pET表达载体.docx

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pET表达载体

表达载体pET

A.pET系统是有史以来在E.coli中克隆表达重组蛋白的功能最强大的系统。

目的基因被克隆到pET质粒载体上，受噬菌体T7强转录及翻译（可选择）信号控制；表达由宿主细胞提供的T7RNA聚合酶诱导。

T7RNA聚合酶机制十分有效并具选择性：

充分诱导时，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白；诱导表达后仅几个小时，目的蛋白通常可以占到细胞总蛋白的50%以上。

尽管该系统极为强大，却仍能很容易地通过降低诱导物的浓度来削弱蛋白表达。

降低表达水平可能可以提高某些目的蛋白的可溶部分产量。

该系统的另一个重要优点是在非诱导条件下，可以使目的基因完全处于沉默状态而不转录。

用不含T7RNA聚合酶的宿主菌克隆目的基因，即可避免因目的蛋白对宿主细胞的可能毒性造成的质粒不稳定（详见I.F.部分）。

如果用非表达型宿主细胞克隆，可以通过两种方法启动目的蛋白的表达：

用带有受λpL和pI启动子控制的T7RNA聚合酶的λCE6噬菌体侵染宿主细胞，或者将质粒转入带有受lacUV5控制的T7RNA聚合酶基因的表达型细胞。

在第二种情形下，可以通过在细菌培养基中加入IPTG来启动表达。

尽管有时（例如非毒性目的蛋白）可以直接将目的基因克隆到表达型宿主细胞中，但这种策略并不是通用做法。

两种T7启动子以及多种拥有不同抑制本底表达水平的宿主细胞共同构成了一个极为灵活而有效的系统，使各种目的蛋白得以最优化表达。

所有pET载体以及相关产品均以试剂盒形式提供，用户可以很方便地进行克隆、表达检测以及纯化目的蛋白的所有操作。

pET表达系统包括质粒和宿主菌。

您可参考系统组成部分，选择符合具体需要的载体/宿主菌最佳组合。

B.使用许可及协议

Novagen的T7表达系统，包括细菌、噬菌体和带有T7RNA聚合酶基因的质粒，均依照非商业用户应用声明相应条款有条件提供。

详情请垂询。

C.系统组成

pET表达系统提供目的基因克隆和表达所需的核心试剂。

选定的pET载体DNA，10µg

宿主菌BL21，BL21（DE3）以及BL21（DE3）pLysS甘油菌1,2

诱导对照克隆，甘油储存物

系统加感受态细胞包括所有上述组分以及一套3种直接用于高效转化pET重组子的感受态宿主细胞。

每种宿主菌感受态细胞足够用于10次转化：

0.2ml分装NovaBlue，BL21（DE3）以及BL21（DE3）pLysS感受态细胞

SOC培养基

对照质粒

1、pET多肽表达系统包括BLR和BLR（DE3）pLysS宿主菌而非BL21系列宿主菌。

2、pETTrx融合系统32包括AD494系列以及BL21系列宿主菌。

单独提供的组分和相关产品：

参见Novagen目录或Novagen网站（）pET载体系

统和感受态细胞完全列表。

D.选择合适的pET载体

pET载体最初由Studier及其同事构建（StudierandMoffatt,1986;Rosenbergetal.,1987;Studieretal.,1990）。

Novagen开发的系列新pET载体则使目的蛋白的克隆、检测以及纯化更加容易。

载体大致可分为两大类：

转录载体和翻译载体。

•转录载体用以表达本身带有原核核糖体结合位点和AUG起始密码子的目的基因。

只有3种转录载体：

pET-21（+）、pET-24（+）和pET-23（+）。

•翻译载体包括来自T7噬菌体主要衣壳蛋白的高效核糖体结合位点，用于表达那些不带有核糖体结合位点的目的基因。

翻译载体的详细信息请参考pET载体特点一览表（第7页）。

翻译载体在命名上与转录载体不同，多一个字母后缀，例如pET-21a（+），表示相对于BamHI克隆位点识别序列GGATCC的阅读框。

所有带后缀a的载体从GGA三联密码子开始表达，带b的从GAT开始，带c的从BamHI识别序列ATC三联密码子开始。

带d后缀的载体阅读框和带c的一样，不同的是它们有一个上游NcoI克隆位点而非NdeI位点以便直接将目的基因克隆到AUG起始密码子。

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基本考虑因素

选择合适的pET载体通常要综合考虑很多因素。

其中包括下列一些基本因素：

•目的蛋白的应用

•目的蛋白已知特定信息

•克隆策略

pET载体的应用多种多样。

例如分析级表达量的蛋白用于活性分析，筛选及确定突变，筛选配体相互作用，制备抗原等。

大量活性蛋白用于结构研究，作为试剂或制备亲和基质。

可能有多种载体都能满足表达用于筛查或抗原制备所需的分析级表达量的要求，但是，能用于大量纯化的载体-宿主菌-培养条件的最佳组合条件往往是唯一的。

如果要连续生产大量高活性的目的蛋白，那么多花些功夫摸索载体-宿主菌-培养条件的组合以便找到最佳条件，是非常值得的。

任何有关目的蛋白的信息都有助于选择合适的载体。

例如，有些蛋白表现活性要求一端或两端均无外源序列。

大多数pET载体可以克隆非融合序列；但是，如果特定翻译起始序列在E.coli中不能被有效使用，表达水平也会受到一定的影响。

在这种情况下，通常是构建一种带有高效表达的氨基末端序列的融合蛋白（参见pET载体特点总表，第7页，N端融合表达），并在纯化完成后用特定的蛋白酶切去融合序列。

不需连接反应的克隆（LIC）在这种情况中特别有用，可以通过肠激酶或Xa因子切去所有载体编码的氨基末端序列（参见pET载体特点总表，第7页）。

不同的克隆策略、对限制性酶切位点及阅读框的不同要求，会影响对载体的选择。

许多pET载体具有同样的限制性酶切位点，用户可以仅准备一次目的插入片段，将其插入到多个载体中。

不同的要求可以考虑采用不同的PCR克隆策略。

LIC载体试剂盒是一种非常有用的产品，可以用来以PCR制备插入片段却避免了限制性酶切消化载体和插入序列的操作。

蛋白溶解性及细胞定位

一旦确定了用途和克隆策略，下一步就是判断目的蛋白在细胞中的定位和可溶性。

许多后续应用要求目的蛋白以具有生物活性的可溶状态表达。

而目的蛋白的可溶性常常受很多因素影响，包括特定的蛋白序列等。

在大多数情况下，可溶性并非有或无的现象，载体、宿主菌及培养基的不同选择可以增加或降低可溶/不溶蛋白的量。

正确选用合适的载体和宿主菌组合会明显提高目的蛋白可溶部分比例及活性。

载体可以通过三种方式改善目的蛋白的溶解性或正确折叠：

1）与本身溶解性高的多肽序列融合表达[例如谷胱甘肽-S-转移酶（GST），硫氧还蛋白（Trx）及NusA（NutilizationsubstanceA）]；2）与催化二硫键形成的酶融合表达（例如Trx，DsbA，及DsbC）；或者3）与信号序列融合表达，输出到细胞周质。

如采用蛋白位于细胞质的表达载体，可选用允许二硫键在胞质中形成的宿主菌株来使目的蛋白正确折叠（例如带有trxB和gor突变的菌株，参见第12页）。

要获得可溶的活性蛋白，还可以考虑选用能将蛋白转运到细胞周质的载体，因为细胞周质的环境更有利于蛋白折叠和二硫键的形成。

因此应选用那些带有信号肽的载体。

DsbA和DsbC是pET-39b（+）及pET-40b（+）携带的催化二硫键形成/异构化的细胞周质酶。

pET系统中还提供许多不带DsbA或DsbC编码区而具有信号序列的载体供选择（参见第7页表）。

许多情况下，目的蛋白聚集成不溶的没有生物活性的结构，称为包涵体。

形成包涵体较有利于纯化：

1）容易通过离心收获浓度高而相对纯净的蛋白；2）包涵体保护蛋白免受蛋白酶水解。

另外，毒性蛋白以无活性的包涵体形式表达，不会影响宿主菌的生长。

纯化方法中有一些专用于纯化细胞质中的包涵体。

收集包涵体后将其溶解，可以使目的蛋白在体外重折叠。

采用这种方法能够获得很高的蛋白产量并避免宿主菌中的蛋白酶降解。

然而，不同蛋白重折叠为活性蛋白的效率大不相同，有时则非常低。

因此，此法仅建议用于制备抗原或用于不特别要求正确折叠的应用情况。

pET-17xb以N端融合蛋白形式表达全长220aaT7基因10蛋白，并形成包涵体。

pET-31b（+）也是表达融合蛋白包涵体的代表，非常适合制备小蛋白和多肽。

融合标签

融合标签用于检测和纯化目的蛋白，有时也通过增加目的蛋白在细胞质中的可溶性或帮助将目的蛋白运转到细胞周质中以提高目的蛋白的生物活性。

配合特定应用的要求，你可以制备带有以下标签的融合蛋白：

S•Tag™，T7•Tag®，GST•Tag™，His•Tag®，HSV•Tag®或Nus•Tag™，很方便用WesternBlot检测。

这其中有些多肽（融合序列）很小，对检测试剂的特异性和灵敏度有特别的要求。

His•Tag，GST•Tag，S•Tag以及T7•Tag亦可用相应的树脂及缓冲液试剂盒进行亲和纯化。

使用S•Tag及GST•Tag检测试剂盒可以对粗提物中的融合蛋白或纯化的蛋白进行精确定量测定。

FRETWorks™S•Tag分析试剂盒基于一种特别的材料能通过荧光检测1fmol以下的融合蛋白。

His•Tag是常用的纯化蛋白的融合标签，特别是那些以包涵体形式表达的蛋白。

可以将蛋白在完全变性条件下溶解，继而进行亲和纯化。

CBD•Tag™序列也常用于低成本亲和纯化。

尤其适用于重新折叠操作[pET-34b（+）和35b（+）带有CBDclos•Tag序列]；只有正确折叠的CBDs方能与纤维素基质结合，而折叠不正确的组分则可通过CBinDTM亲和纯化操作有效去除。

尽管许多标签都可用于固定目的蛋白，CBD•Tag却因纤维素基质本身极低的非特异性结合和生物兼容性而特别值得推荐。

据报道Nus•Tag™，Trx•Tag™及GST•Tag™序列可以增加融合表达蛋白的溶解性。

氨苄抗性的Nus•Tag和Trx•Tag载体与Origami™，OrigamiB及Rosetta-gami™等能在细胞质中形成二硫键的宿主菌配合使用（参见第12页）。

下表列出了各种融合标签及对应的pET载体。

有些pET载体可带有多个5'端融合标签（参见第7页）。

另外，许多载体能表达两端带有不同的多肽标签的融合蛋白。

选用在5'端标签与目的序列间有蛋白酶切位点（凝血酶，肠激酶，Xa因子）的载体可以在纯化完成后切去一个或多个融合标签。

表达C-端融合序列时要特别注意的是：

（1）插入序列不含终止密码子；

（2）克隆保留正确的阅读框。

pET载体各种融合标签

E.pET载体克隆策略

将编码蛋白的DNA克隆到pET载体上有多种策略。

利用多克隆位点中的特定限制性酶切位点或非连接反应依赖性克隆方法（LIC）能很方便地完成克隆。

LIC方法不需要进行限制性酶切及连接反应，LIC插入片段可以被迅速地克隆到多功能LIC载体上，适用于高通量克隆。

所有pET载体图谱可以参阅网站相关信息。

所有pET翻译载体在克隆和标签区域后以3种阅读框形式提供翻译终止密码子以及下游T7转录终止子。

终止子对于大多数蛋白的高效表达并非必要，但对于一些带有方向与目的基因一致的氨苄抗性基因（β-内酰胺酶）的pET质粒情况就不同了。

如果T7转录终止子在克隆时被去掉，就会现随目的蛋白增加，IPTG依赖的β-内酰胺酶（Mr31.5kDa）累积的情况，因为这时T7RNA聚合酶造成高效通读转录。

不同pET载体在邻近克隆位点处具有编码不同的多肽“标签”的序列，在定位、检测或纯化目的蛋白时提供方便。

选用的克隆方式将决定这些“标签”或载体的附加氨基酸是否与目的蛋白一起融合表达。

后续章节将介绍几种融合或非融合表达的克隆方法。

制备不带融合标签的天然蛋白几乎所有pET载体都能表达不带载体编码序列的蛋白。

许多载体提供一个NdeI或NcoI位点，以便在插入编码序列5'-端克隆进AUG起始密码子。

与此类似，在插入片段中带上翻译终止密码子，就可以避免在蛋白的C-端带有载体编码序列。

在许多pET载体中，NcoI位点（CCATGG）中的ATG三联密码子编码T7RNA聚合酶转录产物N-端甲硫氨酸AUG起始密码子。

任何目的基因或PCR制备的插入片段，若在开放阅读框的起始位置带有NcoI位点或与NcoI匹配的粘末端[BspHI（TCATGA），BspLU11I（ACATGT），以及AflIII（ACRYGT）和StyI（CCWWGG）]，均可克隆入NcoI位点。

注意，如果目的基因内部编码多个相同酶切位点，使用这些限制性酶切位点将十分复杂。

此外，若每个限制性酶切位点作为下一个三联密码子的第一个核苷酸，可能无法得到天然蛋白。

如果是这种情况，可以考虑采用某些限制性酶切去识别位点“下游”序列，以期得到天然目的蛋白（见下表）。

酶（同裂酶）识别及切割位点产生的粘端（参见pET载体特点总表，第7页）

BbsI（BpiI,BpuAI）5’-GAAGAC（N）2–3’

3’-CTTCTG（N）6-5’

GAAGACNNNNNNN

CTTCTGNNNNNNN

BsaI（Eco31I）5’-GGTCTC（N）1-3’

3’-CCAGAG（N）6-5’

GGTCTCNNNNNN

CCAGAGNNNNNN

BsmBI（Esp3I）5’-CGTCTC（N）1-3’

3’-GCAGAG（N）5-5’

CGTCTCNNNNNN

GCAGAGNNNNNN

BspMI5’-ACCTGC（N）4–3’

3’-TGGACG（N）8-5’

ACCTGCNNNNNNNNN

TGGACGNNNNNNNNN

任何上述限制性酶切位点都可以通过PCR引物设计得到，从而获得与NcoI匹配的粘端。

要注意的是，和许多采用限制性酶切消化策略一样，如果目的基因编码完全雷同酶切位点时，这种简便方法的使用就会受到一定的限制。

但是，不太可能某个插入片段同时包含以上4种酶位点。

制备以蛋白酶切去融合标签的天然蛋白GST•Tag™[pET-41a-c（+），42a-c（+）]和Nus•Tag™[pET-43.1a-c（+），pET-44a-c（+）]载体上，在编码Xa因子，肠激酶或凝血酶酶切位点序列内带有PshAI或SmaI限制性酶切位点。

利用这些产生平末端的限制性酶（如下图示），Xa因子、肠激酶或凝血酶即可从融合蛋白上切去所有载体编码序列。

凝血酶的酶切效率会受到紧邻酶切位点的氨基酸影响。

选用非极性或非酸性氨基酸作为起始的2到3个氨基酸有利于提高凝血酶酶切效率（Chang，1985；LeBonniec，1991；LeBonniec，1996）。

不需连接反应的克隆方法（LIC）

LIC是设计用于不需限制性酶切和连接反应而定向克隆PCR产物的方法（AslanidisanddeJong，1990；Haunetal.，1992）。

用LIC法制备的pET载体有不互补的12–15碱基单链粘端，与目的插入片段上相应粘端互补。

扩增目的插入片段的引物5'序列要与LIC载体互补。

T4DNA聚合酶的3'?

5'外切活性经短时间即可在插入片段上形成单链粘端。

由于只能由制备好的插入片段和载体互相退火形成产物，这种方法非常快速高效，而且为定向克隆。

pETLIC载体上所有载体编码的氨基酸序列都可以通过肠激酶或Xa因子去掉。

LIC克隆策略详见操作手册TB163和TB205。

F.pET系统蛋白表达的调控

即使在没有IPTG存在的情况下，也会有少量lacUV5启动子表达的T7RNA聚合酶，因此存在目的蛋白的本底表达。

任何重组蛋白在E.coli内表达都会或多或少地影响宿主的正常功能，并对宿主产生“毒性”。

不同的外源蛋白毒性也不同。

如果目的基因产物对E.coli毒性极大，这种本底表达就足以阻碍细胞生长以及影响在λDE3溶原菌中质粒的稳定性。

pET系统功能非常强大，你可以根据目的蛋白的特点，通过选用T7/T7lac启动子，pLysS或pLysE宿主菌，以及培养基外加葡萄糖等方法严紧控制蛋白表达水平。

也要注意，不要因为过度控制造成表达水平过低。

因此，仔细了解下列工具的功能特点，以及根据实际经验为特定目的蛋白表达选择这些工具，两方面都很重要。

T7lac启动子

控制基础表达的手段之一是采用带有T7lac启动子的载体（Studieretal.，1990；DubendorffandStudier，1991；见第7页表）。

这些质粒在紧邻T7启动子的下游有一个lac操纵子序列。

它们同样带有常规启动子以及编码lac阻遏蛋白（lacI）的序列，T7lac和lacI启动子位置交错。

采用这种载体及DE3溶原菌，lac阻遏蛋白可以作用于宿主染色体lacUV5启动子，抑制宿主聚合酶转录T7RNA聚合酶，也作用于载体T7lac启动子，以阻断任何T7RNA聚合酶导致的目的基因转录。

只有极少数毒性极大的目的基因造成质粒在BL21（DE3）或HMS174（DE3）中不稳定（DubendorffandStudier，1991）。

注意：

结合pLysS或pLysE宿主菌，蛋白表达有被过度调节的可能（见载体与宿主菌共同影响表达水平，见本页）。

pLysS和pLysE宿主菌

另一个为目的基因提供稳定性保证的方法是在拥有兼容的氯霉素抗性、编码表达少量T7溶菌酶（T7RNA聚合酶天然抑制物）的宿主菌中表达（MoffattandStudier，1987；Studier，1991）。

T7溶菌酶是一种双功能蛋白：

它能够切割大肠杆菌细胞壁肽聚糖层（Inouyeetal.，1973），它也可与T7RNA聚合酶结合，阻止转录（ZhangandStudier，1997；Huangetal.，1999）。

T7溶菌酶由克隆到pACYC184BamHI位点的T7溶菌酶基因供给细胞（ChangandCohen，1978）。

克隆片段（T7DNA的10,665–11,296bp；DunnandStudier，1983）在紧邻溶菌酶基因处还有T7RNA聚合酶3.8?

promoter启动子。

由pACYC184的tet启动子控制的溶菌酶基因，按这种序列排列的质粒被称为pLysE，带有这种质粒的菌株会高水平积累溶菌酶。

序列反向排列的质粒被称为pLysS；带有这种质粒的细胞积累溶菌酶的水平要低得多。

注意，从pLysS宿主菌表达溶菌酶同样受培养条件影响。

因为上游的CAT抗生素抗性基因由一个代谢产物抑制敏感启动子调节，pLysS宿主菌在没有葡萄糖生长到平稳期时会产生高水平cAMP和更高的CAT启动子活性。

而当细胞培养到平稳期时，高CAT启动子活性会提高溶菌酶水平（NovyandMorris，2001）。

而如果T7溶菌酶是由克隆基因提供的，大肠杆菌的耐受水平相对较高（例如细胞不会裂解），这显然是因为表达出的蛋白无法穿过细胞内膜到达肽聚糖层。

两种溶菌酶质粒都不会干扰对含有该种质粒细胞的转化；pLysS对细胞生长影响很小，而pLysE会明显降低宿主菌的生长水平。

pLysE提供的高水平的溶菌酶会大幅度增加蛋白表达的滞后时间，降低通过诱导T7RNA聚合酶表达目的基因的最高水平。

含有相对无害的目的基因的宿主细胞可以在IPTG存在下持续生长，pLysE对这些细胞蛋白表达的有效阻滞作用在某些情况下是一个有用的特点。

pLysS和pLysE溶原菌对带毒性基因的载体的耐受性有所提高：

不稳定的质粒变得稳定，无法构建成功的质粒能够获得和表达。

pLysE造成细胞生长缓慢并有裂解倾向，在大多数情况下使用不便。

对于毒性极大的基因，带有T7lac启动子的质粒和pLysS宿主菌是最佳选择。

有pLysS（或pLysE）存在时制备细胞抽提物特别方便。

目的蛋白表达后，收集细胞并重悬于50mMTris-HCl，2mMEDTA，pH8.0缓冲液。

简单冻融，或加入0.1%TritonX-100，细胞内的T7溶菌酶即可有效裂解细胞。

PopCulture™和BugBuster™蛋白抽提试剂可以帮助带有pLysS和pLysE质粒的菌株充分释放蛋白。

这个特点使带有pLysS质粒的细胞在即使不特别要求目的质粒稳定性的情况下，仍然不失为一种不错的选择。

注意，在利用重组子带有信号序列分离细胞周质部分蛋白时，建议不使用pLysS或pLysE质粒（因为宿主产生的T7溶菌酶会使细胞膜崩溃）。

载体与宿主菌共同影响表达水平

实际操作中，通常需要尝试多种不同载体/宿主菌组合以期获得拥有正确结构的目的蛋白的高水平表达。

当使用“普通”T7启动子时，pLysS提供的低水平溶菌酶对T7RNA聚合酶诱导后的目的蛋白表达影响很小，只是在出现目的基因产物时有短时延滞。

显然，产生的T7RNA聚合酶比被少量溶菌酶抑制的要多。

（估计诱导时溶菌酶水平有所提高，因为T7RNA聚合酶能够开始使pLysS质粒基因完全转录产生溶菌酶mRNA。

但是，φ3.8启动子是相对较弱的启动子（McAllisteretal.，1981），主要转录仍然来自于目的质粒采用的强启动子φ10。

）当采用T7lac启动子时，我们观察到特定诱导条件下，pLysS宿主菌中的表达水平比非pLysS宿主菌相对较低。

具体实例见Mierendorf等1994年综述，两个目的蛋白在不同T7/T7lac启动子和pLysS及pLysE宿主菌中的表达差异比较。

含葡萄糖的培养基

Grossman等（1998）首次描述，培养基中添加葡萄糖可以维持pET系统中低水平本底表达。

当培养细胞到达稳定期时，葡萄糖会作为第一碳源首先被利用，而后才是甘油等碳源。

替代碳源的代谢导致lDE3溶原菌中环AMP（cAMP）水平提高，从而刺激lacUV5启动子指导的转录，T7RNA聚合酶表达。

与野生型lac启动子相比，lacUV5启动子对cAMP刺激不如野生型敏感（EronandBlock，1971；FriedandCrothers，1984）。

但研究显示，足够的刺激可以提高T7RNA聚合酶水平，继而T7启动子调节目的基因表达（Kelley，1995；Grossmanetal.，1998；PanandMalcom，2000；NovyandMorris，2001）。

已观察到当细胞进入稳定期时，在标准培养基中补充加入葡萄糖，lacUV5启动子带来的本底表达大幅度下降（Grossmanetal.，1998；PanandMalcom，2000；NovyandMorris，2001）。

最低限度的本底表达对于pET载体在不带有pLysS质粒的宿主菌中表达至关重要，特别是当目的基因有毒性时，要生长达到稳定期（16h或过夜培养）就更是如此（Grossmanetal.,1998;NovyandMorris,2001）。

没有了来自pLysS质粒的T7溶菌酶，细胞稳定期本底表达水平就会提高。

如果外源基因有毒性，在液体培养基和