镊子从信封中取出无菌纸，接苗：
包括取苗、切苗和接苗三步。
2.取苗：
先把灭菌过的培养基放在超净工作台上，然后拧开脱毒苗瓶的口，用已灭菌过的剪刀将脱毒苗瓶中的小苗从基部剪断，夹出瓶口，只留根部在瓶内；
3.切苗：
左手用镊子夹苗，右手拿剪刀剪取1～2cm长带一两个叶片的茎
段；
4.接苗时尽量使苗分布均匀，一般外圈12株，中圈5株，内圈3株共20株左右，注意接苗时培养基瓶口朝里、镊子尽量不要碰到瓶口。
然后盖上盖子。
（三）记录与打扫
1.接完苗后，把品种代号、个人编号以及接种日期标示到瓶上，并搬到培养室内，同时在记录本上记录品种代号、个人编号以及接种日期、转前瓶数和转后瓶数，以备调查。
2.离开之前还要把工作台收拾干净，把剪刀镊子取出放入95%酒精中浸泡。
把接种过程中产生的垃圾清理掉，台上的物品也要摆放整齐。
六、培养条件管理
（一）培养条件
刚刚接种的苗需按培养两天有利于生根；有一定的昼夜温差有利于马铃薯试管苗健壮生长，温度白天24℃，夜间18℃为宜；光照16小时，光强2000M烛光（即两个15W的荧光灯），如果苗瘦弱、徒长可增强光照，加一两根灯管。
PH以5.8为宜，PH如果较低，培养基过稀（成糊状），影响接苗质量和幼苗生长；相反，如果PH较大则使培养基较硬，茎段不易插入培养基中，且阻碍营养物质的扩散吸收。
培养室湿度不宜过大，过大利于病菌繁殖，阴雨天或拖地后应打开除湿器。
（二）继代次数及繁殖速率
试管苗一般每间隔20～25天切转一次，扩繁率一般为4-6倍。
从理论上推算，按一年继代12次，每次以最低扩4倍计算，1株试管苗一年后可扩繁至16777216株，由此可见试管苗微繁殖的潜力很大，但是由于设备、空间、人力条件和技术上的原因，在实际操作时远达不到这种繁殖速率。
七、日常管理
（一）．培养器皿的清洗：
1．洗涤剂：
肥皂、洗洁精、洗衣粉和铬酸洗涤剂。
一般用洗衣粉即可。
2．新购置的玻璃器皿由于它们或多或少含有游离碱性物质，使用前先用1%稀盐酸内浸泡一夜，然后用肥皂水洗净，清水冲洗，最后用蒸馏水冲淋一便，干后备用。
3．对已被霉菌等杂菌污染的玻璃器皿则必须现在121℃高压蒸汽灭菌30分钟后再清洗。
4．洗净的玻璃器皿应晾几天，透明发亮、内外壁水膜均匀，不挂水珠。
（二）污染防治
1.操作人员应注意个人整洁，勤剪指甲，操作时头、胳膊等不应进入超净工作台内。
操作时不应随意谈话、说笑，以减少污染。
工作人员出入应随手关门。
2.每次配培养基完后及时打扫培养基配制室，每次接种完后及时收拾工作台台面、打扫地面，并于当天及时倒掉垃圾篓垃圾。
3.每周末将接种室、培养室彻底打扫一遍，用吸尘器除尘，再用新洁尔灭消毒液稀释成0.1%的溶液拖地；再把室内所有紫外灯打开，工作人员快速离开无菌室，灭菌25~30min，如发现湿度过大，可打开除湿器。
4.将工作服、口罩、拖鞋每周清洗一次，盛装75%的酒精瓶、剪刀、镊子每周放入高压灭菌锅中灭一次菌；
5.无菌室刚开始工作或间隔1～2个月未进行消毒时，须先把高锰酸钾倒入培养皿，再倒入甲醛，关闭门窗进行熏蒸消毒，间隔1~2d即可在室内工作。
（三）定期检查
接种期间，每天巡视培养室，一旦发现有污染的瓶苗，必须马上将其拿出培养室，并放入高压灭菌锅灭菌，然后用加入适量洗衣粉的热水涮洗苗瓶，并换水冲洗，然后倒置铁架上晾干水珠待用。
平时定期巡视，发现有灯管坏掉或时控器失效的应及时更换。
八、常见问题及解决措施
（一）培养基的配制中常见问题
1.配制大量元素母液时残留不溶物可能原因：
Ca2＋与SO42－和HPO42－易反应生成CaSO4、CaHPO4等不溶性化合物沉淀。
解决办法：
将大量元素按钙盐、磷酸盐、其它盐分成三种母液。
在配培养基量取母液时，分别依次加入培养液中。
2.有机物母液在冰箱中贮存时易受真菌污染可能原因：
由于维生素母液营养丰富，有利于真菌繁殖，故易染菌，若试剂瓶不洁净则污染可能性更大。
染菌的维生素母液不但浓度有所降低而且容易给培养基造成真菌污染。
解决办法：
配制母液时用无菌水溶解维生素，贮存在灭过菌的试剂瓶中。
3.刚刚配制的铁盐溶液放入冰箱后出现结晶可能原因：
FeSO4与Na2-EDTA混合后以螯合物的形式存在，在配制铁盐溶液时如果搅拌的时间过短会造成FeSO4和Na2-EDTA没有螯合彻底，此时若将其放入冰箱中，由于温度降低，FeSO4就会结晶析出。
解决办法：
FeSO4与Na2EDTA分别溶解后混合，置于加热搅拌器上不断搅拌至溶液呈金黄色（约需30min），室温放置过夜后再移入冰箱中保存。
4.激素不易溶解可能原因：
许多植物激素都不易溶于水。
解决办法：
IAA、玉米素、IBA、GA3、多效唑等激素应先溶于少量95%乙醇中，再慢慢加水定容，如果加水后有结晶析出则可以考虑先用1/10体积的95%酒精溶解后再定容；2，4-D易溶于碱性水溶液，可用少量1mol/L的NaOH溶液溶解再慢慢加水定容；KT和6-BA应先用少量1mol/LHCl溶解，再加水定容至一定浓度。
（二）组培苗污染原因及解决措施
1、污染原因
马铃薯组织培养中：
常见的污染情况有细菌污染和真菌污染两大类，它们相应的污染源也就是细菌和真菌。
（1）细菌污染：
若在接苗前发现培养基污染，可能是培养瓶口不干净而带有不易被杀死的耐高压、高温的杂菌；或是高压锅漏气培养基灭菌不彻底造成的；若在接苗后外植体周围发现细菌污染，则可能是植物材料本身带菌引起的，也可能是接苗工具消毒不彻底或是操作不规范造成的；或者是在接苗前没有及时发现污染苗，在接苗过程中由于交叉感染造成的。
（2）真菌污染：
若在接苗前培养基表面存在大量真菌污染，多数情况是由于培养基瓶口封的不严或是培养基存放的环境中孢子浓度过大；培养基内部存在大量真菌污染，则可能是母液储备过程中已经被污染。
接苗后的培养基表面存在真菌污染而且位置不定，如果是初期，可能是因为接种室真菌孢子浓度过大或是操作台不干净；如果是接苗后期发现污染，主要是因为封口不严或是培养材料本身就携带有内生菌；在培养过程中发现外植体周围出现真菌污染，可能是因为外置体材料本身就带有菌，只是菌源太小，再接苗时肉眼无法识别，当接到新的培养基里之后，才引起感染；若在培养基中发现污染的真菌是零星分散在培养基中，则主要是培养基灭菌不彻底，或接种器械灭菌不彻底等造成的。
2、解决措施
（1）灭菌时，谨防高压灭菌锅漏气；升温和降温速度不能太快，这样可以避免灭菌不彻底的情况出现，如刚取出一锅培养基后，立即将新的培养基装入其中灭菌，极易造成灭菌不彻底。
（2）培养基灭菌完成后移到单独洁净的房间晾干，尤其不能放在洗涤室内，三天后确保无污染在接种。
（3）接种操作规范，（详见接种操作部分）。
（4）加强日常各个组培室的清洁消毒管理，详见日常管理部分。
（三）组培苗常见问题
1.马铃薯苗纤细瘦弱光照不足、温度过高、接种密度过大都会造成苗徒长瘦弱，或者组培瓶内湿度过大、瓶壁结水珠。
可采取增强光照、增大昼夜温差、降低接种密度的措施。
还可在培养基中添加0.01～0.1mol/LNAA或添加适量矮壮素。
2.马铃薯苗分叉较多、生有大量气生根、叶片极小原因是瓶盖堵塞不透气，导致瓶内累积乙烯等有毒气体、湿度过大。
这些苗应及时扔掉，或挑拣生长正常的底部茎段接种，否则转接到新的培养基后仍会产生类似状况，因为它会产生不正常的内源激素。
3.马铃薯苗根系数量少、不是呈须状而是短而直，有圆状疙瘩。
原因是培养基PH过大或生长素浓度偏大引起的。
参考文献：
1.王付欣;高效马铃薯茎尖脱毒、快繁及微型薯繁育技术研究[D];西北农林科技大学;2001年
2.赵佐敏,艾勇;马铃薯组培脱毒试管苗繁育技术[J];中国马铃薯;2003年05期
3.辛国斌;脱毒马铃薯实验室扩繁技术的改进与应用[J];中国马铃薯;2002年04期
4.周俊辉植物快速繁殖技术中存在的问题与对策1999（04）
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