超薄切片技术.docx

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超薄切片技术

超薄切片技术

第一节引言

超薄切片制备技术是医学研究、超微病理诊断中最基本、最常用的技术。

它可作为进一步学习电镜细胞化学、免疫电镜及超微结构图像立体学定量技术的基础。

透射电镜的加速电压为20－100KV（千伏），其电子束穿透能力弱，对绝大多数样品而言，不能在TEM下直接观察，必须制备成厚度为50－70nm的超薄切片。

要获得高质量的电镜照片，关键在于制作合格的超薄切片。

对于超薄切片制备的主要要求有：

①组织、细胞的精细结构保存良好，没有明显的物质凝集、抽取、添加等人工假象。

②超薄切片应具有一定的硬度和韧性，能够耐受电子束的轰击，在观察过程中，切片不发生变形；切片包埋介质不会升华。

③超薄切片应均匀，没有皱褶、刀痕、震颤及染色剂沉淀等缺陷。

切片还应具有良好的反差。

因此只有经过一系列的固定、脱水、包埋、切片、染色等步骤，使组织标本既保存了细微结构，又具有适当的硬度和韧性以及良好的反差，才能达到上述要求。

超薄切片在电镜中被观察时，由于电镜的分辨本领很高，细胞内部的微细结构变化会在图像上反映出来，所以在整个样品制备过程中，操作者必须十分认真地对待每一个操作步骤。

在样品制备过程中稍有疏忽都可能影响制片质量，或切不成超薄切片，或在图像中加入人工假象，以至于直接影响研究结果的准确性和重复性。

所以整个操作过程必须细致、谨慎，严格按照操作步骤进行。

所用的器皿和器械必须非常清洁，玻璃器皿都要经过清洁液泡洗，所用的药品及试剂都是分析纯级，配试剂用的蒸馏水必须是用玻璃蒸馏器蒸出的双蒸水。

超薄切片样品制备的过程比较复杂，具体的说来，大致可分为取材、固定、漂洗、脱水、浸透、包埋、修整定位、切片及染色等几个步骤。

常规超薄切片样品制作的具体步骤和时间如下：

⑴样品取材后在醛类固定液（3％戊二醛）预固定几个小时或更长的时间；

⑵缓冲液漂洗（0.1mol/L磷酸缓冲液）几小时或过夜，中间更换5次缓冲液；

⑶1％四氧化锇固定液后固定2h左右；

⑷0.1mol/L磷酸缓冲液漂洗3次，每次10min;

⑸梯度乙醇或丙酮脱水，其顺序为、50％、70％、80%、90％、100%乙醇各一次，每次10分钟100％丙酮2次，每次10－15min。

脱水时间可根据组织的种类和大小适量增减；

⑹1:

1丙酮包埋剂浸透1－2h;；纯包埋剂浸透过夜 

⑺包埋：

可根据实际情况选用4号胶囊、平板或其它包埋模具。

⑻聚合：

37℃12h,45℃12小时，60℃24小时。

⑼切片：

用超薄切片机将组织块切成50—70nm厚的超薄切片。

（10染色：

用醋酸铀将超薄切片染色30mi,柠檬酸铅染色5－8min即可。

第二节制样前的准备工作

　　电镜样品的制备工作是高度繁琐、高度复杂的工作。

在样品制备前必须作好充分的准备工作。

制样前的准备工作主要包括三个方面：

一是实验设计的准备；二是实验器具和实验试剂的准备；三是实验动物的准备。

下面一一加以简要的介绍：

一、实验设计的准备

实验设计应当充分考虑电镜技术的复杂性和高消耗性等特点，在没有周全的实验设计之前不要轻易地动手进行实践。

在实验设计中实验者必须首先明确实验目的，围绕着实验目的制定出实验流程。

根据实验流程，实验者可以选择合适的实验动物和试剂，备齐实验器具。

在正式实验之前，最好要进行预实验，以检验实验设计的科学与否。

这样，在进行具体的实验时，才能做到心中有数，有的放矢。

具体的讲，在实验设计时，需要考虑下列因素：

①实验是进行一般的超微结构观察还是进行细胞化学或免疫电镜观察，实验涉及的是哪些组织和器官，对取材的组织和器官的部位都要考虑周密。

应当特别指出的是，由于电镜工作的局限性很大，取材的部位必须尽量准确，例如肾脏的皮质和髓质显然有着不同的超微结构，肝脏的肝小叶内部位和门管区部位有极大的差别，脑组织的灰质和白质也大不相同；此外还要注意取材方向，如肌肉，是横切还是纵切等等，诸如此类的问题，都不可忽略。

②根据实验的目的，采用合适的缓冲液、固定液和固定方法。

例如在细胞化学工作中，一般要求选用二甲砷酸盐缓冲液，一些特定的离子细胞化学技术需要特定的缓冲液。

③包埋介质有时也是需要考虑的，例如在某些免疫电镜工作时，需要低温包埋剂，这样抗原性可以保存得很好。

二、实验器具和实验试剂的准备

实验器具和实验试剂的准备要考虑到实验各个环节所需要的玻璃器皿、实验器材以及实验试剂等。

对于一些常规的操作环节，例如取材室、包埋室、切片室、染色室都应准备相关的玻璃器皿、实验器材和实验试剂。

玻璃器皿、实验器材和实验试剂应随着消耗随时补充，以便在进行常规工作时，可以随时取用，而不必进行1次实验，准备1次。

在做特殊的实验工作时只要准备与该次实验有关的器具和实验试剂就可以了。

下面以取材为例，应常备下列器具：

①常用型号剪刀各1把；②常用型号的止血钳；③常用型号的直镊子和弯镊子；④双面刀片若干；⑤清洁的青霉素小瓶若干；⑥盛满冰块的平板器皿或铝制盒1个；⑦各种常用缓冲液和固定剂；⑧滤纸、牙签、卡片或蜡片若干；⑨胶布、不干胶若干。

三、实验动物的准备

实验动物的选择非常重要，在实验前应当根据实验目的选择合适的实验动物，特别重要的是选择合适品级的动物，否则实验动物结果有可能得不到承认。

实验动物购买应在有资格认定的部门进行，不可随意购买。

实验动物购买后，应饲养在与其品级相应条件的环境下，尽量维持其正常生理状态，避免临时从远处取来，因条件的变化而造成实验的失真。

在实验时，还必须设立对照组。

不仅要有正常对照，有时还应设立和实验组相同条件的对照。

实验和对照的动物必须在相同条件下取材：

在时间上尽量同步，采用相同的固定剂，取材部位完全相同，以增加实验的可靠性。

此外，各组实验动物还应具有一定的数量，得出的结论才较为可靠及有利于统计学分析。

在电镜观察时，由于电镜实验的昂贵和复杂，各组动物可稍少，但一般情况下不可少于3只。

第三节取材

从动植物机体上或从细胞及微生物的培养物中取得所需材料的操作过程叫取材。

取材是制备标本的第一步，首先要确定取材部位，如取脏器的中央或边缘部位、器官的皮质和髓质等等，根据需要采用不同方式。

一、取材的基本要求

①快

为了能观察到尽量接近生理生活状态时的生物或细胞的结构，取材越快越好。

对于实验动物，最好在没有停止血流时就取材，因为细胞一旦失去血流供应，就处于缺氧状态，代谢发生改变，细胞内的一些酶将释放出来使细胞自溶，破坏微细结构形态。

所以，要求组织离体1分钟内迅速进入固定液进行固定，使细胞内的微细结构尽量保存在生活状态下的位置和形态。

②冷

尽量保持低温下操作（0——4C），以降低酶的活性，减少对微细结构的影响。

③小

取材时，组织块体积要小，应在0。

5——1mm3，因为固定液渗透能力弱，组织块太大，块的内部将不能得到良好的固定。

取材时动作要轻巧，刀片要锋利，绝不能挤压牵拉组织，避免人为的造成组织损伤。

④净

尽量少带血液或组织液进入固定剂，可用缓冲液把表面血液或组织液冲掉，千万不要用水冲洗组织。

⑤准

取材部位要准确。

根据研究目的和观察对象的要求，确定取材的位置。

如：

肾上腺的髓质与皮质，脑下垂体的前叶与后叶有截然不同的结构。

由于电子显微镜的放大倍率很高，观察到的视野很小。

为了避免由于取材不准确而造成的“一孔之见”，要求取材者要有一定的形态学实验基础。

二、取材的具体方法

先准备好取材用具，包括剪刀、镊子、干净的蜡片或卡片纸、新的双面刀片、有编号的盛有固定液的小瓶、滴管、牙签及冰盒等。

所有用具必须十分清洁。

。

1、实验动物的取材：

先将动物麻醉或处死，处死时用急死的方法如断头、断脊髓等。

麻醉取材：

先将动物麻醉，立即暴露取材部位，在不中断血流的情况下，用锋利的剪刀取下一小块组织，立即投入预冷的固定液中，待10－30分钟后再细切成1mm3小块。

也可以立即放在滴有冷固定液的石蜡板或塑料板上，用单面刀片迅速切去剪过的切面，把组织切成1mm3的小块，立即用牙签将之轻轻挑入装有固定液的小瓶中。

操作应在1分钟之内完成，把离体后组织自溶减少到最低限度。

对于比较复杂的器官及对缺氧比较敏感的脑组织的取材应先进行原位固定或灌流固定，待组织适度硬化后再行取出。

2、临床活检取材：

外科活检取材可先取厚度为1－4mm的薄片，然后在冷固定液中细切为1mm3的小块。

取材过程中，要求手术者予以良好的配合。

3、体外培养细胞的取材：

生长在培养瓶中的体外培养细胞取材时，先倒去培养液，接着倒入适量的戊二醛固定液，在冰浴上放置3－5分钟，然后用刮刀轻轻刮下瓶壁上的细胞，将含有细胞的固定液转移到离心管中，用普通离心机低速离心（2000转／分）15分钟，使细胞聚集成团块，弃去上清液，换上新鲜的固定液继续固定。

4、植物组织的取材：

植物组织的取材比较容易，它的细胞离体后变化不像动物细胞那样迅速，但植物细胞的细胞壁阻碍着固定液的迅速渗透。

因此，植物材料的取材宜先切成薄片状，经适当固定后再切成0.5—1mm3的小块　

第四节固定

一、固定的定义和目的

固定是指用物理或化学的方法、手段，迅速地杀死细胞，使组织细胞的形态结构尽可能地保存在接近其生活时的状态。

固定的目的：

①防止组织细胞的离体后变化，防止自溶，以保持组织细胞的成分和结构与其生活状态尽量一致。

②在固定以后的漂洗、脱水和包埋等样品处理过程中，保护样品使其物质不能溶解和流失。

③为样品以后的处理（包括染色和经受电子束轰击）作准备，并使组织适当的硬化。

二、固定方法

电镜技术常用两大类固定方式即物理固定和化学固定，其中化学固定是最常用的固定方法。

对于不同的样品取材，以及不同的实验目的应采用不同的固定方法。

㈠物理固定方法

物理固定是指用冷、热、或微波等物理方法对生物组织进行固定。

在超微结构研究中，冷冻固定和微波固定是较为常用的物理固定方法。

㈡化学固定方法

化学固定是指采用一定的化学试剂对组织或细胞进行固定。

在化学固定过程中，组织微细结构保存的质量不仅受到固定液特性的影响，而且还受到固定组织所使用方法的影响。

各种不同的化学固定方法具有不同的特点和固定效果，下面一一加以介绍。

⒈浸泡固定组织块切小后，立即投入固定液中。

一般使用清洁的青霉素小瓶，每瓶放10－20块组织，固定液2－4ml。

置于4℃固定2－4h或更长时间。

使用该方法固定组织，要求动作要快，组织块要小，固定液要保持低温，在0—4℃.

⒉原位固定原位固定是指在保持实验动物器官血流不断的情况下，在原位进行固定渗透，避免因为缺氧和死后的组织自溶引起微细结构的变化，从而达到理想的固定效果。

实行原位固定的方法之一是将实验动物麻醉后暴露出所需的器官表面，小心地剥开包膜，把冷的固定液直接滴在组织表面上，保持固定液适当浓度不使其挥发掉；另一种方法是在实验动物麻醉后，将固定液直接注射到所需固定的组织中或者空腔器官的内部。

经过这样初步固定后，取下经过固定的器官、组织，再切成小于1mm3的小块，继续于4℃进行浸泡固定1－3h。

该方法适用于较软的组织（如脑、眼球等）。

3．血管灌注固定。

这是最好的固定方式。

它是利用血液循环的途径将固定液灌注到所需固定的组织中，其特点是固定迅速、均匀。

血管灌注固定可以采用全身灌注和局部灌注的方式。

对于小动物，可以采用全身灌注的方式；对于大动物，可以采用局部灌注方式。

具体的血管灌注方法如下：

在进行灌注前，用3.5%水合氯醛或者戊巴比妥腹腔注射麻醉动物。

实验动物麻醉后，对于全身灌注的动物，打开胸腔，暴露心脏；对于进行局部灌注的动物，暴露所要灌注的器官的动脉。

将灌注针头插入左心室或相应器官的动脉血管，注意灌注针头在灌注过程中不可脱落。

在固定液注入前，先要用生理盐水或缓冲液灌注洗去血液。

灌注针头插入心脏或血管灌入生理盐水后，应立即用眼科剪刀剪开右心房或回流静脉，使得循环畅通。

当右心房或回流静脉流出的液体清亮，不含血液时，再灌入一定数量的固定液，使组织得到均匀快速的固定。

一般灌流固定10－15min后，再取下组织切成小块（0.5—1mm3）置4℃3%的戊二醛固定液中继续固定2小时左右。

灌注固定需注意以下几个问题：

①灌注固定要选择好合理的灌注路线，如果灌注的器官为肝、胃肠道、肾、骨髓和睾丸等，穿刺的部位开在腹主动脉，再根据动脉分支位置阻断流向其他脏器的动脉分支，然后剪开肾静脉或髂静脉等作灌注液回流。

先以生理盐水冲净脏器中的血液，随后根据实验需要用不同浓度固定剂作灌注固定。

②注意灌注压力，如果灌注压力过大，一方面细胞会发生肿胀，另一方面反而会使灌注液难以进入小血管，影响灌注效果。

下面将不同脏器灌注时的压力及其流量数值列入下表，供参考。

局部脏器灌注时的灌注压力和流量

脏器灌注压力（kPa）灌注流量（ml/min）

肝、胃肠道16.0-18.79-10

肾16.0-18.79-10

骨髓24.0-26.711-12

睾丸26.6-29.312-13

③灌注液的温度一般接近室温，25－30℃，否则会引起血管收缩，影响灌注效果。

④采用近交系动物，因杂种动物血管分布不一，不易找到准确位置。

⑤做血管穿刺时应尽量一次进入，多次穿刺可使血管收缩；对手术无关的部位不去触摸，以减少损伤。

灌注动作要快，动作慢，会使血液发生凝固，甚至动物出现死亡，从而影响固定效果。

⑥灌注时间及防凝。

一般生理盐水冲洗1－2min，然后用固定剂灌注10min左右。

为了不让血液凝固，可在穿刺前从肠系膜动脉注射肝素0.4ml，可防止血液凝固。

上述三种固定方式中，以血管灌注固定效果好，但操作复杂，要求高。

浸泡固定最简便，也最常用。

通常先用醛类固定液作预固定，经过漂洗后，再用1%四氧化锇固定液作后固定，以提高固定效果。

三、电镜制样中常用的缓冲液及其配制

化学固定剂通常需用一定的缓冲液配制，缓冲介质在固定时所起的作用为：

①使固定液维持稳定的pH;②使固定液有适当的渗透压，不使细胞收缩或肿胀；③提供适当的离子成分，使细胞成分不被抽取或沉淀。

用于电镜制样的缓冲介质有多种，如磷酸盐缓冲液、二甲砷酸盐缓冲液等，这些缓冲液各有其优缺点，可根据不同研究目的选用。

由于大多数动物组织的pH平均值为7.4，因此缓冲液的pH值选择在7.4左右。

㈠磷酸盐缓冲液

用于电镜技术的磷酸盐缓冲液是仿效细胞外液的成分而配成的，它的优点是便宜，无毒性作用；缺点是久放易产生沉淀并易遭到细菌的污染。

磷酸盐缓冲液的pH会随温度的变化而稍有变化，在pH7.5以下，它的缓冲能力很强，控制固定液的pH值比较有效。

磷酸盐缓冲液常用于配制戊二醛固定液和多聚甲醛固定液，并适于灌流固定。

配方有多种，只要渗透压相同，固定效果基本相同。

一般先配成贮存液，临用时将贮存液按比例混合而成。

配方1：

0.2mol/L磷酸缓冲液（Sorensen配方）

A液（0.2mol/L磷酸二氢钠水溶液）：

NaH2PO4.H2O27.6g

　　　　　　　　　　　　　　　　或NaH2PO4.2H2O31.21g

　　　　　　　　　　　　　　　　加双蒸水到1000ml

B液（0.2mol/L磷酸氢二钠水溶液）:

Na2HPO4.2H2O35.61g

　　　　　　　　　　　　　　　　或Na2HPO4.12H2O71.64g

　　　　　　　　　　　　　　　　加双蒸水溶解成1000ml 

按表所列数据取A液和B液混合后，即得所需的0.2mol/L磷酸缓冲液。

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　0.2mol/L磷酸缓冲液

pHA液（ml）B液（ml）

6.18515

6.56832

6.85149

6.94555

7.03961

7.13367

7.22872

7.32377

7.41981

7.51684

混合后测pH，常用缓冲液的PH在7.2—7.4范围，稀释2倍则成0.1mol/L磷酸缓冲液，渗透压为226mmol／L。

加入0.18mol/L蔗糖，则为425mmol/L。

配方2：

Millonig磷酸缓冲液

A液:

2.26%NaH2PO4.H2O

B液:

2.52%NaOH

C液:

5.04%葡萄糖

D液:

A液41.5ml+B液8.5ml

临时取C液5ml加D液45ml，混和后用B液调节pH到7.3.该液比较稳定，在4℃下可保存数周。

配方3：

Maunsbach磷酸缓冲液

用以下试剂配成0.135mol/L的磷酸缓冲液：

NaH2PO4.H2O2.98g

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Na2HPO4.7H2O30.40g

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　加双蒸水到1000ml

此缓冲液pH为7.35，渗透压为298mmol/L,适用于固定大鼠的肾脏。

配方4：

Karlsson和Schultz磷酸缓冲液

用以下试剂配制缓冲液：

NaH2PO4.H2O3.31g

　　　　　　　　　　　Na2HPO4.7H2O33.77g

　　　　　　　　　　　加双蒸水至1000ml

此缓冲液pH为7.4，渗透压为320mmol/L,与大鼠的脑脊液相等。

适用于对中枢神经系统的灌注固定。

㈡二甲砷酸盐缓冲液

此液配制比较简单，比较稳定，能保存，不易被细菌污染；但有一定的毒性，配制时要小心，应在防护罩内进行配制。

尽量不使试剂与皮肤直接接触，避免呼吸道吸入。

另外，由于二甲砷酸盐不像磷酸盐那样会和铅试剂起反应产生沉淀，因此在细胞化学中使用普遍。

常用浓度为0.1mol/L。

配方如下：

A液（0.4mol/L二甲砷酸钠贮存液）：

Na（CH3）2.ASO2.3H2O8.65g

　　　　　　　　　　　　　　　　　加双蒸水至100ml

B液（0.2mol/L盐酸溶液）：

HCL（36%-38%）1ml:

加双蒸水到60ml

取25mlA液、3-4mlB液混合，测pH，可用B液调整pH值到7.3左右，再加双蒸水到50ml，配成的二甲砷酸钠浓度为0.2mol/L。

在配制固定液时也应稀释到0.1mol/L。

最后配成的固定液中加1-3mmol/L的钙离子，可使结构保存更好。

㈢醋酸巴比妥缓冲液

醋酸巴比妥缓冲液在电镜的早期用来配制四氧化锇，固定效果比磷酸缓冲液的效果好。

此液缓冲能力较差，和醛产生作用后减弱缓冲能力，因此不能用来配制醛类固定剂，适于作四氧化锇及醋酸铀的稀释剂。

该缓冲液易于被细菌污染，不能长期保存。

临用时取储存液按比例配制。

四．电镜制样中常用的固定剂及其配制

（一）四氧化锇和四氧化锇固定液

1．四氧化锇也被称为锇酸。

实际上，它即非电解质，也不生成盐，是强氧化剂。

市售商品为安瓶装的微黄色结晶,挥发性强,有强烈的刺激性气味，该试剂较贵重，通常密封在玻璃安瓶里，0.5克或1克包装,使用时要节约。

四氧化锇的毒性很强，它的蒸气对眼角膜及鼻，喉粘膜具有毒性作用，使用时要注意防护，最好在通风橱内操作。

四氧化锇有以下主要优点：

1.它能与不饱和脂肪酸结合形成脂肪-锇复合物固定脂类,与蛋白质发生交联稳定蛋白质,因此能较好地保存组织细胞的微细结构;

（2）虽然四氧化锇不和单独的核酸及糖类起反应,但当核酸,糖类与蛋白质结合在一起时也能被固定,因此它几乎能和所有的细胞成分结合;（3）四氧化锇电子密度高,能使被固定的组织产生良好的反差,本身能起到染色的作用;（4）四氧化锇对缓冲液的要求不高

然而,四氧化锇也存在不少缺点

（1）它不能保护糖原,不能固定核酸,对微管固定较差;

（2）四氧化锇渗透组织很慢,渗透速度最快是在第一小时内,约0.6mm，以后更慢，所以组织块要切得很小。

当组织块大于1mm以上时，不能得到完全固定；（3）四氧化锇不能保存酶的活性，因此不能用作细胞化学的固定剂；（4）四氧化锇具有挥发性和对粘膜的毒性作用。

2．四氧化锇固定液的具体配法四氧化锇固定液一般是配成2%的水溶液保存，临用时加等量的缓冲液稀释，使最终固定液的浓度为1%。

锇酸不易溶解，配后要1-2d才能使用，且应避光，贮存在冰箱内。

水溶液应呈无色或淡黄色透明，若变成棕色，则不能使用。

（1）2%四氧化锇贮存液的配制：

先将4只装有四氧化锇的安瓶（共2g）用肥皂水洗净,再用清洁液浸泡过夜,自来水冲洗干净后,用玻璃划割器在上面刻痕,再用蒸馏水冲洗几次,放入洁净棕色广口玻璃瓶内,加入100ml双蒸水，用洁净玻璃棒捣破安瓶，或用力摇破。

然后用蜡严密封口，贴上标签备用。

洗净后的安瓶严禁与手或纱布、滤纸等接触。

将配好的2％四氧化锇置于干燥器中，于4℃保存。

（2）磷酸缓冲的1%四氧化锇固定液的配制：

等量的0.2mol/L磷酸缓冲液（PH7.3）与2％四氧化锇贮存液混合，临用时现配。

（3）二甲砷酸盐缓冲的1%四氧化锇固定液的配制：

等量的0.2mol/L二甲砷酸盐缓冲液（PH7.3）与2％四氧化锇贮存液混合，临用时现配。

（二）戊二醛和戊二醛固定液

1．戊二醛：

戊二醛的分子式为O=CH-CH2-CH2CH2CH=O,它是一种五碳醛，含有两个醛基。

30％以上浓度的戊二醛易聚合，一般商品浓度在25％以下，含有较多杂质。

新处理过的戊二醛为无色或很淡的黄色，贮存久时颜色会变深。

由于戊二醛中醛基易氧化为有机酸，使PH下降。

当PH下降至3.5以下时，就失去固定能力，需要纯化。

纯化的方法有蒸馏及用活性炭处理等方法。

活性炭提纯的方法是在市售的戊二醛溶液中按每10ml／lg的比例加入活性炭，在4℃下摇动1h以上，然后过滤。

测PH,在PH4以上即可使用。

如PH在4以下，可用活性炭重复吸附2次。

此外，还可用碳酸钡吸附法提纯，做法是100ml戊二醛中加2g碳酸钡，摇动5～10min,然后过滤备用。

醛类固定剂固定后，一般需用四氧化锇进行二次固定，这就是迄今为止被广泛使用的双固定方法。

戊二醛固定剂具有下列优点：

①它与蛋白质交联的能力是固定剂中最好的，也能固定糖元和核酸，对细胞内结构如微管等保存也较好，并能保存细胞内一些酶的活性，因此是保存精细结构最有效的醛；②戊二醛的渗透速度比四氧化锇要快些，且反应快；③戊二醛能够弥补四氧化锇固定剂的不足，对糖元、核酸，尤其是对微管、内质网和细胞基质有较好的固定作用，可以避免四氧化锇作原始固定剂可能产生的抽提作用；④戊二醛较适于进行超微细胞化学研究工作。

戊二醛固定的主要缺点是：

①它不能固定脂质，致使其在以后的脱水过程中被有机溶剂溶去，因而不适于作为单独的电镜固定剂；②戊二醛不像四氧化锇那样能提供高反差，因此与四氧化锇复合使用，则可发挥两种固定剂的长处，互相弥补不足之处；③戊二醛固定不影响细胞的渗透性，因此它对缓冲液及其渗透压要求较高。

2．戊二醛固定液的配制戊二醛固定液一般用磷酸缓冲液或二甲砷酸盐缓冲液配制，而不能用醋酸－巴比妥缓冲液配制，因为后者会与醛基起反应而使醛基失效。

（1）磷酸缓冲的戊二醛固定液的配制：

可按下表配制所需浓度的戊二醛固定液。

0．1M磷酸缓冲的不同浓度戊二醛固定液配制表 

戊二醛最终浓度（％）1.01.52.02.53.04.05.0　

0.2mol/L磷酸缓冲液（ml）50505050505050　 

25％戊二醛水溶液（ml）46810121620

双蒸水加至（ml）100100100100100100100

（2）二甲砷酸盐缓冲的戊二醛固定液的配制：

可按下表配制所需浓度的戊二醛固定液。

　　　　　　　　　　　　　0.1mol./L二甲砷酸盐缓冲的不同浓度的戊二醛固定液配制表

戊二醛最终浓度（％）1.01.52.02.53.0　　　 

0.2mol/L二甲砷酸钠缓冲液（ml）5050505050　　　　　

25％戊二醛水溶液（ml）4681012　　　

双蒸水加至（ml）100100100100100　　 

（三）多聚甲醛和多聚甲醛固定液