内蒙古大学生物技术 基因工程实验论文1.docx

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内蒙古大学生物技术基因工程实验论文1

分类号:

Q78编号:

00911094

本科生基因工程实验论文

纳豆激酶基因表达载体的构建及在

大肠杆菌中的表达

指导教师：

苏慧敏

学生：

专业：

生物技术

年级：

2009级

2012年9月12日

目录

摘要……………………………………………………………………………1

1绪论…………………………………………………………………………2

2材料与方法...2

2.1材料...................................................2

2.1.1菌株与质粒………………………………………………2

2.1.2主要试剂及其配制…………………………………………2

2.1.2.1试剂…………………………………………………2

2.1.2.2试剂与培养基的配制………………………………2

2.1.1.3主要仪器……………………………………………5

2.2方法....................................................5

2.2.1纳豆激酶（NK）引物的设计5

2.2.2NK基因的PCR扩增及电泳检测5

2.2.3DH5a和BL21（DE3）感受态的制备9

2.2.4pMD19-T-NK的构建及转化和鉴定10

2.2.5pET-Trx及pMD19-T-NK的酶切与回收11

2.2.6pET-Trx-NK的构建及转化和检测11

2.2.7pET-Trx-NK的诱导表达及SDS-PAGE检测11

3结果与分析13

3.1NK基因的PCR扩增13

3.2.pMD19-T-NK的构建与鉴定13

3.3pET-Trx及pMD19-T-NK的酶切和回收14

3.4pET-Trx-NK的构建与检测14

3.5pET-Trx-NK的诱导表达与SDS-PAGE检测14

结论与讨论15

参考文献15

致谢与感想16

纳豆激酶基因表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达

摘要

纳豆激酶是一种良好的天然蛋白酶类溶栓物质。

纳豆激酶基因长度约为800bp.本实验通过构建纳豆激酶基因表达载体，使纳豆激酶基因在大肠杆菌中顺利表达.我们从经克隆在PMD-18-T载体上的纳豆激酶基因，用PCR技术扩增后获得其800bp的目的基因片段，将该基因片段同pMD19-T克隆载体连接后转入DH5a菌中，扩增带有目的基因的质粒，然后筛选出重组子。

对重组子运用限制性内切酶双酶切后得到纳豆激酶基因片段，将该基因片段插入表达载体PET-trx中，转入BL21表达宿主菌中，通过IPTG进行诱导，用SDS-PAGE检测诱导产物纳豆激酶。

关键词：

纳豆激酶，基因表达，载体，大肠杆菌

ConstructingExpressionVectorandExpressingNKinE.coli

Author：

Supervisor:

SuHuiming

ABSTRACT

Nattokinase（NK）isagoodnaturalproteasethrombolyticsubstance.ItisGenelengthaboutfor800bp.ThisexperimentthroughbuildingNattokinasegeneexpressionvector,makeitexpressinEscherichiacoli.WeacquiredNattokinasegenefromclonenedinPMD-18-TvectorbyPCR（Polymerasechainreaction）,andobtainedthe800bpoftargetDNAfragment.ThenweconnecteditwithPMD19-TvectorandtransferreditinDH5abacteria,screenedoutrecombinants.WegotnattokinasegenefragmentresultingfromtherecombinantswhichcutbyRestrictionendonucleaset,andinsertedthegenefragmentintoexpressionvectorPET-trx,.WetransferredthePET-trxvectorintoBL21（DE3）bacteria,ThroughtheIPTGinduced,NKgeneexpressed,usingSDS-PAGEdetectionresultofnattokinase.

KEYWORDS:

Nattokinase,geneexpression,vector，E.coli

1绪论

纳豆是一种简单易得的有营养的优质发酵食品，是将接种过纳豆杆菌的蒸煮大豆在适当温度、湿度下发酵得到的。

纳豆源于中国，而因其独特的风味、制作方便和有效的营养和保健功效而深受日本民众喜爱。

纳豆具有很丰富的营养价值，富含蛋白质、各种氨基酸、维生素、矿物质，经发酵后营养更容易消化吸收。

研究表明，纳豆的保健功能主要与其中的纳豆激酶、纳豆异黄酮、皂青素、维生素K2等多种功能因子有关。

此外纳豆激酶还具有降血压，降血脂，降胆固醇，抗氧化等多方面作用。

纳豆激酶在所有的纤溶酶类产品中研究最早，目前也是开发最多的溶栓剂产品，国内外对纳豆激酶已有二十多年的研究，其理化性质溶栓机制分离纯化等已被人们所了解，纳豆激酶类药品及保健食品的研究正在进行当中【1】。

1980年须见【2】教授在美国芝加哥大学进行血栓溶解酶pro-UK与UK的构造分析研究时，无意间发现纳豆食品中含有高浓度的血栓溶解成分，纳豆食品在发酵过程中会产生一种丝氨酸蛋白酶，将其命名为纳豆激酶（Nattokinase,NK），Nakamura【3】等首次报道了包括调控顺序在内的1473bp的NK全长基因序列，NK基因以GTG为起始密码子，随后是1143bp组成的阅读框架，N端的第1~29个氨基酸残基是信号肽，第30~106的77个氨基酸残基是前肽，随后的275个氨基酸残基为纳豆激酶成熟肽。

这使从基因工程角度入手提高纳豆激酶活性及产量成为可能。

更进一步的研究表明，纳豆激酶能有效的溶解血栓，与临床药物如尿激酶（UK）、链激酶（SK）等相比，具有在体内的半衰期长，易被人体吸收，无副作用，生产成本低，能激活血管内皮细胞的组织型纤溶酶原激活剂（t-PA）以进一步增强溶栓作用等优点，所以纳豆激酶可以被开发为同时具有预防和治疗功效的新型的溶栓药物【4】。

目前，国内外对纳豆激酶的研究主要集中在优化枯草杆菌发酵条件以提高产量，蛋白结构分析，生理生化特性，药理药效等方面【5】。

另外，日本学者还通过药物刺激、紫外线诱变、放射性照射、细胞融合和染色体插入变异等方法获得纳豆激酶高产菌株。

而近年来以基因工程方法构建纳豆激酶的高效表达载体，优化表达系统来提高纳豆激酶的表达水平一直是研究的热点，并且取得了很大的进展【6-7】。

国内主要进行了纳豆杆菌液体发酵条件、纳豆激酶的春花等方面的研究，目前利用原核（如大肠杆菌和枯草芽孢杆菌）或真核细胞（如毕赤酵母）进行基因表达纯化后获得的纳豆激酶，其活性普遍较低【8】。

因此，纳豆激酶的研发潜力和空间都是巨大的，纳豆激酶极有希望成为新一代理想的预防和治疗血栓的生化药物。

本实验的目的在于构建纳豆激酶基因重组表达载体，并对其表达进行初步研究，首先旨在利用实验室基本仪器进行基因工程以及分子生物学实验的熟练操作，其次也旨在利用基因工程技术提高纳豆激酶的产量，为生产实践和药物开发提供理论依据。

2材料与方法【9】

2.1材料

2.1.1菌株与质粒

本研究所采用的是本基因工程实验室保存的已经克隆在PMD-18-T载体上的纳豆激酶基因，菌株为E.coilDH5a、BL21，表达载体PET-trx、克隆载体PMD19-T来自美国基因动力实验室公司，为本基因工程保存提供.

2.1.2主要试剂及其配制

2.1.2.1试剂

DNAHindIII、Tiangen公司的MarkerIII、EcoRI和BamHI内切酶、TaqDNA聚合酶、T4DNA连接酶、DNA凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、dNTP混合液、X-gal、IPTG、低分子量蛋白分子量Marker：

97.4、66.2、43、31、20.1，14.4kDa等。

其他常用试剂均为进口或国产分析纯。

2.1.2.2试剂与培养基的配制

1、LB培养基（按1L的量计算）

胰化蛋白胨10g,酵母提取物5g,,NaCl10g,加200mlddwater搅拌完全溶解，用约200uL5NNaOH调PH至7.0，加ddwater至1L，121ºC20min分装灭菌。

在培养菌种时，向里面加入20%葡萄糖，终浓度为0.2%。

提取质粒时，向里加入氨苄青霉素，终浓度100ug/mL.

2、0.1mol/LCaCl2溶液

称取60mmol/L的CaCl23.330g,充分溶解；称取10mmol/LPIPES3.35g，充分溶解；量取15%的甘油75ml。

三者混匀后，加蒸馏水至500ml，121ºC20min分装灭菌后4ºC保存。

3、50×TAE缓冲液（pH约8.5）

Tris碱242g,57.1ml冰乙酸，37.2gNa2EDTA-2H2O,ddwater定容至1L，用时稀释

成1×.

4、1000×溴化乙锭储存液（0.5mg/mL）：

50mg溴化乙锭溶于100mlddwater,4ºC避光储存。

使用时在蒸馏水里滴入适量，使水看起来微微发红即可。

5、氨苄青霉素储存液

无菌超纯水配制100mg/mL,分装后-20ºC保存。

6、0.5mol/LEDTApH8.0

称取18.61gNa2EDTA-2H2O，加入约80mL的去离子水，充分搅拌。

用NaOH颗粒调节pH值至8.0（约2gNaOH）,使其完全溶解。

加去离子水将溶液定容至100mL。

高温高压灭菌。

7、1mol/LTrisHClpH7.5

称取12.1gTris碱,加80mL蒸馏水，缓慢地加浓盐酸至pH6.8（约加6.5mL）。

让溶液冷却至室温，调至pH7.5，加蒸馏水至100mL。

高温高压灭菌后4ºC保存.

8、1mol/LTrisHClpH8.0

称取12.1gTris碱,加80mL蒸馏水缓慢的加浓盐酸至pH8.0（约加4.2mL）。

让溶液冷却至室温，调至pH8.0，加蒸馏水至100mL。

高温高压灭菌后4ºC保存.

9、去盐分溶液的配制

（1）溶液I[葡萄糖/Tris/EDTA（GTE）溶液]:

50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTrisHClpH8.0，10mmol/LEDTA,调pH8.0.

（2）溶液II（NaOH/SDS溶液）：

0.2mol/LNaOH，1%SDS，现用现配.

（3）溶液III[KAc溶液（pH4.8）]：

60mL5mol/LKAc，加冰乙酸调至pH4.8，补ddwater至100mL.

10、TE-缓冲液的配制

10mmol/LTrisHClpH8.0.1mmol/LEDTApH8.0，高温高压灭菌.

11、加样、上样缓冲液的配制

（1）10×加样缓冲液：

20%Ficoll400，0.1mol/LNa2EDTApH8.0，1.0%SDS，0.25%溴酚蓝；

（2）6×加样缓冲液：

0.25%溴酚蓝，40%蔗糖水溶液。

（3）2×上样缓冲液：

0.5mol/LTrisHCl，pH6.82mL，甘油2mL，20%SDS2mL，

0.1%溴酚蓝0.5mL.

（4）5×电泳缓冲液：

Tris7.5g，甘氨酸36g，SDS2.5g，加ddwater至500mL，使用时稀释5倍

12、95%和70%乙醇（各配制100ml）

（1）95%的乙醇配制：

量取95ml无水乙醇，加水至100ml,混匀即可。

（2）70%的乙醇配制：

量取75ml无水乙醇，加水至100ml,混匀即可。

13、10%SDS

蒸馏水配制，室温保存。

14、30%Acr（丙烯酰胺）/Bis（N,N’-亚甲基双丙烯酰胺）：

30gAcr+0.8gBis，用ddwater定容至100mL，4ºC棕色瓶避光保存。

17、20（M/V）%IPTG

无菌水配制，过滤灭菌。

18、100mg/mL（M/V）IPTG

无菌水配制，过滤除菌

19、2%（M/V）X-gal：

用N,N-二甲基甲酰胺配制，过滤灭菌。

20、考马斯亮蓝R250染色液

考马斯亮蓝R2500.25g+45mL甲醇+10mL冰醋酸，用ddwater定容至100mL

21、脱色液的配制

95%乙醇/冰醋酸/水=4.5/0.5/5（体积比）

2.1.1.3主要仪器

Biometra公司的PCR仪、北京六一仪器厂的GYY-1型电泳仪及DYCP-31D型水平凝胶电泳槽、英国Grant的凝胶成像仪、德国Eppendorf的AG5415R型台式离心机，太仓科教器材厂的旋涡混合器，美国ThermoFisherScientific公司的微量移液取样器，金坛市富华公司的SHE-723G的恒温振荡器，双面微量离心管架，试管架，标签纸，制冰机。

英国Grant公司的PHC-19干式恒温器、LG公司的微波炉、太仓科教器材厂的涡旋振荡器、电子天平、高压蒸汽灭菌锅、冰箱、恒温水浴锅、紫外分光光度计、超净工作台等。

2.2实验方法

2.2.1纳豆激酶（NK）引物的设计

上游引物（5’端带BamHI酶切位点）

5'-GGATCCGCGCAATCTGTTCCTTATGGC-3'

下游引物（5’端带EcoRI酶切位点）

5'-GAATTCTTGTGCAGCTGCTTGTACGTTG-3'

待扩增的NK片段长度：

837bp（825bpNK+5’BamHI位点GGATCC，3’EcoRI位点GAATTC）。

2.2.2NK基因的PCR扩增及电泳检测

1.取1μL老师提供的质粒pMD19-T-NK，加入9μLddwater稀释作为PCR模板。

2.在0.2mLPCR微量离心管中按下列参考剂量配制50μL反应体系：

45μLPCRsupermix；1μL模板；1μL引物1；1μL引物2；1μLddwater；共计50μL。

3.根据PCR仪的操作手册设置PCR仪的循环程序：

（1）94ºC5min

（2）94ºC1min

（3）60ºC1min（根据引物的Tm值设定）

（4）72ºC1min50s（根据所扩增的DNA的长度设定）

（5）goto

（2）29times

（6）72ºC10min

4、PCR结束后，取5～10μL产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察胶上是否有预计分子量的主要产物带。

电泳步骤：

a）称取0.25g琼脂糖粉，放入三角瓶，加入25mL1×TAE电泳缓冲液（注意原液是50×，需要自己稀释！

），用保鲜膜盖住，放入微波炉中烧开（0.5min）。

25mL正好能倒满一块小胶。

注意观察烧瓶中的琼脂糖粉末，待完全熔化后停止微波炉。

b）戴上线手套，从微波炉中取出三角瓶，置桌面上冷却至不烫手。

c）把梳子（最细的齿）插到凝胶灌制模具的正确位置后缓缓倒入胶溶液。

胶溶液倒至与模具的矮边缘相差1～2mm即可，但尽量不要太厚，更不要把胶溶液溢到外面。

在桌面上静置10～20分钟待胶完全凝固。

d）在水平电泳槽中加满1×TAE电泳缓冲液。

根据电泳槽的长度把电泳仪的电压调至10V/cm（170V），注意正负电极的位置连接正确。

e）待胶完全凝固后（15～20分钟），小心拔出梳子。

用手指捏住模具两侧的高边缘取出模具和凝胶，放入电泳槽中间的平台上，凝胶要没入电泳液中，凝胶上有样品孔的一侧要朝向电泳槽的负极（黑色电极。

f）取1只PE手套点6μL蒸馏水、1μL10×加样缓冲液，再加入3μL质粒DNA溶液制成10μLDNA混合样品。

g）在凝胶上选择相邻的加样孔。

用10μL的吸液头分别将纸上的混合样品加入凝胶的加样孔中。

在电泳PCR产物或酶切产物时，在相邻的加样孔中加入3μLDNA分子量标准物。

h）打开电源开关，170V300mA电泳。

电泳将进行约30min。

当蓝色的溴酚蓝迁移到距凝胶边缘1cm时，关闭电源。

取出模具和凝胶。

i）把带有样品的凝胶小心放入盛有EB的搪瓷盒中。

以下需戴手套到专门的染色区操作。

放置约10分钟后，取出来在自来水中浸泡10min。

用自来水冲洗后放入凝胶成像系统中拍照。

j）染有EB的凝胶和手套（只要手套没破，可以节约使用：

将手套脱下来以后张开口放在染色区，下一次把手伸进去即可）要放到专用的垃圾袋中作专门处理，以免污染环境。

不可用接触过EB的手套接触电脑或凝胶成像仪的门。

2.2.3DH5a和BL21（DE3）感受态的制备

1.取一支无菌的摇菌试管,在超净工作台中加入2mLLB培养基（不含抗菌素！

）

2.从超低温冰柜中取出DH5a菌种和BL21（DE3）菌种，放置在冰上。

在超净工作台中用烧红的接种环插入冻结的菌中，然后接入含2mLLB培养基的试管中，37℃摇床培养过夜。

3.在超净工作台中取0.5mL上述菌液转接到含有50mLLB培养基的三角烧瓶中，37℃下250r/min摇床培养2～3h。

4.取少量菌液测定OD590为0.45（0.4

以下除离心外，都在超净工作台中进行。

5.将菌液分装到1.5mL预冷的无菌微量离心管中，于冰上放置10min，然后于4℃，5000r/min离心10min。

6.弃上清，并将离心管倒置以倒尽上清液。

加入1mL冰冷的0.1mol/LCaCl2溶

7.液，立即在涡旋混合器上混匀，插入冰中放置30min。

8.4℃，5000r/min离心10min。

弃上清液后，用1mL冰冷的0.1mol/LCaCl2溶液垂悬，插入冰中放置30min。

9.4℃，5000r/min离心10min。

弃上清液后，用200μL冰冷的0.1mol/LCaCl2溶液垂悬，超净工作台中按每管50μL分装到1.5mL的无菌微量离心管中。

10.分装好的感受态菌可以直接用作转化实验，或立即放入-80℃超低温冰柜中保藏（可存放数月）。

以后用的时候每次用完一管，不可反复冻融。

2.2.4pMD19-T-NK的构建及转化和鉴定

1.取一个高压灭活的0.5mL微量离心管，加入载体连接体系：

2μLPCR产物；2μLμpMD19-T载体；1μL10ⅹBuffer缓冲液；4μLddWater，1μLμT4DNA连接酶。

共计10μL.

2.将上述混合液轻轻震荡后再短暂离心，然后置于14℃水中保温3h。

3.从-80℃超低温冰柜中取出一管（50μL）感受态菌，立即用手指加温融化后插入冰上，冰浴5～10min。

4.加入5μL连接好的质粒混合液（DNA含量不超过100ng）轻轻震荡后放置冰上20min。

5.轻轻摇匀后，42℃水浴1～2min进行热休克，然后迅速放回冰中，静置3～5min。

6.在超净工作台中向上述管中加入300μLLB培养基（不含抗菌素）轻轻混匀，然后固定到摇床的弹簧架上37℃震荡45min。

7.在超净工作台中，向上述离心管中加入40μLX-gal和7μLIPTG，混匀用以进行蓝白斑筛选。

8.取上述混合液50～300μL滴到含合适抗菌素的固体LB平板培养皿中。

从酒精中取出玻璃涂布棒，在火上点燃，熄灭后稍等片刻，待其冷却后轻轻涂布均匀。

9.在涂好的培养皿上做上标记，先放置在37℃恒温培养箱中约10～30min直到表面的液体都渗透到培养基里后，再倒置过来放入37℃恒温培养过夜.

10.在转化的平板培养基上随机选取3个边缘清晰的白色菌落，并用记号笔在其所在的培养皿底部玻璃背面画圈做标记编号。

11.在超净工作台中取3支无菌摇菌管，各加入3mLLB（含100μg/mL氨苄青霉素），用记号笔写好编号。

12.在超净工作台中用取液枪枪头尖挑取转化的平板培养基上的一个白色菌落，然后将枪头打入盛有3mLLB（含100μg/mL氨苄青霉素）的摇菌管中。

13.37℃摇菌过夜后，用碱裂解法分别提取质粒。

14.将提取到的3管质粒样品与已知分子量的质粒同时电泳，根据分子量判断和选取有插入片段的质粒。

2.2.5pET-Trx及pMD19-T-NK的酶切与回收

1.先准备一个冰盒并放入一定量的冰块。

混合下列溶液于一个高压灭菌的0.5mL微量离心管中：

8μL质粒DNA（pET-Trx或pMD19-T-NK）；4μL10×酶切缓冲液（BamHI）；1μLEcoRI;1μLBamHI.共计40μL。

2.轻轻震动微量离心管，使管中的溶液混匀。

再在离心机中2000r/min离心10秒。

取出后插到水漂的孔中，在37℃水浴中酶切3.5h。

3.取少量（约10μL）酶切产物，与合适的已知分子量的DNA（先前的PCR产物或Marker等）对比电泳，确认酶切成功后，进行片段的回收。

4.电泳结束后用薄塑料片（如电话卡）切下含有小样DNA酶切产物的泳道，EB染色。

在紫外灯下找到目的DNA带，用刀片在目的DNA带的下上下边缘各切一个小口作为标记。

含有大量DNA酶切产物的凝胶既不用EB染色，也不用紫外灯照射。

5.将做好切口标记的凝胶条用保鲜膜包住，与未染色的凝胶原位对齐，根据小胶条上的切口标记估计未染色的大胶上DNA酶切产物的位置，用刀片切下大胶中DNA产物所在的凝胶。

6.按照上海生工UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒操作步骤回收pMD19-T-NK片段。

2.2.6pET-trx-NK的构建及转化和检测

1.取一个灭菌的0.5mL微量离心管，加入连接体系：

4μLNK回收片段；1μLPET-Trx载体、酶切回收片段；0.5μLDNA连接酶（TAKARA,350μL/mL）;1μL连接酶缓冲液。

共计10μL。

2.将上述混合液轻轻震荡后离心1min，然后置于14℃干式恒温仪中保温过夜。

3.运用质粒DNA转化技术将质粒混合物转入DH5a菌中，再进行检测，筛选出连接产物。

2.2.7pET-Trx-NK的诱导表达及SDS-PAGE检测

1.按下列组合用IPTG进行诱导表达：

BL21（DE3）空菌不加IPTG

pET-his转化的BL21（DE3）菌加IPTG至100μg/mL

pET-his-N