保护碱基添加总结.docx
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保护碱基添加总结
酶切位点保护碱基表6
酶
寡核苷酸序列
切割率%
2hr
20hr
PvuI
CCGATCGG
ATCGATCGAT
TCGCGATCGCGA
0
10
0
0
25
10
SacI
CGAGCTCG
10
10
SacII
GCCGCGGC
TCCCCGCGGGGA
0
50
0
>90
SalI
GTCGACGTCAAAAGGCCATAGCGGCCGC
GCGTCGACGTCTTGGCCATAGCGGCCGCGG
ACGCGTCGACGTCGGCCATAGCGGCCGCGGAA
0
10
10
0
50
75
ScaI
GAGTACTC
AAAAGTACTTTT
10
75
25
75
SmaI
CCCGGG
CCCCGGGG
CCCCCGGGGG
TCCCCCGGGGGA
0
0
10
>90
10
10
50
>90
SpeI
GACTAGTC
GGACTAGTCC
CGGACTAGTCCG
CTAGACTAGTCTAG
10
10
0
0
>90
>90
50
50
酶切位点保护碱基表2
关键词：
酶切位点保护碱基表2
酶
寡核苷酸序列
切割率%
2hr
20hr
NotI
TTGCGGCCGCAA
ATTTGCGGCCGCTTTA
AAATATGCGGCCGCTATAAA
ATAAGAATGCGGCCGCTAAACTAT
AAGGAAAAAAGCGGCCGCAAAAGGAAAA
0
10
10
25
25
0
10
10
90
>90
NsiI
TGCATGCATGCA
CCAATGCATTGGTTCTGCAGTT
10
>90
>90
>90
PacI
TTAATTAA
GTTAATTAAC
CCTTAATTAAGG
0
0
0
0
25
>90
PmeI
GTTTAAAC
GGTTTAAACC
GGGTTTAAACCC
AGCTTTGTTTAAACGGCGCGCCGG
0
0
0
75
0
25
50
>90
PstI
GCTGCAGC
TGCACTGCAGTGCA
AACTGCAGAACCAATGCATTGG
AAAACTGCAGCCAATGCATTGGAA
CTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT
0
10
>90
>90
0
0
10
>90
>90
0
PvuI
CCGATCGG
ATCGATCGAT
TCGCGATCGCGA
0
10
0
0
25
10
SacI
CGAGCTCG
10
10
SacII
GCCGCGGC
TCCCCGCGGGGA
0
50
0
>90
SalI
GTCGACGTCAAAAGGCCATAGCGGCCGC
GCGTCGACGTCTTGGCCATAGCGGCCGCGG
ACGCGTCGACGTCGGCCATAGCGGCCGCGGAA
0
10
10
0
50
75
ScaI
GAGTACTC
AAAAGTACTTTT
10
75
25
75
SmaI
CCCGGG
CCCCGGGG
CCCCCGGGGG
TCCCCCGGGGGA
0
0
10
>90
10
10
50
>90
SpeI
GACTAGTC
GGACTAGTCC
CGGACTAGTCCG
CTAGACTAGTCTAG
10
10
0
0
>90
>90
50
50
SphI
GGCATGCC
CATGCATGCATG
ACATGCATGCATGT
0
0
10
0
25
50
StuI
AAGGCCTT
GAAGGCCTTC
AAAAGGCCTTTT
>90
>90
>90
>90
>90
>90
XbaI
CTCTAGAG
GCTCTAGAGC
TGCTCTAGAGCA
CTAGTCTAGACTAG
0
>90
75
75
0
>90
>90
>90
XhoI
CCTCGAGG
CCCTCGAGGG
CCGCTCGAGCGG
0
10
10
0
25
75
XmaI
CCCCGGGG
CCCCCGGGGG
CCCCCCGGGGGG
TCCCCCCGGGGGGA
0
25
50
>90
0
75
>90
>90
酶
寡核苷酸序列
切割率%
2hr
20hr
AccI
GGTCGACC
CGGTCGACCG
CCGGTCGACCGG
0
0
0
0
0
0
AflIII
CACATGTG
CCACATGTGG
CCCACATGTGGG
0
>90
>90
0
>90
>90
AscI
GGCGCGCC
AGGCGCGCCT
TTGGCGCGCCAA
>90
>90
>90
>90
>90
>90
AvaI
CCCCGGGG
CCCCCGGGGG
TCCCCCGGGGGA
50
>90
>90
>90
>90
>90
BamHI
CGGATCCG
CGGGATCCCG
CGCGGATCCGCG
10
>90
>90
25
>90
>90
BglII
CAGATCTG
GAAGATCTTC
GGAAGATCTTCC
0
75
25
0
>90
>90
BssHII
GGCGCGCC
AGGCGCGCCT
TTGGCGCGCCAA
0
0
50
0
0
>90
BstEII
GGGT（A/T）ACCC
0
10
BstXI
AACTGCAGAACCAATGCATTGG
AAAACTGCAGCCAATGCATTGGAA
CTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT
0
25
25
0
50
>90
ClaI
CATCGATG
GATCGATC
CCATCGATGG
CCCATCGATGGG
0
0
>90
50
0
0
>90
50
EcoRI
GGAATTCC
CGGAATTCCG
CCGGAATTCCGG
>90
>90
>90
>90
>90
>90
HaeIII
GGGGCCCC
AGCGGCCGCT
TTGCGGCCGCAA
>90
>90
>90
>90
>90
>90
HindIII
CAAGCTTG
CCAAGCTTGG
CCCAAGCTTGGG
0
0
10
0
0
75
KpnI
GGGTACCC
GGGGTACCCC
CGGGGTACCCCG
0
>90
>90
0
>90
>90
MluI
GACGCGTC
CGACGCGTCG
0
25
0
50
NcoI
CCCATGGG
CATGCCATGGCATG
0
50
0
75
PCR引物设计原则
信息来源：
本站原创 更新时间：
2004-12-210:
44:
00
PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。
因此，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。
要设计引物首先要找到DNA序列的保守区。
同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构。
如这个区域单链能形成二级结构，就要避开它。
如这一段不能形成二级结构，那就可以在这一区域设计引物。
现在可以在这一保守区域里设计一对引物。
一般引物长度为15~30碱基，扩增片段长度为100~600碱基对。
让我们先看看P1引物。
一般引物序列中G+C含量一般为40%~60%。
而且四种碱基的分布最好随机。
不要有聚嘌呤或聚嘧啶存在。
否则P1引物设计的就不合理。
应重新寻找区域设计引物。
同时引物之间也不能有互补性，一般一对引物间不应多于4个连续碱基的互补。
引物确定以后，可以对引物进行必要的修饰，例如可以在引物的5′端加酶切位点序列；标记生物素、荧光素、地高辛等，这对扩增的特异性影响不大。
但3′端绝对不能进行任何修饰，因为引物的延伸是从3′端开始的。
这里还需提醒的是3′端不要终止于密码子的第3位，因为密码子第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。
综上所述我们可以归纳十条PCR引物的设计原则：
①引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。
②产物不能形成二级结构。
③引物长度一般在15~30碱基之间。
④G+C含量在40%~60%之间。
⑤碱基要随机分布。
⑥引物自身不能有连续4个碱基的互补。
⑦引物之间不能有连续4个碱基的互补。
⑧引物5′端可以修饰。
⑨引物3′端不可修饰。
⑩引物3′端要避开密码子的第3位。
PCR引物设计的目的是找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。
如前述，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。
对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保PCR的成功，但遵循某些原则，则有助于引物的设计。
1.引物的特异性
引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。
2.避开产物的二级结构区
某些引物无效的主要原因是引物重复区DNA二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。
用有关计算机软件可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。
实验表明，待扩区域自由能（△G°）小于58.6lkJ/mol时，扩增往往不能成功。
若不能避开这一区域时，用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。
3.长度
寡核苷酸引物长度为15~30bp，一般为20~27mer。
引物的有效长度：
Ln=2（G+C）+（A+T+，Ln值不能大于38，因为>38时，最适延伸温度会超过TaqDNA聚合酶的最适温度（74℃）,不能保证产物的特异性。
4.G+C含量
G+C含量一般为40%~60%。
其Tm值是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度，有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。
若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。
5.碱基础随机分布
引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。
尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。
6.引物自身
引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构牙引物本身复性。
这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。
若用人工判断，引物自身连续互补碱基不能大于3bp。
7.引物之间
两引物之间不应不互补性，尤应避免3′端的互补重叠以防引物二聚体的形成。
一对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性。
8.引物的3′端
引物的延伸是从3′端开始的，不能进行任何修饰。
3′端也不能有形成任何二级结构可能，除在特殊的PCR（AS-PCR）反应中，引物3′端不能发生错配。
在标准PCR反应体系中，用2UTaqDNA聚合酶和800μmol/LdNTP（四种dNTP各200μmol/L）以质粒（103拷贝）为模板，按95℃，25s；55℃，25s；72℃，1min的循环参数扩增HIV-1gag基因区的条件下，引物3′端错配对扩增产物的影响是有一定规律的。
A∶A错配使产量下降至1/20，A∶G和C∶C错七下降至1/100。
引物A：
模板G与引物G：
模板A错配对PCR影响是等同的。
9.引物的5′端
引物的5′端限定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。
因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。
引物5′端修饰包括：
加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。
10.密码子的简并
如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。
特殊目的的引物设计将在有关章节讨论。
随着人们对引物的认识，一些引物的计算机设计程序也应运而生，下面将讨论有关引物计算机设计方法。
PCR参数设定的基本原则
∙PCR知识
一个PCR反应开始，首先是双链DNA解离为单链，使之有利于与引物结合过程可以通过加热来完成。
在90—95℃条件下，即使复杂的DNA分子，如人基因组DNA也可变性成单链，根据模板DNA复杂程度，可以调整变性温度和时间。
一般情况下选择94‘C、30s可使各种复杂DNA分子完全变性。
过高温度或持续时间过长，对TaqDNA聚合酶活性和dNTP分子都会造成损害。
变性后的DNA很快冷却至40～60℃，即可使引物和模板DNA发生结合。
这是由于模板DNA结构比引物复杂得多，引物和模板之间碰撞的机会大大高于模板互补链之间的碰撞。
复性温度的选择，可以根据引物的长度和其G-+-C含量确定。
引物长度为15～25bp时，退火温度可通过Tm＝4X（G+C）+2X（Ad-T）计算得到。
在Tm允许的温度范围内，选择较高的退火温度可大大减少引物和模板之间的非特异结合，提高
PCR的特异性。
退火时间设置为30s，足以使引物和模板之间完全结合。
PCR反应的延伸温度为70—75℃，此时，TaqDNA聚合酶具有最高活性。
引物在16个核苷酸以下时，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。
可采用反应温度缓慢升高到70～75℃的方法。
因为在最初较低温度下，DNA聚合酶已催化延伸反应开始，随后的较高温度不会对“延长”过的引物和DNA模板的结合发生影响。
PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定。
一般lkb以内的片段，延伸时间lmin足够。
扩增片段在lkb以上则需增加延伸时间。
以上参数确定后，PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。
理论上20～25次循环后，PCR产物的积累即可达到最大值。
实际操作中由于每步反应的产率不可能达到完全，因此不管模板浓度多少，20～30次是比较合理的循环次数。
循环反应的次数越多，非特异性产物的量也会增加。
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