萜类化合物的合成生物学研究与展望论文Word下载.docx

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　　萜类化合物是自然界广泛存在的一大类异戊二烯衍生物（isoprenoids），主要从植物、微生物及海洋生物中分离得到。

萜类通式是（C5H8）n（n是异戊二烯的单元数）。

根据n的数目，萜类化合物可分为半萜（C5）、单萜（C10）、倍半萜（C15）、二萜（C20）、二倍半萜（C25）、三萜（C30）、四萜（C40）和多萜（n>

C40）[10].目前发现的萜类超过5万多种，常见的有单萜薄荷醇（menthol）、倍半萜青蒿素（artemisin-in）、二萜紫杉醇（taxol）、三萜人参皂苷（ginsenosi-de）、四萜类胡萝卜素化合物（carotenoids）等。

　　萜类有着重要的生物学功能和应用价值，见表1.现代医学研究发现，很多萜类都具有广泛的抗癌功效[11].来源于真菌属月光菌的倍半萜隐杯伞素S（illudinS）及其类似物伊洛福芬（irufloven）能够有效抑制转移性肾癌中的DNA合成[12].红豆杉属植物中的三环二萜化合物紫杉醇对卵巢癌和乳腺癌有明显的疗效[13].葫芦科来源的三萜化合物葫芦素（cucurbitacin）能够抑制癌细胞的生长，可与其他抗癌药物一起用于癌症治疗。

其中，葫芦素E具有抑制癌细胞增殖的功能，该结果已在膀胱癌、肝癌、胰腺癌、乳腺癌及白血病中得到证实[14,15].葫芦素B除了被证实具有抑菌和消炎活性，还能够抑制人类恶性肿瘤细胞的生长，包括乳癌细胞、头颈部鳞癌、胰腺癌、肝癌、骨肉瘤和骨髓性白血病[16-18].截至目前，已有多种葫芦科植物来源的葫芦素及葫芦素衍生物被分离出来[19].

　　萜类还具有消炎、降糖等广泛的药理作用。

研究发现，三萜皂苷类能够消炎、抗过敏、治疗白血病、抗病毒、降血糖以及防治心脑血管疾病等[20].2013年，人参皂苷化合物K（compoundK,CK）被我国药监局批准为防治关节炎的临床用药（CDEL20130379）。

Yan等[21]发现CK是三萜皂苷在哺乳动物血液和器官中发挥消炎、保肝、降糖及抗癌等功效的主要组分。

来源于菊科植物（俗称青蒿）的倍半萜内酯衍生物青蒿素不仅能够抗癌、消炎，还被发现是一种非常强大的抗疟疾药物，且不与其他抗疟药产生交叉耐药性[22].四萜化合物番茄红素（lycopene）是类胡萝卜素的一种，存在于番茄、西瓜、葡萄柚等的果实中，是一种很强的食用抗氧化剂，能够有效抑制脂质的氧化，清除羟自由基。

流行病学及临床医学实验发现，食用番茄红素不仅能够防治前列腺癌、乳腺癌、子宫癌、肺癌、膀胱癌、口腔癌、食道癌、胃癌、直肠癌及胰腺癌，还具有预防心脑血管疾病、延缓衰老等功效[23,24].

　　此外，很多植物源萜类化合物是芳香性挥发性物质，因此被广泛应用于香料、香水、调味剂及化妆品等行业[25].诺卡酮（nootkatone）、紫苏醇（sclareol）、薄荷醇（menthol）及芳樟醇（linalool）等芳香萜类是植物性精油的重要组成成分，也是果实芳香和植物花香等的气味来源，因此是芳香食品和精油类化妆品中常用的香料[26].

　　很多萜类是植物与昆虫协同进化过程中所产生的次生代谢产物，能够吸引传粉动物辅助植物授粉，抑或对昆虫有拒食作用，帮助植物抵御虫害和病原微生物，因此常被用于农药中[27].一些单萜如柠檬烯（limonene）和香叶烯（myrcene）均有很好的杀虫性，一些单萜烯类的衍生物如除虫菊酯（pyrethrin）则是非常高效的植物性杀虫剂[28].一些三萜如柠檬苦素类化合物（limonoids）也是很强的昆虫防御剂，被用作农作物的防虫害剂。

其他三萜类化合物，如葫芦素C、二萜水蓼二醛（polygodial）均参与了植物的抗虫功能[29,30].

　　萜类结构的多样性还使得其成为汽油、柴油等燃料的高级替代物。

事实上，倍半萜法尼烯（farnes-ene）和红没药烯（bisabolene），单萜蒎烯（pinene）和柠檬烯，半萜异戊烯醇（isopentenol）和异戊醇（isopentanol）均是公认的燃料及燃料的前体物[31].

　　1.2萜类化合物的合成

　　1.2.1萜类的生物合成途径植物源萜类化合物是植物中结构变化种类最多的一类天然产物，其在生物体中的合成可以由异戊二烯首尾相接，也可以通过异戊二烯成环形成[32].异戊二烯首先需要通过活化转化成异戊烯焦磷酸（isopentenylpyrophosphate,IPP）和二甲基丙烯基二磷酸（dimethylallylpyrophosphate,DMAPP）。

生物体内IPP和DMAPP的合成存在两种途径:

由3个乙酰辅酶A（Acetyl-CoA）形成的甲羟戊酸（mevalonateacid-dependent,MEV）途径以及由丙酮酸（pyruvate）或3-磷酸甘油醛（glyceraldehyde3-phosphate,G-3-P）缩合形成的甲基赤藓醇（2C-methyl-D-erythritol-4-phosphate,MEP/deoxyxylulose5-phosphate,DXP）途径，不同途径的选择取决于生物的种类以及合成产物的亚细胞空间位置[33].植物采用MEV和MEP/DXP两种途径来合成IPP和DMAPP（图1）。

其中，MEV途径主要用于植物细胞质中的倍半萜、三萜及多萜的合成，MEP/DXP途径主要用于植物质体中的单萜、二萜和四萜的合成[34,35].除了植物以外的其他真核生物均采用MEV合成IPP,并在IPP异构酶的作用下生成DMAPP.原核生物则主要通过MEP/DXP途径将G-3-P转变成IPP和DMAPP[36].

　　IPP和DMAPP是所有萜类的共同前体，一分子DMAPP和不同分子数的IPP在异戊烯转移酶（prenyltransferase）的作用下会进一步生成不同的萜类前体[37].这些前体在各种萜类合酶（terpenesynthases,TPS）的作用下会被合成种类各异的萜类骨架，因此，萜类合酶是不同萜类合成过程中的关键因子[38].不同萜类的合成途径如图1所示，具体如下:

（1）单萜:

一分子IPP和一分子DMAPP能够生成牻牛儿基焦磷酸（greanyldiphosphate,GPP）或橙花基焦磷酸（neryldiphosphate,NPP），GPP是无环单萜前体，NPP是单环单萜前体，它们在单萜合酶的催化下合成不同的单萜，如GPP在香叶醇合成酶的催化下能够产生无环单萜香叶醇（geraniol）；

NPP在柠檬烯合酶（limonenesynthase,LS）的催化下则会合成单环单萜骨架柠檬烯（limonene），并进一步经过氧化还原作用等反应合成单萜薄荷醇。

（2）倍半萜:

两分子IPP和一分子DMAPP生成倍半萜前体法呢基焦磷酸（fanesyldiphosphate,FPP），其在倍半萜合酶如紫穗槐-4,11-二烯合酶（amorpha-4,11-dienesynthase,ADS）的催化下生成青蒿素的前体紫穗槐二烯（amorphadiene）。

（3）二萜:

三分子IPP和一分子DMAPP产生二萜的前体牻牛儿牻牛儿基焦磷酸（greanylgeranyldiphosphate,GGPP），其在二萜合酶如紫杉烯合酶（taxadienesynthase,TXS）的催化下能够合成紫杉醇的前体紫杉-4（5），11（12）-二烯（taxadiene）；

（4）三萜:

倍半萜前体FPP在鲨烯合酶（squalenesynthase,SQS）的催化下合成鲨烯（squalene），鲨烯经鲨烯环氧酶（squaleneepoxidase,SQE）催化加氧转变成2,3-氧化鲨烯（2,3-oxidosqualene），并在不同的鲨烯环化酶（oxidosqulenecyclase,OSCs）的作用下环化形成三萜骨架，如β-香树素（β-amyrin）、羽扇豆醇（Lupeol）、葫芦二烯醇（Cucurbitadienol）等。

因此，不同种类三萜的合成取决于鲨烯环化酶的种类。

萜类骨架在细胞色素P450单加氧酶（cytochromeP450,CYP450）、CYP450辅酶（CYPreductase,CPR）、脱氢酶（dehydrogenases）、糖基转移酶（glycosyltransferase,GT）和酰基转移酶（acyltransferase,ACT）的作用下会进一步进行氧化、糖基化和酰基化等化学修饰，最终获得不同的萜类化合物，如膜甾醇、油菜素内酯、人参皂苷等[11].

　　1.2.2萜类的生产方法近年来，萜类化合物的合成研究成为了生物学领域的热点之一。

大规模生产高价值的萜类化合物是科研工作者和企业的共同目标。

目前萜类的生产方法主要有3种:

植物提取法、化学合成法和生物合成法（表2）。

2015年诺贝尔生理学或医学奖得主、中国中医科学院首席科学家屠呦呦[39]及其同事通过不断改进提取方法，最终于1972年从青蒿中提取到了微量的新型抗疟药--青蒿素。

但是，萜类在植物中的含量通常很低，且植物提取法还存在野生资源稀缺、分离效果不佳、产量极低的问题。

中国科学院院士涂永强课题组[40]则通过建立仿生合成路线，对具有生物活性萜类抗癌药物的合成进行了大量系统性的化学合成研究。

化学合成法虽解决了植物提取法中的诸多问题，但仍存在原料昂贵、工艺流程复杂、立体选择性低、能耗高、污染大、总收率偏低等问题。

相比之下，生物合成法不受原料的限制、生产过程绿色清洁、产物单一、产率提升空间大，具有很大的优势。

　　生物合成法又分为两种，一种是通过代谢工程手段直接在植物中促进萜类的合成;

另一种是通过合成生物学在微生物等底盘细胞中合成目标产物。

第一种方法是直接向植物中引入强启动子驱动的萜类合酶，从而实现萜类的生产[41].如通过过表达芳樟醇合酶可以大量生产单萜芳樟醇，构建的转基因植株包括矮牵牛、番茄、康乃馨、马铃薯及拟南芥[42-45].这种代谢工程操作不仅用于高效生产萜类化合物，还可以用于改变作物的一些性状，如提高观赏植物和水果等的香味和口感，改善植物的授粉效率，增强植物的抗病和抗虫能力等。

此外，还能帮助理解植物萜类化合物的合成途径和调控方式，揭示已有途径的旁支通路和反馈途径等。

但是，由于植物生长缓慢，且体内代谢过程错综复杂，这种萜类合成方法面临着目标产物产量有限、后期分离困难、生产周期长等问题。

为了实现萜类的高产，研究人员越来越多的开始尝试合成生物学手段[46].

　　1.3萜类的合成生物学研究

　　1.3.1萜类合成生物学的设计策略

　　1.3.1.1底盘细胞的选择及改造选取不同的底盘细胞对于萜类的生物合成有关键性的影响。

例如，大肠杆菌中萜类前体IPP和DMAPP主要用于tRNA的异戊烯化和FPP的合成，进而用于醌类和细胞壁的合成，因此该底盘细胞主要用于酮、醇、酸等化学品而非萜类的生物合成[47].代谢工程和合成生物学领域的先驱人物，如加州大学洛杉矶分校的JamesLiao教授和伯克利分校的JayKeasling教授，他们的实验室也曾通过大肠杆菌进行萜类化合物的生物合成，但均需重构IPP和DMAPP的合成途径。

如Farmer等[48]在大肠杆菌中重构MEV途径，提高了番茄红素的生物合成产量:

向培养基中外源添加丙酮酸，并在重构番茄红素合成途径的大肠杆菌中过表达磷酸烯醇式丙酮酸合酶（phosphoenolpyruvatesynthase,PPS），使得丙酮酸转化成磷酸烯醇式丙酮酸，促进碳代谢流由丙酮酸向G-3-P逆流，进而得到大量类异戊二烯的前体，最终每克细胞干重中得到了25mg番茄红素，比单纯重构番茄红素合成途径的大肠杆菌的发酵产量提高了5倍。

Kim等[49]在重构番茄红素合成途径的大肠杆菌中，使用CRISPRi技术重新平衡MEV途径的代谢流，通过设计不同的sgRNA并比较其基因敲除效率，将MVA途径中的基因表达平均降低了81.6:

最终使得番茄红素的产量提高了9倍。

Martin[25]则通过在大肠杆菌中建立酵母MEV途径促进FPP的合成，同时过表达紫穗槐二烯合酶，并向培养基中外源添加甘油（0.8:

V/V），最终使得青蒿素前体紫穗槐二烯的积累高达112.2mg/L.

　　由于细菌缺少翻译后修饰而难以表达细胞色素P450,且很多萜类化合物具有抗菌活性，因此多采用酿酒酵母等真核生物进行萜类的生物合成[50,51].利用酵母细胞工厂的好处是酵母能够直接合成较多的DMAPP和IPP,从而为萜类合成提供大量前体物。

选用酵母作为底盘细胞还可以通过酵母基因组的必需基因分析，保留最小基因组，从而在萜类的生物合成过程中减少其内源消耗。

所有基因工程操作都可以通过染色体融合完成，保证了酵母工程菌株的遗传稳定性。

通过酵母全基因组的筛选还能够获得一些高活性的内源启动子与终止子，如清华大学戴俊彪课题组[52]通过筛选酿酒酵母全基因组，获得了一些酵母来源的启动子和终止子。

此外，他们还在酿酒酵母中构建了生物合成的功能模块，能够快速实现多基因代谢通路中的蛋白的异源表达，并完成多个转录单元的一步组装。

选择酵母细胞的另一个优势是可以通过对酵母细胞进行耐高温、耐酸、耐盐等抗逆改造，如清华大学林章凛教授[53]主持的“973项目”研究了适合微生物的合成生物学抗逆元器件，获得了具有重要产业价值的微生物抗酸器件和工业菌株，为实现萜类目的产物的高密度发酵和产业转化奠定了研究基础。

　　1.3.1.2萜类合成途径的挖掘合成途径的挖掘是合成生物学快速发展的保障。

目前已经从拟南芥、水稻、苜蓿、百脉根等不同的植物中分离得到了几十个编码鲨烯环化酶的基因[54].大量的基因组学数据表明，细胞色素P450家族在植物萜类化合物的合成过程中扮演着关键的角色[55].随着全基因组测序、第二代DNA测序技术以及宏基因组学技术的发展，越来越多的天然产物的代谢途径被挖掘出来。

研究发现，植物萜类化合物的合成往往伴随着基因表达簇结构的发现。

通过萜类化合物基因表达簇的鉴定，研究人员发现了不同萜类合成通路中的鲨烯环化酶、共表达的CYP450以及辅酶CPR.如中国农业科学院蔬菜花卉研究所黄三文团队[56]通过破解黄瓜的基因组数据，发现黄瓜苦味基因（Bitter,Bi）基因编码的蛋白为鲨烯环化酶。

为了破解黄瓜苦味合成、调控及驯化的分子机制，他们进一步挖掘黄瓜组学数据，并结合代谢组学、遗传学以及分子生物学技术，最终鉴定出9个与黄瓜中葫芦素C合成相关的基因（Csa6G088690、Csa6G088160、Csa6G088170、Csa6G088710、Csa3G698490、Csa3G903540、Csa3G903550、Csa1G044890、Csa6G088700）[19].这一系列研究为三萜葫芦素的生物合成奠定了重要的数据基础。

　　萜类的生物合成是一个多因素调节的动态过程。

通过异源基因的密码子优化、启动子终止子的选取和搭配组合、代谢途径基因簇的共表达、合成途径的标准化组装、关键调控基因的精细调控、细胞合成工厂的创建、发酵条件摸索及发酵工艺优化等方面的深入研究，能够显着提高萜类合成关键酶的异源高效表达以及萜类的合成能力。

　　1.3.2萜类化合物的合成生物学研究进展

　　1.3.2.1单萜酿酒酵母能够利用体内的MEV途径合成IPP和DMAPP,进而缩合成GPP,为单萜的生物合成提供前体物质。

因此，在酿酒酵母中外源表达单萜合酶有望实现单萜的合成。

以芳樟醇为例，Herrero等[57]通过在酿酒酵母T73-4中表达来源于仙女扇的S-芳樟醇合酶（linaloolsynthases,LIS）的基因，从而引入了芳樟醇合成代谢通路，构建出了能够有效分泌芳樟醇的重组菌株，最终达到18μg/L的积累水平。

类似地，Zhang等[58]在酿酒酵母中表达了来源于软枣猕猴桃（Actinidiaarguta）的芳樟醇合酶的基因，实现了芳樟醇的产量为59.85μg/L.Rico等[59]在表达芳樟醇合酶的基础上进一步调节了该菌株中的类异戊二烯生物合成途径，通过过表达羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶（3-hydroxy-3-methylglutarylcoenzymeAreductase,HMG-CoA还原酶）的催化结构域（truncatedHMG-CoAreductase,tHMGR），解除了MEV途径中羟甲戊酸合成的内源限速步骤，最终使得芳樟醇产量进一步提高到132.66μg/L.考虑到异戊二烯二磷酸异构酶（IDI1）参与的异构化反应能够实现IPP和DMAPP之间的可逆转化，是实现GPP合成的重要步骤，江南大学陈坚课题组[60]在过表达HMG1的催化结构域的基础上，同时过表达了IDI1,以期提高酿酒酵母中MEV合成途径的代谢通量，强化GPP合成供给，结果发现芳樟醇产量仍然只有127.71μg/L.为了提高单萜在酿酒酵母中的合成，陈坚课题组[61,62]进行了大量的深入研究，结果发现柠檬烯处理酿酒酵母细胞会诱发活性氧胁迫，引起菌体凋亡。

Parveen等[63]则通过转录组学分析发现，单萜α单蒎烯（α-terpinene）胁迫会造成酿酒酵母的细胞膜功能损伤。

因此，宿主对单萜的低耐受程度可能是限制单萜产量提高的瓶颈。

对于酿酒酵母耐受单萜的机理研究将为构建高单萜耐受性的酵母菌株提供更多的理论依据。

　　1.3.2.2倍半萜青蒿素是具有内过氧桥结构的倍半萜内酯类化合物，是目前研究最多关注度最高的一种倍半萜。

以有效剂量的青蒿素为基础、辅以传统抗疟药物的联合疗法（artemisinin-basedcombinationtherapy,ACT）被世界卫生组织批准为治疗疟疾的最有效的办法。

由于人工合成青蒿素的难度很大，且价格昂贵，青蒿素的生产曾主要依赖从中国传统中草药青蒿中提取，但这种方法产量极低，导致青蒿素类药物紧缺，价格波动幅度大，ACT疗法昂贵，因此亟需寻找更稳定的青蒿素生产方法。

Keasling团队[64]对于青蒿素生物合成的研究工作是合成生物学领域取得的一项突破性进展。

截止目前，他们已经在酿酒酵母中实现了青蒿素前体青蒿酸的合成与产业化，为化学合成青蒿素以及活性抗疟药物青蒿琥酯（artesunate）提供了大量前体。

在该项工作中，他们首先在酵母中过表达了来自青蒿的紫穗槐-4,11-二烯合酶，实现了FPP向青蒿素前体紫穗槐二烯的合成，但合成量很低，这是因为酵母细胞中的大部分IPP和DMAPP前体会进入麦角固醇合成通路。

随后，他们在该菌株中重构了MEV途径，使得与FPP合成相关的基因发生上调，而FPP流向其他通路如固醇的基因表达则发生下调，从而提高了FPP的合成产量，并通过染色体重组将MEV途径整合到酵母基因组上，保证了改造菌株的遗传稳定性，再辅助以固醇转录因子UPC2的表达，最终使得紫穗槐二烯的合成产量提高到153mg/L,比之前的报道高出了500倍。

后续的发酵实验甚至使得紫穗槐二烯的产量达到27g/L.由于很多萜类代谢的中间产物如FPP对细胞均有毒性，研究者希望通过在大肠杆菌中构建压力传感器，调节细胞的代谢负荷，进而提高目的产物的表达。

Keasling实验室的成员通过全基因组的转录芯片测序，鉴定出了一些能够响应有毒代谢产物的启动子。

采用响应FPP积累的启动子驱动大肠杆菌中紫穗槐二烯合成途径的基因表达，结果使得紫穗槐二烯的产量达到1.6g/L.因此，根据目的产物的合成途径，选取对某个中间产物敏感的启动子驱动目的产物的基因表达，可以有效提高目的产物的产出。

这一方法将是提高目的产物的一种重要的通用工具[65].为了实现紫穗槐二烯向青蒿酸的转变，他们从青蒿中分离得到了一种CYP450单加氧酶CYP71AV1,并协同表达CYP71AV1的辅酶CPR,实现了紫穗槐二烯的三步氧化，最终使得1L发酵罐中青蒿酸产物的产量达到115mg/L,生产效率比植物提取法提高了两个数量级。

为了进一步提高青蒿酸的合成，Keasling团队在酵母中将MEV途径中的所有的酶全部进行了过表达，青蒿酸的产量达到约1.6g/L,而紫穗槐二烯的产量更是比青蒿酸高10倍以上。

于是，他们进一步对紫穗槐二烯生产菌株的发酵条件进行了优化，最终使得紫穗槐二烯的产量高达>

40g/L,为青蒿素的化学合成提供了大量前体[66].在此基础上，他们团队在青蒿中鉴定出了两个新的植物脱氢酶（artemisnicalcoholdehydrogenase,ADH1;

artemisnicaldehydedehydrogenase,ALDH1）和一