腺病毒载体的构建.docx
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腺病毒载体的构建
腺病毒载体的构建
由第三章结果可知,基础状态下SOCS2在脂肪细胞中的表达水平较低,但是GH可以诱导SOCS2稳定高表达。
SOCS2高表达的同时,GH诱导的脂肪细胞分化因子和脂质代谢基因表达发生了变化。
为了研究SOCS2对GH调控脂肪细胞分化与脂质代谢的影响,需要通过一种途径实现SOCS2在脂肪细胞中持续高表达。
细胞导入外源基因是目前常用的方法,但是保证外源基因的高效表达需要合适的表达系统。
目前常用的有质粒、逆转录病毒、蔓病毒、腺病毒等外源基因表达系统。
质粒载体可以导入外源基因,但是质粒的转染效率很低,如何把目标基因导入靶细胞转录产物是质粒系统的最主要的问题。
逆转录病毒可以把目标基因整合到靶细胞基因组永久表达,但是逆转录病毒只能感染增殖期的细胞。
蔓病毒本身对脂肪细胞的感染率又比较低。
而腺病毒滴度高,适合外源基因大量表达,并且可插入较大的目的片段,对细胞类型限制较小,可感染非分裂期的细胞(VorburgerSAandHuntKK2002)。
另外腺病毒载体系统中pAdEasy系统操作比较简单(LuoJYetal.2007)。
本章克隆SOCS2基因,采用pAdEasy系统构建pAd-SOCS2载体,为SOCS2在脂肪细胞中高效表达,研究SOCS2对GH调控脂肪细胞分化与脂质代谢的影响奠定基础。
4.1材料
4.1.1样品、菌株、质粒及细胞株
脂肪组织取自6周龄昆白小鼠,小鼠购自第四军医大;E.coliDH5α菌株由本实验室保存;pAdTrack-CMV和pAdEasy-1质粒,E.coliBJ5183菌株由猪脂肪沉积与肌肉发育实验室赠送;人胚肾细胞株HEK293购于中国科学研究院上海细胞资源中心。
4.1.2主要试剂
限制性内切酶BglⅡ、XhoⅠ和蛋白Marker购自Fermentas公司;内切酶PmeI和PacI购自NEB公司;pMDTM18-T克隆载体、碱性磷酸酶CIPA购自Takara公司;穿梭质粒小提试剂盒购自Omega公司;琼脂糖凝胶回收试剂盒购自Bioflux公司;λ/HindIIIMarker购自天根公司;OptiMem优化培养液购自Gibico公司;脂质体LipofectamineTM2000购自Invitrogen公司。
载体测序和引物合成均由南京金斯瑞生物公司完成,其余材料和试剂来源同3.1。
4.2试验方法
4.2.1SOCS2基因克隆
4.2.1.1组织中总RNA提取
根据TakaraRNAisoPlus试剂说明提取组织中总RNA:
4.2.1.2cDNA第一链合成
同3.2.6
提取的总RNA反转录为总cDNA,表3-1为反应体系和操作流程:
表3-1cDNA第一链合成体系及操作过程
Table3-1RevertAidTMFirstStrandcDNASythesissystemandoperationprotocol
反转录合成cDNA第一链
总RNA
1.5μL
Primer:
Oligo(dT)18primer
1μL
DEPC处理水
9.5μL
轻微震荡混匀,65℃孵育5min,冰上冷却2min;瞬时离心收集反应液,置于冰上,按顺序加入以下试剂:
5×反应缓冲液
4μL
RiboLockTM核糖核酸酶抑制剂(20u/μL)
1μL
10MmdNTPs混合物
2μL
RevertAidTMM-MuLV反转录酶(200u/μL)
1μL
瞬时离心收集反应液,25℃孵育5min,42℃孵育60min;70℃5min终止反应,反应产物直接用于PCR或-20℃存放备用。
4.2.1.3SOCS2基因编码区(CDS)的扩增
依照扩增CDS全长的引物设计原则,根据Genbank公布的SOCS2基因序列(NM_007706.3),用PrimerPremier5.0软件设计SOCS2扩增引物,表4-1中SOCS2-F和SOCS2-R为SOCS2基因的扩增引物。
表4-1SOCS2CDS区扩增引物
Table4-1PrimersofSOCS2CDSsequence
Primernames
Primersequence(5-3)
SOCS2-F:
CGTGTTGACTCATCTCCC
SOCS2-R
CATAGCTGCATTCGGAGA
SOCS2-F-BglⅡ
GCAGATCTATGACCCTGCGGTGCCTGG
SOCS2-R-Flag-XhoⅠ
GCCTCGAGTTACTTATCGTCGTCATCCT
TGTAATCTACCTGGAATTTATATTCTT
4.2.1.4SOCS2CDS区的扩增体系和条件
用表4-1中的SOCS2-F和SOCS2-R引物,按照表4-2中的扩增体系和条件扩增SOCS2CDS区。
表4-2SOCS2CDS区的扩增体系和条件
Table4-2PCRamplificationsystemand
10×PCR缓冲液
1.25μL
dNTPMixture(各2.5mM)
2μL
上、下游引物(10μM)
各0.5μL
cDNA
1.3μL
ddH2O
7.45μL
瞬时离心收集反应液,按一下条件进行反应:
预变性(95℃)
5min
反应一:
(20个循环)
变性(95℃)
40s
退货(62℃,每个循环降0.5℃,共20循环)
40s
延伸(72℃)
50s
反应二:
(20个循环)
变性(95℃)
40s
退火(57℃)
40s
延伸(72℃)
50s
反应三:
延伸(72℃)
8min
反应结束后,样品直接用于电泳检测,或暂时存放于4℃,-20℃可存放一周
4.2.1.6SOCS2CDS区的T载体克隆及鉴定
依照TakarapMDTM18-T克隆载体操作说明,将胶回收的SOCS2CDS全长克隆至pMDTM18-T;
A.克隆反应体系和操作步骤如下表,样品添加及试剂融解均在冰上操作;
pMD18-T(50ng/μL)
1μL
插入的目的片段(0.1-0.3pmol)
3.5μL
dH2O
0.5μL
SolutionⅠ
5μL
B.瞬时离心,收集反应液。
16℃孵育过夜(>12h);将连接产物10μL加入到100μLDH5α感态中,冰浴30min;
C.42℃热击45s,迅速冰浴1min,此过程不可激烈晃动PCR管,否则影响转化效率;
D.加入1mLLB无抗性培养液,37℃、200rpm震荡培养1h;
E.室温、4000rpm离心5min,收集菌体;吸弃900μL培养液上清,用枪头吹打100μL余液,重悬菌体;
F.无菌条件下,将100μL菌液均匀的涂于含Amp的LB固体平板,37℃倒置培养;
E.培养约12h,无菌条件下,挑取单菌落于含Amp的LB液体培养液中,37℃、250rpm震荡培养过夜,提取穿梭质粒进行PCR检测;阳性克隆送至金斯瑞公司测序。
4.2.2DH5α感受态的制备(CaCl2)
无菌条件下,将冻存的DH5α划线接种于无抗性的LB固体平板上,37℃倒置、过夜培养,选取生长良好的单克隆接种于100mL无抗性的LB液体培养液中,于37℃、250rpm,震荡培养过夜(约16h);
A.从中吸取1mL菌液接种于100mL无抗性的新鲜培养液,37℃、250~300rpm培养2~3h,从2h开始不断对菌液测ODλ=600值,直至0.4≤ODλ=600≤0.6(0.45为最适OD值);
B.以下步骤必须均需无菌冰上操作,0.1MCaCl2和含15~20%甘油的0.1MCaCl2需要预冷处理;
C.取30mL菌液于50mL离心管,冰上冷却10min;
D.4℃4500rpm离心5min收集菌体;加3mL0.1MCaCl2溶液,枪头轻轻吹打,使菌体悬浮,冰上放置20min;
E.4℃4500rpm离心5min,收集菌体;加3mL含15~20%甘油的0.1MCaCl2,枪头吹打混匀菌体;每100μL分装一管,-80℃冻存。
4.2.3质粒转化
A.-80℃冻存的感受态,冰上融化或室温融化后立即置于冰上;
B.向100μL感受态中加入连接产物(含量≤50ng,体积≤10μL),摇匀,冰上静止30min;
C.42℃水浴热激90s,或37℃水浴5min,热击后迅速置于冰上,静止5min;操作过程不要有激烈摇动;
C.向离心管中加1mL无抗性LB培养基,混匀后,37℃250rpm振荡培养1h,细菌恢复正常生长,抗性基因开始表达;
D.将上述菌液4000rpm离心5min,弃去1mL上清,重悬菌体,菌液均匀涂于含相应抗性的LB固体平板,放置30min后,37℃倒置培养过夜。
4.2.4质粒的小量提取
挑取最新筛选的含有穿梭质粒的单克隆于含有相应抗性的LB培养基中,37℃300rpm激烈振荡培养12~16h,获得的新鲜菌液依照OmegaE.Z.N.A.质粒小量提取试剂盒的操作说明提取穿梭质粒,所有步骤均在室温下操作。
4.2.5重组穿梭穿梭质粒的构建
4.2.5.1SOCS2CDS区的PCR扩增和回收
以pMDTM18-SOCS2穿梭质粒为模板,表4-1中SOCS2-F-BglⅡ和SOCS2-R-Flag-XhoⅠ分别为上游和下游引物,按表4-2中的反应体系和操作步骤扩增SOCS2,所用引物带有所需要的酶切位点(下划线部分)和Flag标签(斜体部分)。
PCR产物用1%琼脂糖凝胶进行检测,切取含目的片段的胶块,按4.2.5步骤回收PCR产物,微量定量仪测定浓度待用。
4.2.5.2SOCS2基因和pAdTrack-CMV穿梭质粒的的双酶切及回收
以微量定量仪测定的浓度为参照,按下列体系对目的DNA进行BglⅡ和XhoⅠ的双酶切,穿梭质粒酶切体系:
10×Buffer
2μL
pAdTrack-CMV(0.5~1μg/μL)
6μL
BglⅡ
0.6μL
XhoⅠ
0.6μL
dH2O
10.8μL
SOCS2PCR产物酶切体系:
10×Buffer
2μL
SOCS2
11μL
BglⅡ
1μL
XhoⅠ
1μL
dH2O
15μL
瞬时离心收集反应液,37℃孵育5h,产物进行1%琼脂糖电泳,将酶切的获得的目的条带切下,按4.2.5步骤回收双酶切的DNA,测定浓度备用。
4.2.5.3SOCS2基因与pAdTrack-CMV穿梭质粒片段的连接
将双酶切后回收产物的质量浓度计算转化为摩尔浓度,目的DNA和穿梭穿梭质粒DNA以10:
1的摩尔比混合,T4连接酶连接,连接体系如下:
10×Buffer
2.5μL
SOCS2CDS(约0.3pmol)
5.5μL
CMV(约0.03pmol)
0.7μL
T4连接酶(350U/μL)
1μL
dH2O
15.3μL
瞬时离心收集反应液,16℃孵育过夜,取10μL连接产物按4.2.3步骤将重组穿梭穿梭质粒转化DH5α感受态,于含Kan(100μg/mL)的固体LB平板,37℃倒置培养过夜。
挑取生长良好的单克隆,于含15mLKan(100μg/mL)的LB液体培养基,37℃摇菌过夜,培养液浑浊后,取800μL菌液甘油(15~20%)冻存备用,其余用于穿梭质粒提取和后期检测。
4.2.5.4重组穿梭质粒的菌落PCR鉴定
取10μL单克隆摇菌获得的菌液,用无菌水稀释至100μL,以0.5μL稀释后的菌液为模板,用SOCS2CDS区的扩增引物为检测引物,按照SOCS2CDS的扩增参数和体系见表1,进行PCR扩增。
产物用1%琼脂糖凝胶检测,凝胶成像观察,依照扩增片段的大小,对挑取的单克隆做初级筛选,以备后续参考。
4.2.5.5重组穿梭质粒的小量提取
选取初级筛选正确的单克隆菌液,取5mL依照4.2.4步骤小量提取穿梭质粒。
4.2.5.6重组穿梭质粒的鉴定和测序
A.PCR鉴定:
用无菌水10倍稀释提取的重组穿梭质粒,取0.5μL作为模板,用SOCS2CDS区的扩增引物为检测引物,按照表4-1SOCS2CDS全长扩增的反应体系及参数进行PCR检测。
取5μLPCR产物进行琼脂糖凝胶检测,依照扩增片段的大小鉴定SOCS2是否与重组质粒连接。
鉴定正确的质粒用将酶切鉴定。
B.酶切鉴定:
重组质粒PCR鉴定正确的质粒,进行BglⅡ和XhoⅠ双酶切鉴定,体系:
重组质粒(0.5~1μg/μL)
5μL
BglⅡ
0.6μL
XhoI
0.6μL
10×Buffer
2μL
H2O
11.8μL
瞬时离心收集,37℃酶切5h,酶切产物取5μL,与2μL上样缓冲液混匀,于1%琼脂糖进行电泳检测,依照Mark大小判断是否酶切出大片段pAdTrack-CMV,和小片段SOCS2。
C.选择PCR与酶切鉴定均正确的质粒,送南京金斯瑞公司测序,测序结果与GenBank所公布的序列一致的,命为pAdTrack-CMV-SOCS2。
4.2.6pAd-SOCS2的构建
4.2.6.1E.coliBJ5183及含pAdEasy-1质粒的E.coliBJ5183感受态的制备
A.E.coliBJ5183感受态制备:
将-80℃冻存的E.coliBJ5183菌株,划线于含链霉素(30~50μg/mL)的LB平板,37℃倒置培养12~16h,如果菌液冻存时间过长,有必要进行二次活化,即挑取单克隆二次划线,最终获得的单克隆摇菌培养,CaCl2法制备感受态,具体步骤见4.2.2.
B.含pAdEasy-1质粒的BJ5183感受态制备:
依照4.2.3步骤将pAdEasy-1质粒转化于BJ5183感受态,涂于含Amp(100μg/mL)的LB平板,挑取单克隆于含Amp(100μg/mL)的液体LB培养基,待菌液浑浊后,同样用CaCl2法获得含pAdEasy-1质粒的BJ5183感受态,步骤见4.2.2。
4.2.6.2PmeⅠ酶切线性化pAdTrack-CMV-SOCS2和CIAP去磷酸化
小量提取质粒法获得质粒pAdTrack-CMV-SOCS2,用PmeⅠ酶切线性化,体系如下:
SOCS2重组质粒(≤4μg)
25μL
100×BSA
1μL
10×Buffer
10μL
内切酶
2μL
双蒸水
62μL
离心收集,37℃温浴8h,CIAP处理PmeⅠ单酶切的质粒,使其去磷酸化防止自我环化,体系如下:
线性化质粒
60μL(1~20pmol)
10×Buffer
10μL
CIAP
4μL
H2O
26μL
A.酶切反应:
37℃或50℃水浴30min,
B.抽提1:
加100μL有机溶液混合物Ⅰ(苯酚:
氯仿:
异戊醇比例为25:
24:
1),用手激烈摇动,使溶液成为乳浊液,12,000rmp离心6min,取上清液;重复此步骤一次;
C.抽提2:
加等体积(约100μL)的有机混合物Ⅱ(氯仿:
异戊醇比例为24:
1),摇动成乳浊液,离心后取上清;
D.乙醇沉淀:
加10μL即上清1/10体积的NaOAC(3M),250μL即上清2.5倍体积的-20℃预冷乙醇,-20℃冷浴1h;
E.收集和洗涤沉淀:
12000rpm离心12min;加200μL冷乙醇(70%)洗涤沉淀,12000rpm离心6min;
F.干燥、溶解核酸:
将离心管倒置于滤纸,待管内酒精挥发后,用30μL无菌双蒸水溶解沉淀,冻存备用。
4.2.6.3线性化的重组质粒与骨架质粒重组
取一管-80冻存的BJ5183感受态,室温溶化后迅速置于冰上,加10μL线性化的质粒到感受态细胞中,冰上静止30min,热击法将线性化质粒转化如BJ5183与骨架质粒pAdEasy-1进行重组,详细步骤见4.2.3。
转化产物涂于含Kan(100μg/mL)的LB平板,37℃培养约20h。
4.2.6.4重组质粒的筛选和初级鉴定
重组质粒筛选:
生长20h的平板上可以观察到大小不一的菌落,挑取较小的菌落接种于15mL含Kan(100μg/mL)的液体培养基,37℃振荡培养,菌液浑浊后,取800μL菌液加200μL80%甘油-80℃冻存,其余菌液用作后续鉴定。
重组质粒的初级鉴定即菌液PCR,步骤同4.2.6.4。
4.2.6.5重组质粒的小量提取
取5mL初级筛选正确的菌液,依照小量提取质粒的方法提取质粒,具体步骤见4.2.4。
获得的质粒微量定量仪测定浓度,以备后续使用。
4.2.6.6重组质粒的鉴定和测序
A.质粒PCR鉴定:
同4.2.5.6A。
B.PacI酶切鉴定:
PacI酶切小量提取的重组质粒,酶切反应体系如下:
10×BufferⅠ
1μL
重组质粒DNA(≤1μg)
6.5μL
100×BSA
0.2μL
PacI酶
0.5μL
H2O
11.8μL
离心收集反应液,37℃酶切5h后,65℃孵育20min,使酶失活;取4μL酶切产物,加2μL上样缓冲液,0.8%含EB琼脂糖凝胶进行检测,100V电泳1h后凝胶成像观察,以空穿梭质粒以骨架质粒的重组质粒为对照。
C.测序:
上述鉴定均正确的质粒,送南京金斯瑞公司测序,与GenBank比对后,把测序正确的质粒命名为pAd-SOCS2。
4.2.7大量pAd-SOCS2的获得和PacⅠ酶切线性化
BJ5183中的质粒提取率较低,所以将pAd-SOCS2转化DH5α,步骤详见4.2.3。
从Kan(100μg/mL)平板上挑取单克隆,于含Kan(100μg/mL)的100mLLB液体培养基中37℃250rpm摇菌。
待培养基浑浊后,取800μL菌液加200μL80%甘油冻存,其余菌液全部依照步骤4.2.4提取质粒pAd-SOCS2,再用PacⅠ酶大量酶切重组质粒,体系如下:
10×BufferⅠ
15μL
pAd-SOCS2
75μL
100×BSA
1.5μL
PacI(10,000U/mL)
3μL
dH2O
55.5μL
37℃孵育8h,以下步骤同4.2.6.2B-F。
4.2.8pAd-SOCS2的包装、扩繁和滴度测定
4.2.8.1细胞株HEK293的复苏与培养
A.取液氮冻存的HEK293,迅速于37℃中水浴解冻,期间不断晃动使离心管内溶液尽量受热均匀;
B.解冻细胞迅速加到7mL含10%胎牛血清的DMEM培养液中,7mL需要提前预热至37℃,枪头轻轻吹打,无细胞团存在,1300rpm离心6min,弃去上清;
C.向离心管中加2mL提前预热到37℃的含10%胎牛血清的DMEM培养液,吹打细胞使其悬浮,按照5×104将细胞接种于培养皿,于恒温37℃的5%CO2培养箱培养;
D.24h换液;以后每隔2d换液一次;细胞密度达90%时传代。
4.2.8.2pAd-SOCS2包装
转染前一天,按照每孔4×105个HEK293细胞接种到6孔板,培养24h后细胞约有70%融合,转染前4h,用无双抗PBS清洗2次细胞,将含血清的培养液换为无双抗无血清的优化培养液Opti-MEMI(2mL/孔);LipofectamineTM2000作为转染试剂将pAd-SOCS2转染至HEK293细胞,具体步骤依照说明书进行(所有试剂均为一个孔的试剂用量):
A.用Opti-MEMI优化培养液将4μg质粒稀释至250μL,室温孵育;
B.同样用Opti-MEMI优化培养液将10μLLipofectamineTM2000稀释至250μL,室温孵育5min;前两步操作不得超过25min;
C.将孵育的质粒和LipofectamineTM2000混匀,总体积为500μL,整个过程尽量轻柔,混合溶液室温孵育20min;
D.将500μL混合液加到培养板的一个孔中,轻轻晃动培养板混匀培养液;
E.37℃5%CO2培养箱培养,6h后将培养液换为含10%胎牛血清的DMEM培养液;其中6孔板的4个空按上述步骤进行包装,另外两个孔一个为脂质体对照,一个为空白对照。
F.转染24h后可在荧光显微镜下观察,记录细胞内的绿色荧光蛋白GFP的表达,观察细胞病变(Cytopathiceffect,CPE)情况。
转染8~10d后形成一般会有蚀斑出现,此时可将细胞刮下,将细胞收集在冻存管中,于-196℃(液氮中)和37℃反复冻融5次,12000rpm离心5min,收集的上清液即为病毒原液,直接用于后续细胞感染或于-80℃保存,将病毒液命名为Ad-SOCS2。
4.2.8.3Ad-SOCS2的扩繁
60mm培养皿培养细胞,待细胞融合至90%时,将培养皿中的培养液换为新鲜的10%FBSDMEM培养液,将300μL病毒原液加到培养皿中,轻轻晃动培养皿,加培养24h后观察细胞形态和荧光蛋白表达,待细胞病变后收取细胞,1500rpm离心6min收集细胞,加病毒保存液,于-196℃和37℃反复冻融五次,离心去除细胞碎片,根据所需病毒量,继续扩繁病毒或进行病毒滴度测定。
4.2.8.4Ad-SOCS2滴度测定
按每孔2×104个细胞的密度接种HEK293于96孔板中,采用TCID50法和Karbers法测定并计算Ad-SOCS2的病毒滴度。
将以倍比(10-1~10-10)稀释的病毒液感染细胞,每孔加100μL病毒稀释液,培养9~10d统计细胞的CEP病变。
依照Karbers公式即:
T=10×101+d(s–0.5)TCID50/mL计算病毒得滴度;其中s是阳性比率之和,也就是所用个稀释度之和。
d=log10稀释度=1(这是对于10倍的稀释度而言);并且根据公式:
T=1×10XTCID50/mL=1×10X–0.7PFU/mL,可将病毒滴度换为PFU/mL单位。
4.2.9数据统计及分析
试验所得数据用SPSS13.0统计软件中的One-wayANOVA进行方差分析和显著性检验,数据采用平均值标准差即Means±SD的形式表示。
4.3结果与分析
4.3.1SOCS2的克隆
提取小鼠皮下脂肪组织的总RNA,反转录获得总cDNA。
用表4-1中的SOCS2-F和SOCS2-R引物进行PCR扩增,获得大小约为700bp的片段(如图4-1A)。
凝胶回收试纯化纯化扩增片段(如图4-1B),T-A克隆至p-MD18载体,获得重组质粒p-MD18-SOCS2,将重组质粒送金斯特生物公司测序,测序结果与GenBank中的NM_007706.3序列进行比对,同源性为100%。
图4-1SOCS2基因PCR及胶回收产物的凝胶电泳分析
A.SOCS2基因的PCR产物;B.SOCS2基因的胶回收产物。
Fig.4-1SOCS2geneselectrophoresisanalysisofPCRproductandgelrecoveryproduct.
A.PCRproductofSOCS2genes;B.G