最新western blot步骤实验蛋白提取及定量相关试剂配制电泳转膜及显色过程全 1复习课程Word下载.docx

最新western blot步骤实验蛋白提取及定量相关试剂配制电泳转膜及显色过程全 1复习课程Word下载.docx

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4.每20微升细胞沉淀加入200微升添加了PMSF的细胞浆蛋白抽提试剂A。

（对于二百万Hela细胞，其细胞沉淀的体积大约为20微升或40毫克。

）

5.最高速剧烈涡旋震荡5秒，把细胞沉淀完全悬浮并分散开。

（如果细胞沉淀没有完全悬浮并分散开，可以适当延长震荡时间。

）（时间可稍长，保证细胞破碎）

6.冰浴10-15分钟。

7.加入细胞浆蛋白抽提试剂B 

10微升。

最高速剧烈Vortex5秒，冰浴1分钟。

8.最高速剧烈Vortex5秒，4℃12,000-16,000g离心5分钟。

9.立即吸取上清至一预冷的塑料管中，即为抽提得到的细胞浆蛋白。

可以立即使用，也可以冻存。

（千万不要触及沉淀，可以在沉淀上方保留极小体积的上清，以免触及沉淀。

10.对于沉淀，完全吸尽残余的上清，加入50微升添加了PMSF的细胞核蛋白抽提试剂。

（不吸尽上清会带来细胞浆蛋白的污染。

11.最高速剧烈Vortex15-30秒，把细胞沉淀完全悬浮并分散开。

然后放回冰浴中，每隔1-2分钟再高速剧烈Vortex15-30秒，共30分钟。

12.4℃12,000-16,000g离心10分钟。

13.立即吸取上清至一预冷的塑料管中，即为抽提得到的细胞核蛋白。

可以立即使用，也可以-70℃冻存。

14.对于新鲜组织：

A.把组织尽可能切成非常细小的碎片。

按照20:

1的比例混合适当量的细胞浆蛋白抽提试剂A和B（例如200微升细胞浆蛋白抽提试剂A中加入10微升抽提试剂B）。

并加入PMSF至最终浓度为1mM配制成组织匀浆液。

按照每60mg组织加入200微升组织匀浆液的比例混合组织和组织匀浆液，并在玻璃匀浆器内充分匀浆。

匀浆需在冰浴或4℃进行。

B.匀浆后把匀浆液转移到塑料离心管内，冰浴放置15分钟。

C.4℃1,500g离心5分钟。

把上清转移至一预冷的塑料管中，为抽提得到的部分细胞浆蛋白。

（吸上清时千万不要触及沉淀。

D.对于沉淀，到了这一步已经充分匀浆，但很多细胞还没有破碎。

接下去按照使用说明的步骤4开始操作，即把沉淀当做已经离心收集好的细胞沉淀操作，按照步骤4至步骤13抽提得到细胞浆蛋白和细胞核蛋白。

抽提得到的细胞浆蛋白可以和步骤14C中抽提得到的细胞浆蛋白合并。

第二部分

蛋白定量-BCA法（南京建成试剂盒）

一、实验仪器：

试管、微量移液器、旋涡混匀器、37℃水浴箱（气浴箱）、可见分光光度计（562nm）

二、适用范围：

本试剂盒可测各种动物血清（浆）、组织、培养细胞、细胞培养上清及植物等样本中的蛋白含量。

三、试剂组成及配制

试剂一：

粉剂2支、稀释液12.5ml2瓶

试剂一应用液的配制：

取试剂一粉剂1支与试剂一稀释液1瓶混匀，溶解完全后4度待用。

试剂二：

250μl2支

工作液的配制：

按试剂一应用液：

试剂二=50:

1的比例配制，混匀后待用，用多少配多少。

试剂三：

终止剂储备液20ml1瓶

终止剂应用液：

取终止剂储备液用双蒸水5倍稀释后备用，4度冷藏

试剂四：

563ug/ml蛋白标准液0.2ml1支，4度保存1个月（可分装-20冷冻）

四、操作步骤：

1、样本前处理：

①、动物组织样本：

准确称取组织重量，按重量（g）：

体积（ml）=1:

9的比例，加入9倍体积的生理盐水，冰水浴条件下机械匀浆，2500转/分，离心10分钟，取上清液，待测。

②、植物组织样本：

9的比例，加入9倍体积的匀浆介质，冰水浴条件下机械匀浆，3500转/分，离心10分钟，取上清液，待测。

③、血清（浆）样本：

按血清（浆）︰生理盐水=1︰49的比例稀释，待测。

④、其它液体样本：

按比例稀释，测定范围为20～2000μg/ml，（不同的样本稀释度不一样），请在批量测试前先做1～2个样本的预实验。

2、操作表：

空白管

标准管

测定管

双蒸水（μl）

20

563μg/ml标准品（μl）

待测样本（μl）

工作液（μl）

250

漩涡混匀，37℃孵育30分钟

终止剂应用液（μl）

750

漩涡混匀，静置5分钟，562nm波长，水调零，0.5cm光径测各管OD值

五、计算公式：

六、测定原理：

碱性条件下，蛋白将Cu2+还原为Cu+，Cu+与BCA试剂形成紫色的络合物，562nm处有最大吸收峰，依据吸光度与浓度成比例，通过测吸光度即可计算待测蛋白的浓度。

七、检测范围

检测浓度下限达到20μg/ml，最小检测蛋白量达到0.5μg，在20~2000μg/ml浓度范围内有良好的线性关系。

标准曲线范围：

标准品浓度（μg/ml）

绝对OD值

0~2500

0~0.499

第三部分

Westernblot相关试剂配制

A．30%聚丙烯酰胺储备液（Acr/Bis）：

丙烯酰胺（Acr），29g；

N,N-亚甲基双丙烯酰胺（Bis），1g，去离子水溶解，37℃水浴助溶，定容至100mL。

0.45μm滤器过滤，棕色瓶4℃避光保存。

B．10%十二烷基硫酸钠（SDS）：

SDS，10g；

H2O，80mL。

68℃加热溶解，浓HCl调pH至7.2，定容至100mL，室温保存。

C．10%过硫酸铵（AP）：

AP，1g；

H2O，10mL。

避光，4℃保存。

（4℃2周）

D．分离胶缓冲液（1.5MTris-HClpH8.8）：

Tris，18.17g；

H2O80mL。

用浓HCl调pH至8.8，定容至100mL，4℃保存。

E．浓缩胶缓冲液（1.0MTris-HClpH6.8）：

Tris，12.11g；

用浓HCl调pH至6.8，定容至100mL，4℃保存。

F．电泳缓冲液（10×

）：

甘氨酸（Glycine），188g；

Tris30.2g；

H2O，800mL。

调节pH至8.3，定容至1L，4℃保存（用时稀释为1×

）。

G．5×

SDS-PAGEloadingBuffer（5mL）：

1MTris-HCl（pH6.8），1.25mL；

SDS，0.5g；

溴酚蓝（BPB），25mg；

甘油，2.5mL；

加去离子水定容至5mL。

充分混匀，分装成500μL/份，室温保存。

使用前每份加入25μLβ-巯基乙醇（2-ME），

加入2-ME的loadingbuffer可在室温下保存一个月左右。

H．考马斯亮蓝染色固定液：

40%双蒸水,10%醋酸,50%甲醇，室温保存

I．考马斯亮蓝染色液：

考马斯亮蓝R-250，250mg；

甲醇，45ml；

冰醋酸，10ml；

H2O，定容至100ml。

室温保存。

J．考马斯亮蓝染色脱色液：

醋酸，100ml；

乙醇，50ml；

dH2O850ml，充分混合，室温保存

K．膜转移缓冲液：

甘氨酸，2.9g；

Tris，5.8g；

SDS，0.37g；

加H2O600mL充分溶解，加200mL甲醇，混匀，定容至1L，室温保存。

L．TBS缓冲液：

NaCl，8.8g；

1MTis-HCL（pH8.0），20ml，加入约800H2O搅拌溶解，定容至1L，4℃保存。

M．TBST缓冲液：

1MTis-HCL（pH8.0），20ml，加入约800H2O搅拌溶解，加入0.5mlTween20后充分混匀，去离子水定容至1L，4℃保存。

N．1MTis-HCL（pH8.0）：

Tris121.1g置于1L烧杯，加入约800ml去离子水，充分搅拌，加入浓HCL约42ml，定容至1L，高压灭菌，室温保存。

第四部分

Westernblot电泳、转膜及显色过程

1、清洗

将玻璃板洗净，用ddH2O冲洗，然后晾干。

封板时保证支架与底座胶条契合，固定时两边同时均匀用力旋动齿轮把手，固定即可，不要用力过大以免压碎玻璃。

封好后可装ddH2O试试，确定不漏后再灌胶。

2、制胶

①SDS-PAGE分离胶配方表（12%Gel）

各种组分名称

各种凝胶体积对应的各种组分的取样量（ml）

10ml

15ml

20ml

H2O

3.3

4.9

6.6

30%Acrylamide

4.0

6.0

8.0

1.5MTris-Hcl（pH8.8）

2.5

3.8

5.0

10%SDS

0.1

0.15

0.2

10%过硫酸铵（AP）

TEMED

0.004

0.006

0.008

②SDS-PAGE浓缩胶（5%Acrylamide）配方表

4ml

5ml

6ml

2.7

3.4

4.1

0.67

0.83

1.0

1.0MTris-Hcl（pH6.8）

0.5

0.63

0.75

0.04

0.05

0.06

0.005

3、封胶

①按前面方法配分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。

灌入2/3的分离胶后应立即封胶，胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。

（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。

操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。

加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型。

②当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了（至少等30-40min）。

再等3min使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。

③按前面方法配5%的浓缩胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。

将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。

灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。

插梳子时要使梳子保持水平。

由于胶凝固时体积会收缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶。

4、拔梳子

灌好浓缩胶，约40-60min凝胶后均匀用力拔除梳子，若上样孔有变形，可用适当粗细的针头拨正。

5、上样

①测完蛋白浓度后，计算含20-40μg蛋白的溶液体积即为上样量。

取出上样样品至0.5ml离心管中，加入5×

SDS上样缓冲液至终浓度为1×

。

将加入loadingbuffer的蛋白样品放沸水中煮5-10分钟，高速离心30s即可上样。

上样总体积一般不超过15μl，加样孔的最大限度可加30μl体积。

②加足够的电泳液后开始准备上样，电泳液至少要漫过内测的小玻璃板，外侧漠过底部。

所有蛋白样品调至等浓度后上样，样品两侧的泳道用等体积的1×

loadingbuffer上样。

非预染蛋白Maker准备：

1MDTT2μl与5×

loadingbuffer20μl混合成稀释液22μl,然后再加入proteinMWmaker（LOW）5μl、灭菌蒸馏水73μl,混合成蛋白Maker,混合均匀后，煮沸处理5min，分装-20℃保存，取5μl进行10%-15%凝胶电泳。

6、电泳

先稳流30mA电泳至上下胶分界时改稳流45mA。

当loadingbuffer泳动到胶下缘时结束。

电泳时间较长时，应用冰块放电泳槽两边防止溶胶。

7、转膜

①剥胶：

轻启玻璃板，将胶卸下，切除浓缩胶及无用胶，右上切角标记，在冷的电转液中平衡20-60min。

②材料准备：

转一张膜需要2张滤纸（伯乐专用滤纸）和1张0.45umPVDF膜，切滤纸和膜时一定要戴手套，因为手上的蛋白会污染膜。

将切好的硝酸纤维素膜置于水上浸2h才可使用。

用镊子捏住膜的一边轻轻置于有超纯水的平皿里，要使膜浮于水上，只有下层才与水接触。

这样由于毛细管作用可使整个膜浸湿。

若膜沉入水里，膜与水之间形成一层空气膜，这样会阻止膜吸水。

③处理：

将与胶同样大小的滤纸放在转移液中浸泡片刻，PVDF膜需浸泡甲醇1-2min，再孵育于冰的电转液中5min。

④电转仪转膜：

A、打开保护罩，按照如下准备凝胶三明治：

B、从底部铂金正极开始放置：

●预湿-滤纸

●预湿-膜

●已平衡的胶

注意：

每层之间赶走气泡

C、连接顶部不锈钢阴极，盖上保护罩

D、不同蛋白需要不同优化的条件：

参考范围：

小胶10V30min或者15V15min

大胶25V30min或者15V60min

当前不要超过25V，且大胶不要超过3mA/cm2、小胶不要超过5.5mA/cm2

E、关闭电源，拔掉电极，移除胶

注：

为了防止溶胶，可将转移缓冲液提前放4℃冰箱预冷过夜

⑤膜上蛋白检测：

丽春红

2%的丽春红储备液（10×

0.4g丽春红、6g三氯乙酸、6g磺基水杨酸溶于20ml。

丽春红染色工作液：

2%的丽春红储备液1:

10稀释，即加9倍的ddH2O

染色方法：

将膜放入TBST洗一次，再置于丽春红染色工作液中，在室温下摇动染色5分钟，大量的水洗膜直至水变清无色，marker条带处用铅笔做好标记。

PVDF膜需用甲醇再活化后用TBST洗后进行封闭。

8、膜的封闭

膜用TBST洗完后，移至含有封闭液的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭1h。

再用TBST洗5秒，进入下一步抗体的孵育。

配制5%脱脂奶粉或BSA溶液：

每100mlTBST中加入5g脱脂奶粉或BSA，混匀后过滤，如不过滤会导致膜污染上细微黑颗粒。

9、一抗的孵育

一抗的准备：

将一抗按适当的比例用抗体稀释液稀释。

孵育buffer：

按抗体说明书建议的稀释倍数，用TBST稀释一抗。

一般参考推荐的稀释倍数1:

100-1:

3000，一抗浓度过高会导致产生非特异性条带。

将PVDF膜浸没于含有一抗的抗体稀释液中室温（25℃左右）轻摇3小时或放4℃冰箱过夜。

若放入4℃冰箱过夜则第二天还应放室温缓慢摇荡1小时。

10、洗涤：

一抗孵育结束后，用TBST漂洗膜后再浸洗三次（漂洗后应换容器浸洗），每次10min，以去除残留的一抗。

洗涤结束后进行二抗的孵育。

11、二抗的孵育

孵育buffer和稀释倍数：

用TBST按说明书推荐的倍数稀释二抗。

常规稀释倍数1:

1000-1:

20,000，二抗的浓度过高也会导致非特异性条带。

根据一抗来源选择合适的二抗（HRP标记），按相应比例用抗体稀释液稀释，室温轻摇1-2小时。

12、洗涤：

二抗孵育结束后，用TBST漂洗膜后再浸洗三次（漂洗后应换容器），每次10min，最后用TBS清洗一次。

抗体稀释液稀释的一抗或二抗可回收重复利用数次，抗体稀释液稀释后的抗体可4℃保存约半个月时间。

13、显色-DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒（生工）

①溶液A在使用之前，37℃温育10分钟，以免产生沉淀。

②在免疫印迹实验中，先将相应的HRP（辣根过氧化物酶）标记的二抗覆盖膜后，在37℃的情况下，于震荡器上，震荡一个半小时左右，再用TBST洗涤膜3~4次，最后一次用TBS洗涤膜，再将膜转移到阴暗处。

③显色前在干净棕色瓶子中配制显色工作液，充分混匀。

反应液

溶液A

200μl

溶液B

100μl

溶液C

20μl

④在阴暗处，将显色液加入膜上，将膜覆盖，在37℃的情况下，震荡反应5min左右即可，这时棕褐的条带出现

⑤倒掉反应液，双蒸水冲洗条带3~4次，自然干燥

⑥照相记录实验结果

小数加减法的混合运算

一、填空。

1、0.8里面有（）个0.1；

0.025里面有（）个0.001。

2、在（）里填上合适的数。

6.5千克=（）克46厘米＝（）米456克＝（）千克

6米90厘米=（）米2千克600克＝（）千克7元4角8分=（）元

3、6.8元与6.80元的大小（），计数单位（）。

二、判断题。

（对的在括号里画“√”，错的画“×

”）。

1、0.23里有23个0.01。

（）

2、小数都比整数小。

3、在8.7的末尾填上2个0，这个数的大小不变。

三、选择题。

1、下面的小数中，最接近1的是（）。

A、1.03B、0.95C、0.98

2、千分之一是（）。

A、整数部分的数位B、小数部分的数位C、计数单位

四、计算。

5.6-4.34+7.34685.7-（15.3-4.8）9.5+4.85-6.13

25.4-（15.3+7.7）3.6－1.28＋3.093.8-0.46-1.723

25.6-（0.23+5.6）-1.77 

13.75-（4.75+6.48） 

7.83+2.34-0.83+6.66 

3.82+2.9+0.18+9.1

25.48-（（9.4-0.52） 

35.6-1.8-15.6-7.2 

5.93+0.19+2.81 

7.3+2.7-7.3+2.7 

48.4+2.78+51.6-0.78 

23.4+0.8-13.4-7.2 

4.8+8.63+5.2+0.37 

3.07-0.38-1.62 

1.27+3.9+0.73+15.1 

5.84-1.8-3.2 

132.44-（58.74+19.44） 

7.5+4.8-6.5