实验室常用液体配制标准操作规程.docx

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实验室常用液体配制标准操作规程

常用液体配制标准操作规程（SOP）

国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心

二〇〇八年九月修订

一、细菌培养系统（责任人：

子峥）

二、DNA操作系统（责任人：

罗文新、瑛炜）

三、蛋白质操作系统（责任人：

少伟、顾颖、晖榕）

四、细胞培养相关（责任人：

程通、涛）

五、单克隆抗体制备系统（责任人：

毅歆、）

六、EIA系统（责任人：

胜祥、熊君辉）

一、细菌培养系统

1、LB培养基:

每1000mL加分析纯NaCl10g，蛋白胨10g，酵母粉5g，用ddH2O配制，再用10MNaOH调pH至7.4（1000mL一般加450ul），高压蒸汽灭菌15min冷却后使用。

2、固体培养基:

LB培养基中加入琼脂至1.5％，高压蒸汽灭菌15min后使用。

3、10%（g/V）氨苄青霉素钠（Ap）：

注射用氨苄青霉素钠（粉末）50g溶于500ml无菌去离子水中，溶解后分装入4ml灭菌的EP管，全程超净工作台操作，避免染菌，分装后－20度保存，培养细菌时做1000×使用。

注：

如果购买的氨苄青霉素粉末不是无菌包装的，溶解后需用0.22滤膜过滤除菌后再分装。

4、2.5%（g/V）硫酸卡那霉素（Kan）

注射用硫酸卡那霉素（液体）通常是2ml/支，含0.5g卡那霉素。

取25支药剂（50ml），加入450ml无菌去离子水中，分装入4ml灭菌的EP管，全程超净工作台操作，避免染菌，分装后－20度保存，培养细菌时做1000×使用。

注：

如果购买的卡那霉素是粉末状的非无菌包装，溶解后需用0.22滤膜过滤除菌后再分装。

5、细菌培养：

配制相应抗性培养基，每试管倒入3~4ml培养基（卡那霉素抗性培养采用标记试管），无菌牙签挑取单克隆至试管中，于37℃，220rpm培养。

剩余培养基做好抗性和日期标记，置于4℃保存。

6、化学感受态制备：

1）原理:

：

细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态，这时的菌细胞称为感受态细胞（Competentcell）。

将细菌置于0℃，低渗CaCl2溶液中时，菌细胞壁和膜的通透性增强，菌体膨胀成球型。

外源DNA与Ca2+形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物黏附于细胞表面，在经42℃短暂的热冲击处理（一般热休克90s）后能促进细胞吸收外源DNA复合物。

2）仪器、材料与试剂：

①超净工作台、低温离心机、摇床、-80℃冰箱，装液氮的泡沫盒及液氮、50ml的离心管2个，50ml的注射器及0.22um小过滤器各1个。

高压灭菌的纸、透气膜、1.5ml的EP管约350-500个，两块10cm的平皿板及接种环。

②TB缓冲液：

每200ml液体中含Mncl2.4H20（2.176g）、Cacl2.2H2O（0.44g）、Kcl（3.73g）、PIPES（0.67g）。

（注：

在电子天平上的误差<50mg,因Mncl2.4H20在PH=6.7易溶故先将其它药品用超纯水溶解,并用KOH及HCL调PH至6.7。

在加入Mncl2.4H20溶解后用超纯水定溶至相应的量，采用50ml的注射器及小过滤器过滤,一般储存在-20℃,时间<25天,否则易被氧化颜色呈粉红。

）

③LB液体培养基：

参见前面介绍。

④LB固体培养基：

参见前面介绍。

⑤1管DH5α的菌种

3）步骤：

①倒无抗性的固体培养板，用接种环沾取感受态甘油菌画线,置于37℃恒温培养箱中培养过夜。

②在超净台里采用小枪尖挑取培养板中的单克隆菌（菌落的大小约2~3mm）转接于200~250ml的LB液体培养基中,盖上透气膜。

③置于摇床上，18℃、200-250rpm速度摇约需3~5天，使OD600=0.4~0.7（对数生长期或对数生长前期）时开始制备。

④取出TB缓冲液及无菌的50ml离心管置于4℃冰浴中，预冷低温高速离心机（4℃、2500rpm、10min）。

⑤在50ml的离心管中加入约35ml-45ml的菌液，在4℃中冰浴10min。

⑥取出后放置于离心机上离心4℃、2500rpm、10min。

⑦弃上清液，在灭过菌的吸水纸上扣干（可重复多次收集菌体），先用约5~15ml的TB缓冲液重悬，再加至35ml的量（在冰上操作）冰浴10min。

⑧重复⑥+⑦的步骤一次。

⑨在35ml的TB缓冲液重悬后缓慢加入终浓度为7%的DMSO，混匀后在冰上冰浴10min。

⑩分装成100-150ul/管（1.5ml的EP管）浸入液氮中速冻，分装约300多管后转移放置于-80℃冰箱保存。

4）转化效率的评估：

①采用小量质粒快转（冰浴10min→42℃热休克90s→冰浴2min→加无抗性LB液体培养基200ul→37℃摇床复温培养30min）。

②涂Kn、AP抗性板并做阴性对照（采用ddH20代替鉴定用的大提标准质粒），可以评价出是否有染菌、突变、转化效率。

③可以用Er2566等感受态做平行对照，评估其的生长快慢情况及转化效率的高低。

转化效率=转化子总数/质粒DNA加入量（1ug/ul）,标准质粒为大提用的N31-EGFP。

5）注意事项：

①严格按照标准操作步骤，整个操作过程要注意温度（4℃冰上操作）且洁净的超净台环境防止污染。

②直接从-80℃取出的菌株培养致敏后比连续使用或4℃短期保存的细菌的转化率要高，一般是受体菌应处于对数生长期或生长前期即OD600=0.4~0.7。

③转化鉴定时，42℃准确热休克90s不要振荡，迅速置于冰上2min,按照标准操作步骤进行评估。

一般是感受态制备好在-80℃冰箱冻存2天后再做鉴定，更准确评估。

④质粒分子量的大小对转化效率也有影响，一般来说，随着质粒分子量的增大，其转化效率会相应地降低。

但当质粒在4.0kb~7.3kb时，所得的转化率基本一致。

7、电转感受态制备：

1）准备工作：

（提前一天）

1、250mlLB液体盛于1L三角瓶中；

2、1L超纯水；500mL离心管两支；10%甘油400mL；

3、1.5ml离心管和200ul枪头若干

以上物品，120℃灭菌20分钟后置于4℃保存备用

4、电转杯经纯水洗净后这置于75%乙醇浸泡

5、挑ER2738菌单克隆，接种于4mlTet抗性的LB中，于37℃190rpm过夜振荡培养。

2）感受态制备：

1、取前一夜扩增的菌液3ml接种于250mlTet抗性LB中，37℃240rpm振荡培养，约2-3小时OD值可达0.6（其间每1小时测一次OD，其值在0.4-0.8之间均可，但在0.6时效率最好）；

2、将菌液置于冰水混合物中冷浴30分钟。

同时将前一夜置于4℃保存的物品取出，置于冰水混合物中冷浴30分钟，同时将离心机预冷到4℃；

3、将菌液全部转入500ml离心管中，2500rpm，4℃离心10分钟；

4、弃上清，向离心管中加入约100ml预冷的无菌水，在冰水混合物中摇晃瓶身，使沉淀充分悬起，然后再补加200ml无菌水，与离心机中4000rpm，4℃下离心10分钟；

5、重复步骤4两次；

6、以10%甘油代替无菌水重复步骤4一次；在离心的过程中将离心管插入冰中预冷；

7、充分弃上清，加入200ul10%甘油，要换瓶身，使沉淀充分悬起，用预冷的枪头按100ul/支分装细胞于离心管中；

8、将分装好的细胞放入-80℃保存。

3）质量控制：

将电转杯从乙醇中取出，置于超净台中，用无菌风吹4小时

从-80℃取出一支感受态，立即放入冰盒里；

取1ul标准质粒（1ug/ml）加入感受态中，混匀后，加入预冷的电转杯中；

将电转条件设为2.5，电击2-3秒，立即加入1mlSOC培养基并混匀；

将混合物转入1.5ml离心管中于37℃，200rpm振荡恢复半小时；

用LB将培养物稀释至103涂于Amp固体培养基上，倒置于37℃温箱中，过夜培养。

计算效率：

效率=菌落数×103×103。

二、DNA操作系统

1、溶液I:

葡萄糖50mmol/L，EDTA10mmol/L，Tris-HCl25mmol/L，pH8.0。

2、溶液II:

NaOH0.2mol/L，SDS1%，用ddH2O现配现用。

3、溶液Ⅲ:

取5mol/LNaAc60mL，冰乙酸11.5mL，混合后加ddH2O至100mL。

4、酚-氯仿-异戊醇（25:

24:

1）

以25：

24：

1的比例混匀平衡酚、氯仿、异戊醇，保存于棕色玻璃瓶中，上覆一层Tris-Cl水相，4℃储存备用。

5、TE缓冲液:

10mmol/LTris-Cl（pH8.0），1mmol/LEDTA（pH8.0），灭菌后使用。

实验室中配有100×的TE母液，用时可用ddH2O稀释成1×使用液，灭菌后使用。

6、0.1mol/LCaCl2:

在适量纯水中溶解54gCaCl2.6H2O，定容至100mL，高压除菌后保存于4℃备用。

7、10×DNA上样buffer：

母液：

以500ml为例：

蔗糖：

200g，溴酚蓝：

0.2g，取去离子水定容至500ml，完全溶解后放置于4℃保存。

*该母液配制完正常颜色为棕红色，颜色与pH值有关；存储时间较长，每次使用时需摇匀，并注意是否长菌。

染料：

SYBERGreenI（MolecularProbe）10,000×

每次取50ul染料加入50ml母液中，充分摇匀。

分装于避光管中，即为10×DNA上样buffer，配制好的buffer均需避光4℃保存。

*配制者需督促使用者及时将避光管放回4℃，并经常检查溶液存量，染料需提前订购。

8、RNaseA（DNasefree）：

RNaseA干粉（Ameresco）溶解于0.01mol/L的CH3COONa（pH5.2）中，使终浓度为1mg/ml，加热至100℃，15min，室温冷却。

用0.1体积的1MTris-Cl调pH至7.4后，分装，于-20℃冻存。

*500ul/管分装，供分子克隆实验使用；3ml/管分装，供大提质粒使用。

RNaseA干粉需提前订购，及时检查使用情况。

三、蛋白质操作系统

（一）、电泳

1、30%丙烯酰胺

将29g丙烯酰胺和1gN，N’-亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为60ml的水中，于磁力搅拌器上搅拌至完全溶解。

补加水至终体积为100ml。

以0.45μm孔径过滤溶液，去除不溶性杂质。

查证该溶液的pH值应不大于7.0，置棕色瓶中保存于室温。

注意事项：

丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可以通过皮肤吸收，其作用具累积性。

称量丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺时应戴手套和面具。

可认为聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为它还可能会含有少量未聚合材料。

2、1.5MTris-HCl（pH8.8）

400ml水中溶解Tris-Base90.855g,浓盐酸调PH至8.8后定容至500ml

3、1.0MTris-HCI（pH6.8）

400ml水中溶解Tris-Base60.57g,浓盐酸调PH至6.8后定容至500ml

4、10%SDS

900ml水中溶解100g电泳级SDS，加热至68℃助溶，加入几滴浓盐酸调节pH值至7.2，加水定容至1L，分装备用。

5、10％过硫酸铵

称取过硫酸铵2g，适量水溶解后，定容至20mL，分装成1mL/管，于-20℃保存备用。

6、蛋白上样Buffer（6×蛋白加样缓冲液）

称取十二烷基硫酸钠12g、溴酚蓝0.6g，1MTris-Cl（pH=6.8）30ml、甘油60ml、β－巯基乙醇5ml，定容至100ml。

7、蛋白质电泳buffer（5×）

称取三羟甲基氨基甲烷15.1g、甘氨酸94.0g、十二烷基硫酸钠5.0g,在水中溶解并定容至1L。

（二）染色

1、染色液（考马斯亮蓝染液）

甲醇45％，冰乙酸10％，去离子水45％，加考马斯亮蓝R-250或G-250至0.25%，过滤后使用。

2、10×脱色液

称取KCl186.5g，加水定容至1L

3、蛋白快速银染所需溶液

（1）固定液：

400mL甲醇，500uL甲醛，加水定容至1L；

（2）20%AgNO3溶液：

20gAgNO3加水定容至100mL；

（3）Na2S2O3溶液:

0.32gNa2S2O3·3H2O,加水定容至1L；

（4）显色液（未加甲醛）：

30gNaCO3,20mL上述Na2S2O3溶液，加水定容至1L，（临用前加入甲醛，甲醛量如何确定？

）。

（5）2.3M柠檬酸：

483.22gC6H8O7·3H2O,加水定容至1L。

（三）杂交

1、电转液：

称取Tris－Base18.2g，甘氨酸86.5g，先加4L水溶解，再加甲醇1200ml,定容至6L。

2、10×TN：

称取NaCl438.3g,Tris60.57g,加入浓盐酸调节至PH8.0，定容至5L。

3、封闭液（WB用）：

称取5g脱脂奶粉，加入TN，定容至100ml。

4、TNT：

TN中加Tween-20至0.05%。

5、AP底物：

氯化钠2.902g，MgCl2.6H2O0.508g，Tris－Base6.087g，加水溶解，加浓盐酸320ul调节pH至9.5,定容至500ml

注意事项：

NBT、BCIP、N-N-二甲基甲酰胺为有毒试剂，戴乳胶手套在通风橱中操作。

配制用的EP管最好采用新管子，防止漏液，用后的空管注明有毒，用PE手套或是塑料袋包好再丢弃。

6、NBT配制：

500mgNBT粉末溶于7mlN-N-二甲基甲酰胺，3ml去离子水中，颠倒混匀，溶解即可。

7、BCIP配制：

100mgBCIP粉末溶于10mlN-N-二甲基甲酰胺中，颠倒混匀，溶解即可。

（四）纯化

1、10×裂解液：

50mmol/LTris-HCl（pH7.2），10mmol/LEDTA，300mmol/LNaCl.。

2、BufferI：

20mmol/LTris-HCl，5mmol/LEDTA，100mMNaCl。

3、8MUrea：

称取480g的尿素，用BufferI定容至1升即可。

四、细胞培养相关

（一）胰酶的配制：

（浓度为1‰，1L）

1、认真清洗配制容器，自来水20遍，去离子水5遍，超纯水润洗3遍。

2、称取牛胰蛋白酶1.0g；EDTA2g；

3、用超纯水溶解；

4、磁力搅拌器搅拌至胰酶完全溶解，溶液变得澄清；

5、超纯水定容至1L；

6、不锈钢滤器加0.22um滤纸两高温灭菌后，在超净工作台过滤；

7、在血清瓶中加入少量滤好的胰酶，置于细胞培养箱中检测是否染菌，其余置于4℃待用；

8、过滤后洗净滤器再次灭菌，避免残留的胰酶降解蛋白。

（二）DMEM配制：

1、所需试剂及材料：

试剂：

DMEM干粉（GIBCO10L）、超纯水（Milli-Q）、Na2CO3（Sigma）

材料：

10L玻璃瓶、500ml盐水瓶（灭菌）、0.22um滤膜、滤器（事先放好两层滤膜并高压灭菌）、磁力搅拌器大号搅拌子蠕动泵胶塞

2、操作步骤：

（1）10L玻璃瓶洗涤，自来水20遍，去离子水5遍，超纯水润洗3遍。

（2）在10L玻璃瓶中加入超纯水9.5L，将DMEM干粉倒入，在磁力搅拌器上搅拌溶解。

（3）按照3.7g/L加入Na2CO3。

（4）调节pH值至7.2~7.4。

（5）过滤分装，并注明名称及配制日期。

此过程注意无菌操作！

（6）最后用血清瓶取10ml左右置于细胞培养箱中检测是否染菌。

（7）清洗滤器，10L玻璃瓶，软管，将所有实验器具归位。

（三）1640、MEM培养基的配制同上，Na2CO3的用量见包装说明

（四）细胞间100×双抗（青霉素、链霉素）的配制

青霉素及链霉素配制的终浓度为1万单位/毫升。

配制的步骤以400ml为例：

1.认真清洗配制容器，自来水20遍，去离子水5遍，超纯水润洗3遍。

2.准备5瓶青霉素（80万单位/瓶）、4瓶链霉素（100万单位/瓶）。

3.加入1-2ml细胞间专用PBS进入青霉素、链霉素的瓶子，浸泡后吹吸数次至全部溶解，溶解后的液体吸入配制容器。

用PBS再次润洗装有青霉素及链霉素的小瓶子，将残留的青霉素及链霉素溶解，将液体并入配制容器，重复润洗2次。

4.用细胞间专用PBS定容至400ml，搅拌均匀。

5.将配制的母液用0.22um的滤膜过滤除菌，分装到灭菌后的4mlEP管，2ml/管,冻存于-20℃。

（4mlEP管需提前一天灭菌，烘干过夜。

）

（五）100×L-谷氨酰胺配制（浓度200mM=29.2g/L）

所需试剂及材料：

L-谷氨酰胺干粉（Sigma）、超纯水（Mili-Q）、1L烧杯、量筒、4mlEP管（灭菌）。

步骤：

1．认真清洗配制容器，自来水20遍，去离子水5遍，超纯水润洗3遍。

2．称取相应质量的L-谷氨酰胺干粉，用超纯水溶解后，0.22um小滤器过滤除菌。

按需要分装（如2ml/管）-20℃保存。

注：

勿高压灭菌，过滤后，尽快分装，切勿放在4℃过久！

（六）100×丙酮酸钠配制（浓度100mM11g/L）

所需试剂及材料：

丙酮酸钠（Sigma）超纯水（Mili-Q）1L烧杯，量筒，1.5mlEP管（灭菌）

步骤：

1．认真清洗配制容器，自来水20遍，去离子水5遍，超纯水润洗3遍

2．称取相应质量的丙酮酸钠干粉，用超纯水溶解后，0.22um小滤器过滤除菌。

按需要分装（如1ml/管）-20℃保存。

注：

勿高压灭菌过滤后，尽快分装，切勿放在4℃过久！

（七）Verson配制

1.洗净容器：

自来水10遍，去离子水5遍，超纯水3遍。

2.配制Verson（超纯水配制）：

Verson（1×）

（g/L）

KCl

0.4

KH2PO4

0.06

NaCl

8.0

NaHCO3

0.35

Na2HPO4·12H20

0.08

EDTA

0.2

3.分装到500ml盐水瓶，盖上胶塞（不用灭菌，煮过即可），插上针头（10mL以下的注射器针头），包上铝箔纸。

4.120℃，20min高压湿热灭菌，灭菌后，摆放至细胞间指定位置。

（八）细胞间PBS配液

PBS缓冲液配方：

【1L体系】

NaCl8.0g，KCl0.2g，Na2HPO4·12H2O2.9g，KH2PO40.24g

调整pH至7.4

具体步骤：

1.清洗配液瓶,自来水10遍，去离子水5遍，超纯水3遍。

（一般使用细胞间配液瓶10L体系）；

2.按上述配方准确称量物品，倒入配液瓶（注意：

若药品潮解，应更换）；

3.加入超纯水（细胞间配液用，R206），定容至准确体系，溶解完全；

4.使用细胞间pH计，调配pH至7.4；

5.使用细胞间灭菌过的500mL盐水瓶进行分装，标记，加橡胶塞针头，120℃，20min高压湿热灭菌；

6.灭菌完，摆放至细胞间相应位置。

（九）磷酸钙转染试剂

配制试剂前，认真清洗配制容器，自来水10遍，去离子水5遍，超纯水3遍。

CaCl20.5M（500ml）

CaCl2.2H2O（MW147）SigmaUltraC508036.75g

溶解于500ml超纯水，0.22um小滤器过滤除菌。

50ml样品管分装后，冻存于-20°C。

HeBS2x（1000ml）

NaCl（MW58.44）SigmaUltraS765316.36g（0.28Mfinal）

HEPES（MW238.3）SigmaUltraH752311.9g（0.05Mfinal）

Na2HPO4,anhydrous（MW142）SigmaUltraS79070.213g（1.5mMfinal）

800ml超纯水溶解后，用1MolNaOH溶液调PH值至6.98，然后定容至1000ml。

（准确的PH值对转染效率非常重要，请用细胞间的精密PH计测量PH值，测量前要校正PH计，线型要在99％～101％）

0.22um小滤器过滤除菌。

50ml样品管分装后，冻存于-20°C。

（十）酸液配制（1L）：

重铬酸钾120g

浓硫酸200ml

去离子水补至1000ml

具体步骤：

1在通风橱中架好塑料桶和搅拌器，确保稳定，不会侧翻。

2在塑料桶中10L、15L、20L的位置划好刻度线，以利于后续步骤的定容。

3在塑料桶中加入半桶去离子水，开动磁力搅拌器，缓慢倒入浓硫酸（硫酸遇水放热，倒太快会导致液体飞溅）。

4缓慢倒入重铬酸钾，定容后，搅拌至完全溶解。

注意事项：

废酸液应先用工业级的NaOH中和后方可倒往下水道，否则会腐蚀水管、污染环境，中和过程中会大量放热。

五、单克隆抗体制备系统

1、PRMI1640HT培养基（10L）:

PRMI1640干粉10包（103.9g/10L），称取丙酮酸钠（SodiumPyruvate，S）1.1g/10L，适量ddH2O溶解后加入。

称取黄嘌呤（hypoxanthn，H）136.1mg/10L＋胸腺嘧啶核苷（thymidine，T）38.8mg/10L+谷氨酰胺（L-Glutamine,L-Glu）3.48g/10L，置适量ddH2O中在45～50℃条件下溶解后加入。

加ddH2O至10L，补加NaHCO320g/10L。

用1mol/LHCl调节pH至6.8～7.0（经验值是3ml/10L）。

过滤除菌。

取少量的培养液置培养瓶中并放入CO2培养箱中，一周后，如培养中未长菌，同一期配制的基础培养液方可使用。

2、PRMI1640培养基:

PRMI1640HT培养基配制时不加H（黄嘌呤）和T（胸腺嘧啶核苷）即可。

3、过氧乙酸：

100ml的H2O2加入到200ml的乙酸中，再加入6ml浓H2SO4，放置过夜即可。

4、细胞冻存液：

90mL胎牛血清＋10mLDMSO（二甲亚砜）,4℃冻存。

EIA系统

六、EIA系统

（一）常用溶液:

1、20×CB9.6（1L）：

Na2CO331.8g；NaHCO358.6g

2、10×PB7.4（1L）：

Na2HPO4·7H2O43.43g；NaH2PO44.56g

3、2×ED：

1XPBS+0.5%酪蛋白+2%明胶+0.1%防腐剂（proclin-300）

（二）基本操作：

1、标本的采取和保存

大部分ELISA检测均以血清为标本。

血清标本只要待血清自然凝固、血块收缩后即可取得。

应注意避免溶血，红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质，以HRP为标记的ELISA测定中，溶血标本可能会增加非特异性显色。

冻结血清融解后，蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分混匀宜轻缓，避免气泡，可上下颠倒混和，不要在混匀器上强烈振荡。

混浊或有沉淀的血清标本应先离心或过滤，澄清后再检测。

反复冻融会使抗体效价跌落，所以测抗体的血清标本如需保存作多次检测，宜少量分装冰存。

2试剂的准备

按试剂盒说明书的要求准备实验中需用的试剂。

从冰箱中取出的试验用试剂应待温度与室温平衡后使用。

试剂盒中本次试验不需用的部分应及时放回冰箱保存。

3加样

在ELISA中一般有3次加样步聚，即加标本，加酶结合物，加底物。

加样时应将所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。

需稀释的样品可在板孔中加入稀释液，再在其中加入血清标本，然后在微型震荡器上震荡1分钟以保证混和。

若每孔所加样品不同,每板的加样时间不宜超过7分钟,另一方面要注意不要造成孔间污染；加酶结合物和底物时可用定量多道加液器，使加液过程迅速完成。