三种不同药性中药制剂对内毒素性肾衰的防治作用及其机理的比较研究.docx

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三种不同药性中药制剂对内毒素性肾衰的防治作用及其机理的比较研究

三种不同药性中药制剂对内毒素性肾衰的

防治作用及其机理的比较研究

摘要采用家兔研究了热毒清注射液、复方丹参注射液和五苓注射液对内毒素所致急性肾功能衰竭的防治作用及其机理。

将40只健康哈尔滨白兔随机分为阴性对照组、模型组、热毒清组、丹参组和五苓组，每组各8只。

模型组和各防治组家兔一次性静脉注射大肠杆菌O111B4内毒素生理盐水溶液，剂量为100µg•kg-1（10ml•kg-1）。

三防治组家兔在注射内毒素后立即静脉注射相应的中药注射液，热毒清组和五苓组家兔剂量为7.5ml•kg-1，丹参组剂量为3.75ml•kg-1。

阴性对照组静注生理盐水。

调整生理盐水用量，使各组家兔静注液体的总量相等。

注射内毒素（或生理盐水）1h后开始通过膀胱瘘管收集尿液，每h收集一次，共收集6h。

末次收集尿液后心脏采血。

为了观察各中药制剂对内毒素性肾功能衰竭的防治作用，对各组家兔的肾功能指标进行了动态测定。

结果显示，模型组家兔发生了急性肾功能衰竭，其各项肾功能指标均与阴性对照组有显著或极显著差异（P<0.05，P<0.01）。

和模型组比较，热毒清组家兔的尿量以及肌酐、尿素氮和尿钠排出量显著或极显著增加（P<0.05，P<0.01），肾衰指数和钠排泄分数显著降低（P<0.05），内生性肌酐清除率（以此代表肾小球滤过率）、尿渗透压和尿血渗比以及渗透物质清除率显著或极显著升高（P<0.05，P<0.01），游离水清除率极显著降低（P<0.01）。

实验临近结束时，热毒清组家兔的某些肾功能指标已和阴性对照组无显著差异。

这些实验结果表明，热毒清注射液对内毒素性肾衰具有确实的防治作用。

除肾衰指数和钠排泄分数之外，丹参组家兔绝大多数肾功能指标的变化趋势与热毒清组相似，提示复方丹参注射液亦有良好的防治内毒素性肾衰作用。

五苓组家兔的某些肾功能指标如尿量、肌酐和尿素氮随尿排出量、渗透物质清除率和内生性肌酐清除率在实验后期虽也较模型组有了显著改善，但其肾功能衰竭状况并未得到根本扭转。

为了阐明各中药制剂防治内毒素性肾衰的机理，还观察了它们的抗内毒素作用、对内毒素所致肾脏损伤的防护作用及对水、钠排泄的影响。

热毒清注射液对内毒素有较强的破坏作用，可极显著地减少肾小球微血栓形成、减轻肾小管上皮细胞的损伤，表明“热毒清”的抗内毒素作用可能是其防治内毒素性肾衰的主要机理。

丹参注射液抗内毒素作用较弱，但同样能极显著地减轻肾脏的损伤，特别是减少肾小球微血栓的形成，提示丹参注射液对内毒素性肾衰的防治作用可能是其抗内毒素和抗凝血两方面共同作用的结果。

五苓注射液抗内毒素作用十分轻微，未能显著减轻肾小球微血栓的形成和肾小管的损伤，但显示了显著的利尿效应，看来五苓注射液改善某些肾功能指标的作用可能是通过其促水、钠排泄作用实现的，因此，不可能从根本上防治内毒素性肾功能衰竭。

本实验的结果提示，清热解毒类中药用于动物内毒素性肾功能衰竭的临床防治可能具有良好的应用前景，活血化瘀类中药也可能具有较好的临床防治作用，如将两者配伍应用可望取得更好的效果。

渗湿利水类中药对内毒素性肾衰不大可能取得确实的临床疗效，因此不予推荐。

关键词内毒素；急性肾功能衰竭；热毒清注射液；复方丹参注射液；五苓注射液；防治作用；防治机理

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奶牛类乙型肝炎组织病理学观察

我国是病毒乙型肝炎（HB）高发病国家，人群感染HBV约有6.5亿，而HbsAg慢性携带者则为1.2亿，每年死于HB及相关性疾病者在案16万人以上。

HB已成为我国危害最大的社会公共卫生问题。

但近年来兽医学界有关畜禽感染HBV的报道日益增多，国内很多学者在牛、羊、猪和家禽等多种动物血清中检测出人类乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）和e抗原（BheAg），阳性率较高，并用免疫电镜方法在奶牛血清中观察到类似HBsAg颗粒和Dane病毒样颗粒。

在畜禽血清中检出携带有类似乙型肝炎病毒抗原（HBsAg）者，这在公共卫生学上及流行病学上引起人们极大关注。

人们担心携带HBsAg的动物是否能在人的乙型肝炎的传播上起作用。

现将近几年来我们对奶牛类乙型肝炎的检测和组织病理学研究情况介绍如下。

材料和方法

1、从北京军事科学院四环生物生化制品厂和英科新创科技有限公司购进HBsAg、HBsAb、HbcAb、HBeAgELISA诊断试剂盒。

用全自动ELISA技术检测610头奶牛血清。

2、用肝脏穿刺法。

采取20头奶牛肝脏组织活体样本，保存于10%福尔马林中做病理切片观察。

用HE和vanGieson氏染色法分别对肝组织切片进行染色。

3、采用临床生化试验技术检测60头奶的牛肝功能。

结果

在检测的610份奶牛血清中,有113头份血清为HBsAg（表面抗原）阳性，平均阳性率18.5%；290头奶牛HBsAB阳性，平均阳性率为47.6%，48头奶牛HBeAg阳性，阳性率为7.77%。

在HBsAg（表面抗原）阳性和HBeAg阳性的奶牛（161头）中60头奶牛同时具有HBsAg、HBeAg阳性。

对具有HBsAg、HBeAg阳性奶牛进行肝功能检测，60头中有18头，谷氨酸丙酮转氨酶（GPT）≥谷氨酸草酰酸转氨酶（GOT），GPT在400～600单位，表现为急性病毒性乙型肝炎（AHB）。

42头奶牛血清GTP缓慢上升，缓慢下降，GTP在200～300单位之间，表现为慢性病毒性乙型肝炎（CHB）。

根据肝功能检测结果，对急性和慢性型乙型肝炎各采取10头肝组织做病理形态观察。

急性乙型肝炎：

肝小叶内肝细胞气泡变性，胞质内颗粒稀疏，块状，HE染色显得苍白，细胞多形性轮廓消失，肝小叶结构尚保存，但肝细胞索结构紊乱，肝窦狭窄，窦内上皮细胞核变圆变长，常见炎细胞粘附其间而引起肝窦堵塞，致肝窦壁破坏，毛细血管堵塞较常见。

严重的病例，表现为肝实质坏死呈块状，常融合成片，肝小叶及肝索结构消失，残存的肝细胞多融合成团，一些区域可见肝细胞再生，形成团块状，肝小叶中央静脉及肝窦内充满红细胞及微血栓，上皮细胞脱落，可见血管再生现象。

一些肝细胞水样变性和脂肪变性，间质胶原纤维增生。

慢性病毒性肝炎（CHB）：

肝细胞疏松及灶性气球样变，实质内见单一或小片肝细胞坏死,肝小叶结构较完整,肝窦内皮细胞、枯氏细胞轻度增生,肝内血管增生、充血，纤维化较轻。

没有观察到肝硬化的证病性病理变化。

讨论

1、HBsAg（表面抗原）阳性的奶牛成为乙型肝炎病毒携带者；HBsAB阳性，的奶牛，说明奶牛曾感染过乙型肝炎病毒并产生了抗体，具有一定的免疫力。

有些奶牛虽然产生了抗体，但HBsAg（表面抗原）仍阳性，这些奶牛具有一定的传染性，HBsAg、HBeAg阳性的奶牛传染性很强。

2、GOT在线立体内为多，GPT在胞浆内为多。

一般认为胞浆内的转氨酶能与组织液正常交换，较易逸出。

故在肝细胞损害时，GPT增高的幅度大于GOT。

过去认为肝病时血清转氨酶活力升高，是由于酶从损害或坏死的肝细胞内释放出来，目前认为酶释出时不一定需要肝细胞的溶解或坏死，细胞膜通透性的改变可能是重要的机理之一。

3、传统的观点认为，AHB的肝细胞变性和坏死与淋巴细胞攻击有关，但多数变性坏死的肝细胞找不到淋巴细胞攻击证据。

目前认为HBV可诱导肝内浸润的T淋巴细胞（CTL）活化增殖，后识别被HBV感染的肝细胞并引发其坏死。

再次，活化的CTL产生γ-干扰素等诱使巨噬细胞在局部聚集，进而产生TNF（肿瘤坏死因子）等使肝细胞广泛性坏死。

内毒素介导的动物急性肾功能衰竭及其发生机理的实验研究

摘要采用家兔研究了内毒素介导的急性肾功能衰竭及其发生机理。

模型组家兔间隔24h两次耳缘静脉注射大肠杆菌O111B4内毒素（剂量分别为15μg.kg-1和35μg.kg-1），第二次注射1h后开始通过膀胱瘘管收集尿液，每h收集一次，共收集6h。

末次收集尿液后立即心脏采血。

为了查明内毒素所致肾功能损害，对内毒素处理家兔的肾功能指标进行了全面、动态的测定。

结果表明，和静注生理盐水的对照组家兔比较，模型组家兔的尿量、肌酐尿素氮以及钾离子的随尿排出量显著或极显著减少（P<0.05，P<0.01，P<0.001），血肌酐和尿素氮含量、尿钠浓度、肾衰指数和钠排泄分数显著或极显著增高（P<0.05，P<0.01），内生性肌酐清除率（以此反映肾小球滤过率）、尿渗透压、尿/血渗比以及渗透物质清除率显著或极显著降低（P<0.05，P<0.01,P<0.001），游离水清除率趋向于零。

实验结果还表明，模型组家兔的上述肾功能损害是进行性的。

为了阐明内毒素所致急性肾功能衰竭的发生机理，在观察模型组家兔肾功能变化的同时还对其血液凝固性变化以及肾脏的病理形态学损伤进行了研究。

和对照组家兔比较，模型组家兔血小板计数和血浆纤维蛋白原含量极显著降低（P<0.01），出血时间、凝血时间、凝血酶原时间和白陶土部分凝血活酶生成时间显著或极显著延长（P<0.05，P<0.01）。

另一方面，静脉注射内毒素在所有模型组家兔引发了弥漫性血管内凝血，71.4%的肾小球中发现了微血栓，肾小球纤维素密度指数达60.6%。

同时，96.2%肾小管的上皮细胞发生了变性和坏死，84.1%的肾小管中有管型形成。

然而，对照组家兔无一例发生类似的病理变化。

这些资料提示，内毒素所致血液凝固性变化引发了肾小球内微血栓形成，后者阻断肾小球毛细血管血流，从而导致肾小球滤过率降低，这可能是内毒素所致急性肾功能衰竭首要的发病机理。

此外，肾小管上皮细胞变性、坏死可损害他们的重吸收和分泌功能，管型形成可阻塞肾小管腔并增大肾球囊中的压力从而使肾小球有效滤过压降低，这些可能都是在内毒素性肾功能衰竭发生、发展过程中起重要作用的因素。

关键词内毒素；急性肾功能衰竭；发病机理；家兔

内毒素致兔红细胞膜ATP酶活性改变及阳离子A的保护作用

摘要目的：

研究内毒素（ET）致兔红细胞膜（ECM）ATP酶（ATPase）活性变化及阳

离子A（CA）的保护作用。

方法：

采用定磷法分别测定正常对照组（Ⅰ组）、内毒素组（Ⅱ组）和阳离子A拮抗组（Ⅲ组）的兔ECM的三种ATPase活性。

结果：

除Na+-K+-ATPase、Mg2+-ATPase活性在0.5小时（h）时与Ⅰ组比较无显著差异（P>0.05）外，Ⅱ组三种ATPase活性在3h内均显著增高（P<0.01，P<0.05），而5、7h全部下降（P<0.01）；与Ⅱ组比较中，Ⅲ组除1h时Mg2+-ATPase的活性无显著差异（P>0.05）外，三种ATPase的活性均显著增强（P<0.05，P<0.01）。

结论：

ET可使ECM上三种ATPase活性先增高后降低，而CA对膜ATPase活性有明显保护作用。

关键词内毒素；阳离子A；红细胞膜；ATP酶

内毒素（endotoxin,ET）广泛存在于自然界，是造成人、畜感染性休克的重要致病因子。

自20世纪80年代以来，对感染性休克发病机制的研究已深入到细胞和分子水平，而从生物膜角度认识疾病则是当前生命科学领域在大分子水平探索生物膜与疾病关系重要组成部分。

Wurth等认为膜泵分子（即ATPase）的活性改变可代表休克中细胞功能的重要变化，而判断细胞膜的损伤和保护的观察指标之一就是膜上三种ATPase（Na+-K+-ATPase、Ca2+-ATPase和Mg2+-ATPase）的功能状态。

本实验就是通过观察兔红细胞膜（erythrocytemembrane，ECM）ATPase的活性变化来探讨ET对其的影响及ET拮抗剂阳离子A（cationA，CA）的保护效应，从而在膜泵分子水平上揭示ET对ECM的损伤机制，并探讨可能的防治途径。

1材料与方法

1.1主要试剂和仪器细菌内毒素国家标准品（系大肠杆菌提取，批号981），中国药品生物制品检定所提供。

CA，上海生工生物工程有限公司出品。

无热源生理盐水（NS）,北京大学附属第一医院提供。

HeraeusD-37520（Osterode）低温高速台式离心机，美国Kendro仪器公司制造。

UV755B紫外可见分光光度计，上海分析仪器厂制造。

1.2防污染措施实验室及工作台经紫外线照射消毒1h后使用，实验所需耐高温物品均干热200℃6h，不耐热者则15磅高压蒸汽灭菌30min。

1.3动物分组与处理24只实验用日本大耳白兔（由中国兽医药品监察所实验动物室提供），体重2.0～2.5Kg/只左右，雌（无孕）雄不拘。

临床检查确认健康后，单笼、颗粒饲料预饲养3天，自由饮水，编号并随机分为3组，每组8只。

第Ⅰ组为NS对照组，静脉注射等量无热源生理盐水；第Ⅱ组为ET致病组，静脉注射ET400EU/kg；第Ⅲ组为ET+CA拮抗组，先静脉注射CA溶液200mg/kg，在2分钟内接着静脉注射ET400EU/kg。

1.4样品采集与制备

1.4.1样品采集：

三组兔处理后0.5、1、3、5、7小时分别从耳缘静脉采血5ml于0.1ml（10mg/ml）肝素抗凝管中，用于置备ECM。

1.4.2ECM制备：

按照赵西龙等的方法，做相应改进后，制备ECM。

1.4.3ECM蛋白含量测定：

采用双缩脲法，以牛血清白蛋白为标准，将ECM蛋白浓度调至1mg/ml。

蛋白定量（双缩脲法）试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。

1.5检测项目及方法用定磷法分别测定ECM的Na+-K+-ATPase、Ca2+-ATPase和Mg2+-ATPase的活力。

ATPase测试盒由南京建成生物工程研究所提供。

ATPase活力单位以每小时（h）每毫克蛋白（mgprot）分解ATP产生的无机磷（Pi）含量（μmol）表示，即μmolPi/mgprot/h。

1.6统计与分析实验数据采用社会统计学软件（SPSS12.0）进行统计分析，各组数据以平均值（

）±标准差（SD）表示，组间差异采用显著性t检验。

2结果

2.1ECM的Na+-K+-ATPase活性变化由表1可见，Ⅱ组ECM的Na+-K+-ATPas活性在1、3h分别高于Ⅰ组（P<0.01，P<0.05），而5、7h时均低于Ⅰ组（P<0.01）；Ⅲ组则全部高于Ⅱ组（第0.5、1h时P<0.05，第3、5、7h时P<0.01）。

2.2ECM的Ca2+-ATPase活性变化由表2可见，Ⅱ组ECM的Ca2+-ATPase活性在0.5、1、3h分别高于Ⅰ组（P<0.05、P<0.01、P<0.05），而5、7h时均低于Ⅰ组（P<0.01）；Ⅲ组则全部高于Ⅱ组（第0.5时P<0.05，第1、3、5、7h时P<0.01）。

2.3ECM的Mg2+-ATPase活性变化由表3可见，Ⅱ组ECM的Mg2+-ATPase的活性在1、3h分别高于Ⅰ组（P<0.01），而5、7h时均低于Ⅰ组（P<0.01）；Ⅲ组除第1h外均高于Ⅱ组（第0.5时P<0.05，第3、5、7h时P<0.01）。

表1红细胞膜Na+-K+-ATP酶活性变化

Table1Na+-K+-ATPaseactivitiesinerythrocytemembraneofrabbits

（μmolPi/mgprot）

Groupn

Hoursaftertreatment（h）

0.51357

ⅠⅠNS8

ⅡET8

ⅢET+CA8

7.745

±0.560

8.050

±0.657

8.889

±0.642△

7.090

±0.612

8.710

±0.444﹡﹡

9.664

±0.751△

7.412

±0.781

8.380

±0.765﹡

9.925

±0.564△△

7.908

±1.011

5.700

±0.804﹡﹡

7.116

±0.582△△

7.198

±0.772

4.850

±0.522﹡﹡

7.141

±0.540△△

﹡P<0.05,﹡﹡P<0.01vsgroupⅠ;△P<0.05,△△P<0.01vsgroupⅡ,allvaluesareexpressed

as

+s,thesameinthefollowingtables.

表2红细胞膜Ca2+-ATPase酶活性变化

Table2Ca2+-ATPaseactivitiesinerythrocytemembraneofrabbits

（μmolPi/mgprot/h）

Groupn

Hoursaftertreatment（h）

0.51357

ⅠⅠNS8

ⅡET8

ⅢET+CA8

8.691

±0.680

9.505

±0.867﹡

10.395

±0.589△

7.949

±0.734

8.945

±0.494﹡﹡

10.284

±0.736△△

8.118

±0.838

9.050

±0.765﹡

10.925

±1.214△△

8.415

±0.685

6.063

±0.622﹡﹡

8.609

±0.823△△

8.987

±1.121.

5.730

±0.667﹡﹡

7.379

±0.515△

表3红细胞膜Mg2+-ATPase酶活性变化

Table3Mg2+-ATPaseactivitiesinerythrocytemembraneofrabbits

（μmolPi/mgprot/h）

Groupn

Hoursaftertreatment（h）

0.51357

ⅠⅠNS8

ⅡET8

ⅢET+CA8

5.137

±0.791

5.601

±0.967

6.591

±0.667△

5.662

±0.598

7.620

±0.701﹡﹡

7.894

±1.048

4.992

±0.652

7.163

±0.791﹡﹡

8.725

±0.859△△

4.773

±0.841

3.950

±0.599﹡﹡

7.748

±0.568△△

5.465

±0.989

3.771

±0.531﹡﹡

6.126

±0.669△△

3讨论

ECM的脂质双分子层中分布着多种膜蛋白，ATPase就是其中重要的膜固有蛋白脂质复合体。

ATPase可分为：

Na+-K+-ATPase、Ca2+-ATPase和Mg2+-ATPase。

Na+-K+-ATPase通过水解ATP，达到逆化学梯度维持细胞内外Na+与K+的浓度，进而保持膜内外离子电化学梯度并参与细胞的能量代谢，对维持细胞正常生理功能极为重要。

Ca2+-ATPase功能是将Ca2+转移到细胞外，维持细胞内外电位平衡和在细胞信息传递过程中发挥着重要作用，胞内Ca2+过多会造成细胞膜的毒性损伤。

Mg2+是前两种酶的激活剂，其浓度高低可直接影响到它们的活性，Mg2+-ATPsse就是调节细胞内外Mg2+离子流并保证膜的完整性。

本实验研究发现ET可使ECM的三种ATPase在5、7小时活性明显降低，推断可能的机制为：

ET诱生大量自由基致膜抗氧化能力降低、脂质过氧化物蓄积，攻击膜蛋白，导致膜蛋白微环境改变，破坏了膜的流动性和完整性，特别是膜上的酶类，使ATPase活性降低甚至丧失；由于ATP酶分子疏基中富含的脯氨酸、半胱氨酸、酪氨酸等都易受自由基的攻击而氧化，使得ATPase活性降低；ET引起脂质过氧化产物产生过多，与膜蛋白交联形成Schiff碱，抑制膜ATPase的活性；ET导致一氧化氮（NO）过量生成，NO可破坏酶分子中的酪氨酸，对ATPase有明显的抑制作用。

而结果显示在ET作用的前3h内三种ATPase活性均出现增高，我们推测为ET致病早期机体处于能量高活性代谢状态，消耗大量ATP，故对ATPase起到负反馈调控作用，刺激ATPase使其活性上升，逆电化学梯度进行Na+、K+、Ca2+、Mg2+等转运来保持胞内外离子平衡，维持细胞和机体正常功能。

但随着内毒素血症的进一步加重，如前所述，失代偿后ATPase的活性会逐渐下降甚至消失。

根据Rietschel“干扰ET结构或干扰含有ET结构的膜的药物都可以帮助杀死细菌”的理论，从ET分子含有大量磷酸基带负电荷，而维持这种负电荷的存在可能是ET发挥生物活性的必要条件之一的推断出发，设想多价阳离子可直接与携带阴离子的类脂A部分特异性结合，使其不能介导相应的生物学活性。

因此我们以CA作为多价阳离子拮抗剂进行ET保护作用的研究，结果显示：

与Ⅱ组比较，除1h时Mg2+-ATPase的活性无显著差异（P>0.05）外，Ⅲ组中所有ATPase的活性均著增强（P<0.05，P<0.01），说明CA对膜ATPase活性有明显保护作用。

以往实验已证实在体外CA可直接破坏ET正常网状结构，使其失去生物学活性，而本实验的结果说明在兔体内从ECM的ATPase活性变化上看，CA对ET具有拮抗作用。

尽管CA对ET是直接灭活还是CA本身就具有对ATPase的保护作用，还有待于进一步研究，但本实验结果已为人、畜感染性休克发病机制的进一步研究及治疗提供了新的思路。

AlterationofEndotoxinonATPaseActivitiesofErytherocyteMembraneandProtectionofCationAinRabbits

AbstractAim:

ToinvestigatethealterationofendotoxinonATPaseactivitiesoferytherocytemembraneinrabbitsandtheprotectionofCationA.Methods:

ThedetectingPiwasusedtomeasurethreeATPaseactivitiesoferytherocytemembraneofthreegroups:

thenormalcontrols（groupⅠ）,endotoxintreatmentgroup（groupⅡ）andCationandendotoxintreatmentgroup（groupⅢ）.Results:

ThreeATPaseactivitiesingroupⅡwerehigherthanthoseofgroupⅠatthe0.5h,1h（P<0.05,P<0.01）andsignificantlydecreasedatthe5h,7h（P<0.01）exceptthatthealterationofNa+-K+-ATPaseandMg++-ATPaseactivitieswerenosignificantdifferenceascomparedtogroupⅠatthe0.5h（P>0.05）.ExceptnosignificantdifferenceinMg++-ATPaseactivitiesatthe1h（P>0.05）,thesignificantlyincreaseinthreeATPaseactivitiesingroupⅢwereobservedascomparedtogroupⅡ（P<0.05,P<0.01）.Conclusion:

TheendotoxincouldactivatethreeATPaseactivitiesonthemembraneintheprimaryageofadministration,soonafterwa