用MTT比色法建立B型CpGODN活性检测标准文档格式.docx

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每孔加入DMSO150μL,经平板振荡器振荡20min至颗粒完全溶解,在酶标仪上检测A578值即可。

结论:

建立了无污染、造价低、可操作性强的BW006活性检测方法。

【关键词】MTT比色法脾细胞增生BW006活性

　　[Abstract]AIM:

BW006,BtypeCpGODN,willbeapprovedasvaccineadjuvantforhumanuse.Soitisnecessarytodetermineastable,safetyandeasytooperatemethodforactivityidentificationofBW006withdifferentlots.METHODS:

AccordingtothecharacteristicofBW006tostimulatetheproliferationofPBMCormicesplenocytes,MTTassaywaspreferentiallyselectedtotestthecharacteristicofBW006.ThesplenocytesoffemaleBALB/cmicewasstimulatedbyBW006,anddifferentexperimentparametersincludingsplenocytenumbers,theshapeofplate,BW006concentration,culturemedium,culturetimeandoptimizedMTTconditionsweredeterminedinthesecourses.RESULTS:

thewholeexperimentschemewasdefinedasfollowing:

6×

105splenocyteswerecoculturedwith3mg/LBW006in200microliterRPMI1640（withoutphenolred）supplementedwith100mL/LFBSina96wellsquareplate.PBS,thesolventofBW006wasusedasnegativecontrol,andculturemediumwithoutcellswasusedasblank.Afterbeingcoculturedfor36hoursat37℃inhumidifiedincubatorwith50mL/LCO2,100microlitersupernatantswasaspiredoutand10microliterMTT（5g/L）wasaddedintoeachwell.Theplatewasfurtherincubatedindarkat37℃for4hoursthatissufficientfortheformationofformazan.Afterward,150microliterDMSOwasdirectlyaddedintoeachwell.Theplatewasshakenonplateshakerfornearly20minutesuntiltheformazanwascompletelydissolvedanddetectedA578valueatatELISAreader.CONCLUSION:

optimizedMTTassay,whichisnonradioactivecontamination,lowpriceandsimpleoperation,couldbeusedasactivityidentificationofBW006duringlargescaleproduction.

　　[Keywords]MTTassay;

proliferation;

BW006;

activity

　　CpGODN,是人工合成的含有未甲基化CG基序的单链寡聚脱氧核苷酸,可以模仿细菌或病毒对脊椎动物免疫系统的刺激作用[1]。

根据作用特点的差别,CpGODN可被分成三类[2],其中B类CpGODN能刺激B细胞增生和活化,目前已被大规模应用在疫苗佐剂研究中[1,3]。

BW006是由本室构建并已申请国家专利的B型CpGODN。

小鼠体内实验证明BW006作为狂犬疫苗佐剂,可以替代铝佐剂,促进抗体提前产生,减少疫苗注射次数;

作为乙肝疫苗佐剂,可以协同铝盐,增效HBsAg免疫原性;

作为流感疫苗佐剂,可以减低疫苗用量（以上实验结果由本室完成,尚未发表）。

目前已进入临床活性评价阶段,为此需要建立简便易行的活性鉴定方法以检测不同生产批次的BW006质量。

四甲基偶氮唑盐（MTT）微量酶反应比色法是检测细胞增生的方法之一[4],基本原理为活细胞内琥珀酸脱氢酶可使黄色的MTT还原产生蓝紫色甲瓒颗粒,后者可溶于有机溶剂,在酶标仪上检测A578值即可。

具有快速、无污染、操作简便等特点,但灵敏度较低。

本研究中首次尝试通过优化MTT比色法,检测BW006刺激免疫细胞增生的能力,以建立稳定的BW006的活性检测标准。

　　1材料和方法

　　1.1材料BW006由TaKaRa合成。

6～8周龄的雌性BALB/c小鼠购自吉林大学基础医学院动物室。

96孔圆底板和平底板购自Costar公司。

无酚红RPMI1640购自Hyclone公司。

标准胎牛血清（FBS）购自天冿TBD公司。

MTT粉末购自Sigma公司。

DMSO购自天津市光复精细化工研究所。

TS1型脱色摇床由江苏海门市麒麟医用仪器厂生产。

CO2培养箱为德国Heraeus公司产品。

扫描仪为清华紫光公司产品。

MultiskanAscent型酶标仪由芬兰ThermoLabsystems公司生产。

　　1.2方法

　　1.2.1摸索最佳铺板的脾细胞数分别在96孔圆底板中加入如下细胞数（/孔）:

12×

105、6×

105、3×

105、1.5×

105和0.75×

105,每一个细胞梯度中均加入BW006致1mg/L（5复孔）,PBS为BW006溶媒对照。

用200μL含100mL/LFBS的无酚红RPMI1640培养[5]。

为避免边缘效应的产生,培养板周围各孔中只加入200μL无菌PBS[6]。

37℃细胞培养箱孵育60h。

1200r/min水平离心机离心10min,每孔中弃100μL培养上清,然后加入10μLMTT（5g/L）。

37℃避光孵育4h。

1200r/min水平离心机离心10min,每孔中弃80μL培养上清后加入200μLDMSO。

平板振荡器上振荡,约4h后孔底结晶颗粒消失,用酶标仪检测A578值。

　　1.2.2简化DMSO加入条件用含100mL/LFBS的100μLRPMI1640培养脾细胞。

刺激时间结束后,在每孔中直接加入10μLMTT（5g/L）。

37℃避光孵育4h后不弃上清,分别加入100μL或150μLDMSO。

振荡溶解20min,扫描平板,酶标仪检测A578值。

　　1.2.3比较培养液用量对细胞培养的影响分别用100μL或200μL培养液培养BW006刺激的脾细胞。

刺激结束后,在200μL培养孔中弃100μL上清。

各孔中加MTT的量同上。

避光孵育结束后,分别直接加入100μL或150μLDMSO。

振荡溶解20min,扫描平板,检测A578值。

　　1.2.4摸索BW006刺激脾细胞增生的量效和时效关系

（1）量效关系实验:

分别用0.75、1.5、3、6、12、24、48和96mg/LBW006刺激脾细胞,刺激60h后,1200r/min离心10min,每孔弃100μL培养上清,加入10μLMTT（5g/L）。

37℃避光孵育4h后,每孔中加入150μLDMSO。

震荡溶解20min,酶标仪检测A578值;

（2）时效关系实验:

为保证各检测时间点刺激结果的可比性,在同一96孔平底板上,用3mg/LBW006分别刺激BALB/c小鼠脾细胞24、36、60、72、96和108h。

同一时间点结束实验,MTT检测同

（1）。

　　2结果

　　2.1最佳铺板脾细胞数的确定在96孔圆底培养板中加入不同数量的小鼠脾细胞,观察BW006刺激细胞的增生情况（图1）,结果表明:

每孔6×

105细胞在BW006刺激下增生幅度最大,由此确定,6×

105为最佳用于检测BW006活性的铺板细胞数。

但是,加入MTT后形成的甲瓒（Formazan）颗粒即使震荡4h,仍不能完全溶解。

复孔间A值误差大,推测可能为脾细胞在U型板底聚集使得颗粒溶解不彻底。

以下实验中改用平底板培养脾细胞,以减少溶解不彻底造成的误差。

　　图1最佳脾细胞数的确定（略）

　　Fig1Determinationofoptimalsplenocytesnumbers

　　2.2实验体系的优化在上述反应体系中,加入DMSO溶解颗粒之前需要吸弃部分培养液,为了减少由此步操作对实验造成误差的可能性,在100μL培养液中直接加入DMSO。

结果发现,100μLDMSO不足以完全溶解formazan颗粒,而150μLDMSO直接加入含100μL培养液中可完全溶解MTT所形成的formazan颗粒,A值远远高于100μLDMSO孔（图2）。

　　图2简化MTT反应体系的尝试（略）

　　Fig2ExplorationofsimplifiedMTTmethod

　　2.3实验体系的确定为了进一步确定BW006刺激小鼠脾细胞的MTT反应条件,采用等量BW006刺激小鼠脾细胞,观察不同体积的培养液和DMSO对测定A值的影响,结果显示:

用含100mL/LFBS的200μLRPMI1640培养脾细胞、150μLDMSO溶解Formazan颗粒可以获得最佳结果（图3）。

因此,BW006刺激小鼠脾细胞的MTT反应条件确定为:

96孔平底培养板,每孔6×

105小鼠脾细胞,含100mL/LFBS的200μL无酚红RPMI1640培养液。

BW006刺激结束后,每孔中弃100μL培养上清,加入10μLMTT（5g/L）;

37℃避光孵育4h;

加入150μLDMSO,震荡溶解20min;

用酶标仪检测A578值。

　　图3BW006刺激脾细胞增生的MTT反应条件的确定（略）

　　Fig3DeterminationofexperimentalconditionsofMTTassay

　　2.4BW006刺激脾细胞增生的量效关系为了观察BW006剂量与小鼠脾细胞增生之间的关系,采用0.75、1.5、3、6、12、24、48和96mg/LBW006刺激小鼠脾细胞,然后用MTT法检测,结果表明,0.75mg/LBW006已具有刺激脾细胞增生的能力,3mg/L或6mg/L的刺激能力最强（图4）,随着浓度继续增大,刺激能力平缓下降。

因此,确定3mg/L用于BW006活性的鉴定。

　　图4BW006刺激小鼠脾细胞增生的量效关系（略）

　　Fig4ThedoseeffectofBW006tostimulatetheproliferationofmicesplenocytes

　　2.5BW006刺激脾细胞增生的时效关系为了确定BW006对小鼠脾细胞的最佳刺激时间,采用3mg/LBW006对小鼠脾细胞分别刺激24～108h,MTT法检测细胞的增生情况,结果（图5）,BW006刺激36h的脾细胞增生最明显,以后随着时间的延长而增生程度逐渐减缓。

　　图5BW006刺激小鼠脾细胞增生的时效曲线（略）

　　Fig5ThetimecurveofBW006tostimulatetheproliferationofmicesplenocytes

　　3讨论

　　近年来,由我室构建的B型CpGODNBW006在作为很多商品疫苗（狂犬,乙肝和流感）佐剂研究中,发挥明确的增效作用,已被开发为商品化的核酸类佐剂（资料未公开）。

投入规模化生产后,需要建立简便、经济、无污染的BW006活性检测标准,以保证临床使用中的质量。

根据B型CpGODN的功能特点,即刺激哺乳动物免疫细胞增生活化（主要为B淋巴细胞）,可以采用3H掺入[2,7]、MTT比色法检测小鼠脾细胞的增生或是流式细胞术检测B细胞的活化[8]。

3H掺入法比MTT比色法灵敏度高,但容易造成放射性污染;

检测B细胞活化需要应用流式细胞术和荧光抗体,但费用昂贵、主观因素影响大。

而MTT比色法具有操作简单、无污染、造价低等特点,符合规模化检测的基本要求。

本实验中,用BW006作为刺激物,对MTT检测过程中的各个关键参数进行筛选,确定了优化的MTT检测体系:

用200μL含100mL/LFBS的无酚红RPMI1640培养液和96孔平底板培养细胞;

确定6×

105个6～8周的健康雌性BALB/c纯系小鼠脾细胞作为每孔细胞用量;

刺激结束后,1200r/min离心10min,每孔弃100μL培养上清,加入10μLMTT（5g/L）。

37℃孵箱避光孵育4h,加入150μLDMSO,平板振荡器振荡20min,酶标仪检测A578值。

在此基础上确定了BW006刺激小鼠脾细胞增生的最佳工作浓度为3mg/L;

最佳刺激时间为36h。

经优化的MTT比色法具有灵敏度高、背景低的特点,可以完全满足活性检测的需要,从而避免了环境污染和成本过高等问题。

然而,MTT比色法仍不能取代3H掺入法在CpGODN实验室大规模筛选中的作用以及FCM检测在CpGODN免疫活性鉴定中的作用。

【参考文献】

　　[1]KriegAM.TherapeuticpotentialofTolllikereceptor9activation[J].NatRevDrugDiscov,2006,5（6）:

471-484.

　　[2]王学菊,王智博,卫红飞,等.C型CpG单链寡核苷酸对肿瘤疫苗抑瘤效果的增强作用[J].细胞与分子免疫学杂志,2007,23（4）:

338-342.

　　[3]GuyB.Theperfectmix:

recentprogressinadjuvantresearch[J].NatRevMicrobiol,2007,5（7）:

505-517.

　　[4]LinDS.Comparisonofthreenonradioactiveassaysformeasurementofcellmediatedimmunity[J].BioFormosa,2006,41

（2）:

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　　[5]MeletiadisJ,MoutonJW,MeisjfGM,etal.ComparisonofspectrophotometricandvisualreadingsofNCCLSmethodandevaluationofacolorimetricmethodbasedonreductionofasolubletetrazoliumsalt,2,3bis[2methoxy4nitro5[（sulfenylamino）carbonyl]2Htetrazoliumhydroxide],forantifungalsusceptibilitytestingofaspergillusspecies[J].JCinMicrobiol,2001,39（12）:

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　　[6]PatelMI,TuckermanR,DongQH.APitfallofthe3（4,5dimethylthiazol2yl）5（3carboxymethonyphenol）2（4sulfophenyl）2Htetrazolium（MTS）assayduetoevaporationinwellsontheedgeofa96wellplate[J].BiotechnologyLetters,2005,27（11）:

805-808.

　　[7]MannonRB,NatarajC,PisetskyDS.StimulationofthymocyteproliferationbyphosphorothioateDNAoligonucleotides[J].CellImmunol,2000,201

（1）:

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　　[8]KriegAM,YiAK,MatsonS,etal.CpGmotifsinbacterialDNAtriggerdirectBcellactivation[J].Nature,1995,374（6522）:

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