胶体金技术总结ⅡWord文件下载.docx
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NaCl溶液，混合，室温下放置10min；
f.观察胶体金颜色变化，记录保持红色的最低pH（X）；
g.重复
（1）-（5）步，pH梯度为X-0.6；
X-0.3；
X；
X+0.3；
X+0.6；
X+1。
h.观察胶体金颜色变化直到室温下放置2小时，记录仍保持红色的最低pH。
1.4待标记蛋白质最适稳定量的测定
先确定标记的最佳pH值，并调节胶体金溶液pH值。
a.光电比色法
制备一系列不同浓度的等体积蛋白质溶液，分别加入5ml胶体金（已调节好pH值）中，迅速混匀，然后各加入1ml10%NaCl溶液，摇匀，静置5min后测各管。
根据胶体金颗粒的大小，OD在最高吸收峰进行测定，以OD值为纵坐标，蛋白质用量为横坐标作一曲线，取曲线最先与横轴相接近的那一点处的蛋白质用量为最适稳定量。
右图10nm的胶体金溶液中蛋白质的最适稳定量为45μg/ml。
b.目测法
将待标记的蛋白质逐级稀释后，各取等体积顺序加入一系列装有1ml胶体金（已调节好pH值）的试管中混匀（由5μg～45μg，另设对照管），5min后，在上述各管内分别加入0.1ml10%氯化钠，依表1顺序进行。
表1具体的做法是按表内进行
管数
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
胶体金（mL）
蛋白质（mL）
15
20
25
30
35
40
45
10%NaCl（mL）
0.1
●当分别加入0.1ml10%氯化钠后、混匀静置2h以上观察结果。
●没有加入蛋白质的管为对照管。
●未加蛋白及加入蛋白量不足以稳定胶体金的试管，即呈现由红变蓝的聚沉现象，而加入蛋白量达到或超过最低稳定量的试管则胶体金的红颜色不变。
其中含蛋白量最低的试管即含稳定1ml胶体金的必须蛋白量。
在此基础上再加上10-20%即为稳定所需蛋白质的实际用量。
当然，在最佳pH值和蛋白浓度的确定上，以上方法也被直接忽略，这点上就显现了经验派大神们的过人之处。
1.5蛋白质的胶体金标记步骤
当蛋白质的最适稳定量及标记的最佳pH值被确定以后便可进行标记。
具体步骤如下：
a.根据用以标记的胶体金的总量计算出所需要的待标记蛋白质的总量。
b.在电磁搅拌下，将蛋白质溶液加入胶体金溶液中（pH已调），加入蛋白质时应逐滴加入，1mg的蛋白质大约5min加完。
c.在磁性搅拌下加入5%的牛血清白蛋白（BSA）使其终浓度为1%，（和）或加入3%聚乙二醇（PEgMW20000）使其终浓度为0.05%。
1.6胶体金标记蛋白质的纯化
纯化的目的是除去其中未标记的蛋白质，未充分标记的胶体金以及在标记过程中可能形成的各种聚合物。
一般在10nm以上所标记的胶体金均在可调整离心机上离心，小于10nm颗粒的胶体金用超速离心机离心，在4℃离心1h左右，弃上清，将沉淀以原体积的0.02mol/lTBSpH8.2（内含1%BSA，0.05%叠氮钠）溶解，重复离心2～3次，沉淀溶于原体积的1/10TBS中，4℃保存备用。
为了得到颗粒均匀一致的免疫金试剂，上述粗提制剂可用10%～30%蔗糖或甘油溶液作密度梯度离心，分带收集不同大小颗粒的胶体金标记蛋白制剂。
注意事项
a.不同直径胶体金所需要的蛋白量差别很大；
b.不同直径胶体金所需离心速度完全不同。
以绝大部分探针形成松散沉淀为原则。
离心力太大，会产生不可逆的探针凝聚；
离心力太小，探针无法沉下。
最好能够直接用胶体金在不同转速下离心以确定适当的离心力。
c.在冷离心机中可适当延长离心时间，同时适当减小离心力，探针活性较好。
d.标记物离心时重悬浮的沉淀是松散的，非常好复溶。
如果沉淀不容易复溶，可能是离心速度不合适或者存在过多的未饱和或未标记的胶体金颗粒。
可以弃去该沉淀。
1.7免疫金探针的质量鉴定
金标记蛋白的特异性与敏感性测定：
将可溶性抗原（或抗体）吸附于载体上（滤纸、硝酸纤维膜、微孔滤膜），用胶体金标记的抗体（或抗原）检测相应的抗原或抗体，对金标记蛋白的特异性和敏感性进行鉴定。
1.8交联物的稳定
随着特异蛋白的结合，交联物必须用适当的试剂进行稳定，通常使用BSA、明胶、PEG（聚乙二醇）或酪蛋白。
使用稳定剂有双重功能，一是它可通过封闭胶体表面未和特异性蛋白结合的位点而减少了非特异性反应；
二是它可有助于更稳定的悬液的形成。
2.金标结合垫制备
2.1缓冲液成分
将标记蛋白试剂加到结合垫上时所使用的缓冲液应该尽量地简单。
首先因为吸附在胶体金颗粒上的蛋白试剂在干燥后必须保持活性，用于使抗体及其他液态的生物试剂稳定的化合物经常会与干燥储存不相容，也因为它们改变了试剂的生物活性或者在物理或者化学上破坏了颗粒。
因此，不应该在包被缓冲液里使用盐类和去垢剂。
对胶体金颗粒，推荐的缓冲液是2mM，pH7.0的硼酸盐，并添加1%蔗糖或者海藻糖。
硼酸盐提供了缓冲能力，并且也有一点表面活性剂的性质，对颗粒的重新溶解有帮助。
蔗糖（或者海藻糖）的作用是稳定剂和重溶解，当胶体金标记物在有糖的条件下被干燥时，糖分子会形成包裹着颗粒的一层，帮助稳定生物学结构。
当样品进入垫子，糖分子立即溶解，带着颗粒从膜表面进入到液流中。
经典的组成是缓冲液+（BSA、PEG20000、蔗糖、海藻糖）+（吐温-20、tritonX-100）+NaN3+其他物质（消除干扰因素）。
2.2结合垫包被
A.包被：
将配制好的标记物溶液包被于玻璃纤维或其他适宜材料上，常见有溶液浸泡法、手工涂布法、喷金仪喷涂三种方式。
不论采取何种方式，最终要达到的目的是将标记物均匀分布于材料上，这也正式挑战生产工艺的可靠性之一。
a.溶液浸泡法：
简单易操作，但浸泡法最终残留液体较多，成本浪费较大。
其次，浸泡法使用的是过饱和原则，在结合垫转移过程中容易导至液体渗漏而造成不同张材料、同一张材料的不同位置上含有标记物的有效浓度不均匀。
有设备供应商制造了一种专门用于浸泡法的设备，该设备利用压辊的方式，将浸泡后的结合垫多余的液体除去，在一定程度上减少了上述差异。
但是否能够达到均一性要求，有待于实际使用验证。
b.手动涂布法：
相比较于浸泡法，涂布法可以保持每一张材料的包被液体量相对更均一，但溶液需要更熟练的操作者进行均匀涂布，否则也容易导至批内的CV较大。
c.喷金仪喷涂法：
这种方法更精确定量，喷涂的均一性也更好。
但据实际使用者介绍，相较于熟练的手工涂布法，设备受限于产能、效率上远远不及手工，而且在均一性上相差不明显。
B.干燥：
为了提高标记物的性能，处理过的垫子需要尽可能快速并且彻底地干燥。
以下列出了一些特定的选择：
a.常温空气干燥：
在一间受控的房间里进行干燥（温度保持18-26摄氏度，湿度低于20%RH）24h，在这种环境下进行干燥的结合垫可以保持良好的生物活性，结合垫的稳定性也能够保持2年以上。
b.高温空气干燥：
在干燥过程中加上热力（如37摄氏度）以帮助除去结合水。
这个方法可以有许多应用，隧道烘箱、干燥箱或受控的干燥房间。
要注意某些生物分子可能是热不稳定的，而缩短时间来保护活性要和彻底干燥进行平衡。
另外，需要注意的是，由于边缘效应的问题存在，热干燥过程中，边缘的水份挥发比中心快，导至液体流向于四周，干燥后的由肉眼可见的斑纹、边缘颜色深而中心浅等不均匀的现象。
c.真空冷冻干燥：
冻干机及冻干工艺的使用在食品、药品、医疗器械领域已经广泛使用，最大的优点是能够保持蛋白的生物活性，冻干颗粒的疏松状也有利于后续层析过程中，颗粒的复溶解。
相对于空气干燥工艺，能够避免边缘效应的产生。
但要注意的是，严格的工艺验证得出不同批量下的冻干工艺，不得超出范围使用。
冻干机的稳定性也是关键，冻干过程的异常终止将会带来巨大损失。
d.真空干燥：
在真空下，水份的沸点降低，这个过程可以加速水份蒸发，相对来说所需要的时间较短。
和空气干燥类似，依然存在边缘效应。
e.支撑物：
无论上述何种干燥方式，在干燥过程中均需要用于支撑结合垫的材料，需要避免的是支撑物的被腐蚀。
支撑物的日常清洁也是非常必要，防止交叉污染。
另外，结合垫与支撑物的接触也需要给予特别关注，接触方式（是否水平）以及接触点大小均会导至结合物液体的分布不均。
C.储存条件：
很重要的是，标记物一旦被干燥在垫子的材料上，就要保存在相对湿度<
20%的环境下，温度可以介于18-26℃之间。
如果垫子暴露在较高的湿度下，水会和糖分子结合，使它们变成糖浆，延缓了颗粒的重新溶解。
3.NC膜包被
3.1缓冲液成分
许多缓冲液都可以用来控制捕获性试剂溶液的pH值，比如醋酸盐、磷酸盐、硼酸盐、TRIS和碳酸盐。
如果试剂溶液用一级胺（如TRIS或甘氨酸）来缓冲，捕获性试剂里的酸性的氨基酸残基（谷氨酸和天冬氨酸）与缓冲分子的-NH3+基团可以产生盐桥，降低了捕获性试剂结合被分析物的能力。
基于同样的理由，钠是比钾要好的阳离子。
对于pH范围介于4-6之间的捕获性试剂，可以使用醋酸铵。
它们在干燥后几乎没有任何残留，因为醋酸和氨都挥发了。
A.选择合适的pH
随着捕获性试剂的溶解性下降，抗体保留在膜上的趋向增加。
蛋白质溶解度受pH的影响。
当蛋白质没有静电荷时的溶解性最低，比如在等电点（pI）。
因此，为使蛋白质的溶解度最小化，获得稳定的溶液，就需要调节pH在捕获性试剂的pI±
1单位以内。
大多数抗体的等电点介于5.5至7.5之间。
使用pH范围7.0到7.5的缓冲液或许接近最佳值。
如果不知道捕获性试剂的pI，就要靠经验确定最适pH。
B.离子强度
缓冲液的离子强度要尽量地低。
溶液中的离子可以影响膜与捕获性试剂之间的静电作用。
另外，缓冲盐和氯化钠的生理浓度增加了大部分蛋白质的溶解度，降低了膜的疏水吸附能力。
最终，随着捕获性试剂溶液的摩尔浓度增加，干燥后膜上固体残留的总量也增加。
孔隙里的固体残留会延迟膜的湿润，并在进行检测的时候改变膜的液流性质。
因此，缓冲液的摩尔浓度应该降低到可以保持稳定的pH所需的最低浓度（通常<
10mM）。
氯化钠应该不使用，除非当它对于蛋白质的溶解和稳定是绝对需要时。
一般不推荐将缓冲盐溶液当稀释液来使用。
C.使用共沉淀剂：
甲醇、乙醇或者异丙醇。
在试剂应用溶液中加入少量的醇类（1%至10%v/v甲醇、乙醇或者异丙醇）从三个独立的理由上都有极大的好处。
第一，醇类可以降低溶液粘度，降低溶液表面张力（二者都有助于溶液进入膜），减少静电排斥，而大大增加试剂运用的一致性。
第二，添加少量的醇类降低了蛋白质的溶解度，同时不产生变性或者析出。
它还可以提高蛋白质在硝化纤维膜上的吸附作用。
第三，有低浓度的醇类存在，增强了干燥和蛋白质固定。
要根据经验来决定添加醇类。
D.选择性使用去垢剂和表面活性剂
当在硝化纤维膜上添加捕获性试剂时，Tween-20和TritonTM
X-100等离液剂应该避免使用或者在<
0.01%V/V
（通常是0.01%-0.05%v/v或者w/v）去垢剂或表面活性剂。
很重要的一点是，要确认捕获性试剂确实被定位在检测线上，因为这些试剂虽然被原位干燥，却并不代表蛋白质真正地在分子水平上被吸附在硝化纤维膜上。
（右图：
去垢剂或表面活性剂的浓度对膜的不同性能特征的影响）
选择性使用：
加入的捕获性试剂溶液有时会置换膜里的去垢剂，使膜上的试剂线比周围没有处理过的区域的湿润速度慢。
发生这种情况时，样品前沿会发生变形。
极端情况下，样品前沿会绕着捕获性试剂线，包住空气（C线/T线反白）并阻碍通过这条线。
为防止这种情况，加入一点去垢剂（例如0.05%SDS或者0.005%TritonX-100）以增加试剂线的重新湿润能力有时会起作用。
E.湿度的影响：
静电力
湿度在生产过程中影响对硝化纤维膜的加工。
在湿度较低的情况下，硝化纤维膜会产生明显的静电荷。
这令膜会被不同的表面吸引或者排斥，灰尘和污垢颗粒都会吸附到膜上并且难以在不破坏膜表面的前提下去除。
环境湿度条件对点膜过程非常重要，它会严重影响C、T线的质量，特别在喷膜系统在使用过程中。
如果空气湿度太低，静电荷容易聚集在膜上，这时点膜就容易产生斑点；
而这时测试，膜上就容易产生疏水斑。
相反，空气湿度太高，膜上的毛细作用加强，这时点膜就容易引起C、T线变宽甚至扩散。
一般来说，最佳的环境湿度应保持在45~65%RH。
而且，为了保证所有要用的膜材料有均一的特性，点膜前应把膜放到工作环境平衡一段时间，最佳的平衡时间应由实验来确定。
静电荷产生的另一个更严重的问题是影响试剂的添加。
小液滴通常是荷负电的，如果液滴被静电荷排斥，试剂线的宽度可能会产生很大的变化。
极端情况下，试剂线的连续性会被破坏。
这个问题在空气喷射系统里更加显著，因为液流被转化成喷雾。
通常在过度潮湿的环境中加样比在湿度不足的环境中要好。
在标准室温（18-26℃）时，房间的湿度达到50%（45%-65%）则可以获得最好的结果。
卷到卷系统中，仅当膜从滚筒和其他表面经过而发生摩擦时就能产生静电。
在这种情况下，有必要在膜快要通过分配器头的地方安装一个在线的离子枪。
离子枪中的离子可以暂时驱散静电荷。
F.
蔗糖或海藻糖：
保护剂，减缓老化速度，也可以增加亲水力。
3.2划线：
检测线和质控线
A.两种点样方式：
划膜式和非接触点膜式。
非接触点膜式优于划膜式，划膜式为软管将抗体划到膜表面，而膜本身的物理性质为软脆，划管会在其表面留下印痕。
划痕容易对层析的金标复合物形成阻力，导至假阳性。
同时容易出现跑板时在T线位置出现若有若无一条细线，而跑板结束后消失的奇怪现象。
溶液在膜上的点样量一般情况下为极微量的（如1ul/cm），溶液在膜上的扩散是趋向两端的，喷点上去的是均匀的抗体溶液，但当干燥时线条边缘的干燥速度高于中间，中间的抗体会不断向两边扩散，所以干燥后抗体是向线条的两端聚集的。
一般情况下不影响你的试验。
如果你发现线条出现两端红，中间淡的现象，就要考虑这个问题了。
可以加如上面说的作用物质来解决。
B.膜的点样位置：
不同的T线点样位置将带来不同的灵敏度。
点样位置上移，金标复合物通过T线位置时速度变慢，反应时间增加，灵敏度升高，也可能增加假阳。
反之灵敏度降低。
这个方法可以用来改变灵敏度和消除假阳性。
从NC膜的流体动力学模型可以解释：
从x厘米移动2x厘米所花的时间通常是从0厘米移动到x厘米所花的时间的两倍。
换句话说，就是如果花1分钟移动1厘米，那就要多花2分钟来移动第二个1厘米。
这个现象意味着，C/T线的定位对可以达到的灵敏度有着重要的影响。
当从C/T线定位在离起点比较远的地方时，被检测物经过C/T线时候的速率就比较慢，溶液中被检测物的有效浓度就比较高。
由于这个原因，将C/T线定位在试剂条上相对远的位置是有好处的。
一旦确定了划线的位置，在生产过程中就不得随意变动，并且需要确认C/T线的位置是否发生了偏移或定位错误。
C.干燥条件:
必须通过把膜完全干燥来使捕获性试剂固定在硝化纤维上。
干燥效力是温度、湿度、气流和时间综合的结果。
可以达到完全干燥的方法可以参考金标结合垫的干燥方式，如果不能完全使膜干燥，可能会导至捕获性试剂在捕获线上发生损失。
D.储存条件：
很重要的是，捕获试剂一旦被干燥在NC膜上，就要保存在相对湿度<
如果暴露在较高的湿度下，捕获试剂重新水化。
4.样品垫制备
4.1缓冲液组分
样品垫上可以承载多种化学试剂，以使大范围的样品性质可以和检测条的性能兼容。
要在样品垫上添加足够的化学物质，以使所有的样品在检测中的表现一致。
例如，人的尿液pH值的范围是5-10。
要在样品垫上加缓冲盐，那样处于这个范围内的样品在它们转移到结合垫上时都具有一样的pH值。
要根据样品垫材料的床体积、在检测条上被分析的样品体积，以及样品的变化范围来决定添加的浓度：
经典的组成由缓冲液+（BSA、PEG20000、蔗糖、海藻糖）+（吐温-20、tritonX-100、SDS）+NaN3+其他物质（消除干扰因素）
当在样品垫中加入了蛋白质、去垢剂、增稠剂、缓冲盐后，它还可以有以下功能：
a.增加样品的粘稠度（调整液流性质）。
b.增加样品对结合垫试剂的溶解能力。
c.防止连接物和被分析物和下游的其他物质发生非特异性结合。
d.改变样品的化学性质，使其可以在检测线形成免疫复合物。
加入了蛋白质（如白蛋白）及去垢剂和表面活性剂（如很低浓度的SDS或Tweeen-20）可能提高连接物重新溶解能力，降低连接物的非特异性结合，使膜对被分析物的吸收最小化，因此特别注意上述物质使用的必要性。
4.2样本垫包被及干燥条件：
样本垫的生产方式、要求及贮存条件与结合垫相似，可以参考上述要求。
5.试剂条（卡）的装配
5.1为什么要层叠：
为了使检测条有功能，垫子和膜需要一个叠一个，为样品提供一个连续的流动路径。
更重要的是，层叠的范围要保持一致，使所有生产出来的检测条的液流动力学一致。
这个主卡片接着被切成有特定宽度的独立的条，直接包装或者放置在塑料外壳内。
为什么层叠结构组合的一致性如此重要？
从根本上说，这个问题和液流的动力学有关。
层叠的程度决定了样品如何从一种材料流向下一种材料。
理想状态下样品是一层一层地流经整个装置的。
5.2层叠定位设计
组装过程还有一点很重要的，是与PVC底板接触的程度。
NC膜和吸收垫在这方面一般不存在问题，因为接触的区域很大。
然而对于样品垫、结合垫与PVC底板的接触区域就相对较小。
如果和PVC底板接触不充分，切割过程中的剪切力就可能使这些材料从粘贴片上剥离。
PVC底板上的保护膜上通常都被切开，在往卡上粘贴某种材料时，就要撕去保护膜中的某一片。
这样做以后，保护膜的边缘就可以作为粘贴膜和垫子的指示线。
需要对保护膜上切割线的定位进行详细说明，确定其公差。
同样，垫子和膜宽度的变化也要尽量地小。
在实际操作过程中也发现，完全基于保护膜切割线来层叠操作也不容易实现，而且操作过程中，撕开细小的保护膜也是一个障碍。
可以设计一个工艺夹具，用于控制层叠操作会更加精确，避免人员操作差异带来的批内差。
5.3层叠操作
层叠过程的关键点是，以正确的排列往粘贴卡上粘贴各种材料，同时对其多孔结构不造成挤压。
膜物理上对过度挤压比较敏感，因为多孔结构变化是不可逆的。
在极端的情况下，液流会被完全阻断。
垫子的材料就没有这么敏感，但是它们在被过度挤压时有可能被破坏，而引起其中液流性质的改变。
在批量过程中，层叠过程可以用专用设备来进行，也可以完全由手工进行。
这里，每个操作者在粘贴卡上粘贴材料并对材料施加一定压力的一致性就可能成为限制因素。
粘贴位置发生1毫米或者更小的偏差，以及施加的压力大小的变化，都可能察觉不到，但是却能对液流性质产生无法接受的影响。
对样品垫、结合合垫或者膜的过度压迫的表现是液流速率下降或者断流。
不规则的样品前沿和胶体金颗粒在膜上产生条纹表示样品从结合点转移到膜上的过程不均匀。
这可能是由于层叠得太少或者结合垫和膜的接触不均匀。
如果吸收垫在层叠过程中或者在置入外壳时被过度压迫，液流可能会在样品前沿经过观察口时显得正常。
如果当样品到达吸收垫时液流变慢或者停止，这对于使用者来说有可能是不容易察觉的。
5.4大板切割
主卡片一旦被组装好，就需要在它们被植入外壳和包装前将其切割成独立的条。
对于切割过程有两个实践上的考虑。
第一个是有关用于检测条的材料的脆弱性。
刀片要可以在不伤害比较脆弱的膜和垫子的情况下切过粘贴卡。
如果切割机的设计对于膜和垫子来说是不适合的，它们有可能从粘贴材料上剥离或者在切割边缘处被损坏。
这些问题会影响样品沿着试剂条的液流的均匀性。
第二个考虑是关于设备维护的。
设备生产商通常会提供有关清洁和一般维护间隔的信息。
由于刀片上会积聚粘贴材料，所以设备可能需要比所规定的更频繁的清洁。
如果在切割时粘贴材料积聚得太多，它们就会粘住试剂条上的材料，导至材料的剥离。
同样，膜上小片的硝化纤维以及垫子上的纤维也有可能发生积聚。
5.5卡壳的压合
主卡被切割成独立的条后，如果是试剂卡，还需要将试剂条装入专用的卡壳中，主要有两种方式：
压辊式和垂直压合式。
此过程关键的是，针对压合的力度的调教和持续稳定保持。
卡壳的设计中有些部位是为了样品的层析更为有利，如果压合的力度过大或过小均不能达到目的，因此在生产前针对不同卡壳的力度调教必须进行验证，在验证确认参数后，压壳机是否能够持续保持一致是设备供应商的难点，这也是生产质量管理人员特别需要注意的质控点。
5.6关于自动化生产的思考
A.NC膜粘贴与划膜、样本垫、金标垫、吸水垫的包被、干燥、分切与层叠：
未来是否可能的整合成全自动流水线生产，将大大减少人工操作的误差，以及提高生产效率，降低产品批内和批间差异。
B.大板切割成试纸条、试纸条的装卡、装袋的全自动流水线：
这些过程的人员需求最大（可能产生的人为错误概率也最高），质量控制点繁多且全靠人员识别，这些过程非常有必要实现自动化生产，加入自动识别不良品的控制，将极大提高生产的效率和产品质量批内的均一性。
C.以上过程的自动化生产与质量控制的实现，有赖于试剂生产企业和设备供应商、物料供应商共同协作，目前业内已有企业在此做了
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