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全军优秀博士学位论文

作者姓名：

刘星光

论文题目：

钙/钙调素依赖性蛋白激酶II（CaMKII）和MHCII类分子对TLR触发的巨噬细胞与树突状细胞天然免疫应答反应的调控及其机制研究

作者简介：

刘星光，男，1980年3月出生，2006年9月师从于第二军医大学曹雪涛教授，于2009年6月获博士学位。

中文摘要

Toll样受体（Toll-likereceptors,TLRs）作为一类重要的模式识别受体（Patternrecognitionreceptors,PRRs）主要表达于巨噬细胞和树突状细胞（Dendriticcells,DCs）表面，选择性地识别病原体相关分子模式（Pathogen-associatedmolecularpatterns,PAMPs），构成机体免疫系统抵御病原体入侵的第一道屏障。

TLR是一类在各种生物体内高度保守的I型跨膜蛋白，目前已在哺乳动物中发现并克隆了12种。

一旦识别了病原体中特定的分子结构，TLR就会激活其下游一系列的信号通路，活化天然免疫细胞产生炎性细胞因子和I型干扰素。

TLR不仅启动天然免疫应答，控制炎症反应的性质、强度和持续时间，还可以通过上调DC表面的MHCII类分子和共刺激分子，促进DC的成熟，指导抗原特异的免疫应答尤其是Th1型反应的产生，调节获得性免疫应答的强度和类型，成为连接初始免疫应答和获得性免疫应答的桥梁。

TLR信号过度活化或活化不足会导致机体功能异常和疾病的发生。

许多的其他信号通路参与对TLR信号的严密调控。

因此，对TLR信号转导调控的深入研究具有重要的理论意义和应用价值。

Ca2+作为细胞内第二信使之一，调节很多重要的生理过程。

钙/钙调素依赖性蛋白激酶II（Calcium/calmodulin-dependentproteinkinaseII，CaMKII）是钙信号下游的一种多功能丝/苏氨酸蛋白激酶，广泛分布于机体大部分重要器官组织中。

它由四个独立的基因、、及编码，且存在着不同的剪切体，因而产生多达24种不同的同型物。

CaMKII有着众多的作用底物，如转录因子CREB、ATF及其他信号分子p56lck、SHP-2、STAT1等。

CaMKII可调节机体的多种重要生理功能，如突触的信号传递、记忆、物质的代谢、肌肉的收缩、基因的表达及细胞周期的调控。

近年来研究表明CaMKII在免疫系统中发挥重要的调控功能，如T细胞的活化和记忆，DC的成熟和抗原提呈。

LPS（TLR4配体）被证明可以促发小鼠巨噬细胞胞浆中的钙流，其对LPS诱导的TNF-的产生有重要的作用，也有研究显示CaMKII可增强血小板激活因子（PAF）预刺激的THP-1细胞中LPS诱导的TNF-的产生。

这些研究提示Ca2+和CaMKII可能参与了TLR4信号。

然而，钙和CaMKII在TLR配体诱导的炎性细胞因子和I型干扰素产生中的作用，以及Ca2+/CaMKII信号通路与TLR信号通路的交互作用及其相关机制目前尚不清楚（问题1）。

MicroRNAs（miRNAs）是一类众多的内源性非编码小RNA，参与很多的生理病理过程。

miRNAs在免疫系统功能调节中发挥重要的作用，包括调控巨噬细胞的对外来病原体的初始免疫应答，淋巴细胞的发育、分化和功能等等。

然而，关于具有调控DC成熟和功能的作用的miRNA却很少报道。

既然CaMKII被证明在DC的成熟和功能中发挥重要的作用，且目前有关miRNA与CaMKII的研究尚未见报道，因此，我们想探索是否存在以及哪些miRNAs能通过直接作用于CaMKII，从而在DC的成熟、活化以及刺激T细胞的增殖方面发挥调节作用（问题2）。

以前的研究表明抗原刺激能诱导DC胞浆中钙流的上升，而钙和CaMKII均能调控DC的MHCII类分子的表达，表明Ca2+/CaMKII与MHCII类分子之间存在着相互调控。

然而MHCII分子被抗原之外的其他分子交联后能否诱导CaMKII的活化尚不清楚（问题3）。

MHCII类分子主要表达于DC、单核巨噬细胞及B淋巴细胞等专职抗原提呈细胞上，而这些细胞正是外来病原体成分等危险信号的主要感应细胞。

一些研究表明MHCII类分子可介导逆向信号，影响和调节免疫细胞的很多生理过程。

基于此，MHCII类分子是否能感应危险信号或者对危险信号激发的免疫反应起调控作用，目前尚不清楚（问题4）。

我们对上述四个方面的科学问题及其可能的内在联系进行了系统性的研究，分别从四个方面探讨了CaMKII、靶向CaMKII的miRNA和MHCII类分子这三类分子的相互作用和对TLR触发的巨噬细胞与树突状细胞天然免疫应答反应的调控及其机制。

一、钙/钙调素依赖性蛋白激酶II对TLR触发的巨噬细胞天然免疫应答反应的调控及其机制研究

在硕士论文的研究中，我们已经发现LPS、CpGODN和poly（I:

C）（分别为TLR4、TLR9和TLR3配体）能够显著地诱导CaMKII的活化，表现为CaMKII（T286）磷酸化的增加和激酶活性的上升，同时利用CaMKII的特异抑制剂KN62抑制CaMKII的活性能显著降低TLR4、9、3配体诱导的炎性细胞因子IL-6和TNF-以及IFN-的产生，其下游信号机制是通过抑制MAPK、NF-B和IRF3来介导。

在本部分研究中，我们继续深入的探索了Ca2+/CaMKII对TLR触发的巨噬细胞天然免疫应答反应的调控及其机制，发现LPS、CpGODN和poly（I:

C）刺激均能诱导巨噬细胞胞浆游离钙的快速显著升高。

利用特异靶向CaMKII-的siRNA降低内源CaMKII-的表达后，可显著抑制巨噬细胞中LPS，CpGODN或poly（I:

C）诱导的IL-6、TNF-、IFN-和IFN-的产生。

在巨噬细胞中瞬时转染组成性活化的CaMKII-α载体后，可加强MyD88和TRIF通路依赖的炎性细胞因子IL-6、TNF-和I型干扰素的产生。

同时，在信号通路方面，发现瞬时转染组成性活化的CaMKII-α载体后，能加强LPS诱导的MAPK、NF-κB的活化以及IRF3的磷酸化及核转位。

免疫沉淀和GST-pulldown试验表明CaMKII可以通过其调节区的N端部分直接结合TAK1和IRF3，体外激酶试验显示CaMKII可以直接磷酸化并活化TAK1和IRF3。

腹腔预注射KN62后可显著抑制内毒素休克小鼠血清中IL-6、TNF-和IFN-的产生以及降低其死亡率。

综上所述，TLR配体能诱导巨噬细胞胞内钙的释放以及CaMKII的活化，活化的CaMKII通过直接结合、磷酸化并活化TLR信号中重要的信号分子TAK1和IRF3，增强下游信号通路的活化，从而加强TLR配体诱导的炎性细胞因子IL-6、TNF-和I型干扰素的产生，表明Ca2+/CaMKII信号通路与TLR信号通路之间的交互作用是巨噬细胞充分活化所必需的。

本部分研究发现了CaMKII的新的免疫调控功能及其所作用的靶分子，另外也丰富了TLR信号转导调控的研究内容，有助于进一步深入认识机体在抵御外来病原体时的免疫应答反应及其精细调控机制。

二、靶向CaMKII的miR-148/152对树突状细胞成熟和功能的影响

DC的成熟与活化是初始免疫应答和获得性免疫应答的重要基础，多种调节因子参与维持DC的稳态。

以前的研究表明CaMKII也是DC成熟和功能发挥的一重要调节分子，抑制CaMKII的活化可下调DC表面MHCII类分子的表达、IL-12和IFN-γ的分泌以及CD4+T细胞的增殖。

我们前一部分的研究表明CaMKII可以加强TLR配体诱导的巨噬细胞炎性细胞因子IL-6、TNF-和I型干扰素的产生。

既然DC也表达CaMKII，那么DC中的TLR信号也应该受到CaMKII的正向调控。

以前的研究表明dicer基因突变的果蝇缺乏内源性miRNAs，然而其CaMKII的表达显著上调。

考虑到CaMKII是多个物种中高度保守的分子，那么这些研究表明CaMKII很可能受到miRNAs的负向调控。

通过预测软件TargetScan5.0和microrna.org，我们发现在CaMKII的3’-UTR区，有几个在脊椎动物中保守的miRNA的结合位点，包括miR-148/152,miR-217,miR-129-5p。

在本部分的研究中，我们探索了以上miRNA是否可以调控DC的成熟和功能。

实时荧光定量PCR检测显示miR-148/152的表达在TLR配体诱导的成熟及活化的小鼠骨髓来源的DC中显著上调，而miR-217,miR-129-5p无显著变化。

通过转染miRNA的模拟物或抑制剂，发现miR-148/152能抑制LPS诱导的DC表面MHCII类分子的上调,且能降低LPS、CpGODN和poly（I:

C）诱导的炎性细胞因子和I型干扰素的产生，其中包括促进T细胞增殖的IL-12。

更重要的是miR-148/152能抑制DC促发的抗原特异的T细胞增殖。

进一步研究表明miR-148/152直接作用于靶分子CaMKII-α3’-UTR，显著抑制CaMKII-α的蛋白水平和mRNA水平的表达。

综上所述，miR-148/152通过作用于靶分子CaMKII-α，从而负向调控TLR配体触发的DC初始免疫应答和抗原提呈功能。

miR-148/152为一新的DC成熟和功能的负向调节因子，为免疫应答反应的调控提供了另一种新的方式。

三、Ca2+/CaMKII与MHCII类分子之间的相互调控

以前的研究表明抗原刺激能诱导DC胞浆中钙流的上升，而上调的钙信号是DC成熟和功能发挥所需的一种重要因素。

CaMKII能调节DC的MHCII类分子的表达，抑制CaMKII的活化不但能增加MHCII类分子的溶酶体转运和降解，还能抑制MHCIImRNA的转录及稳定性。

然而，除了抗原之外其他分子交联MHCII类分子后引起的胞浆钙流及CaMKII的活化尚不很清楚。

我们发现，利用siRNA降低DC中CaMKII的表达可显著抑制LPS诱导的DC表面MHCII类分子的上调表达，而用抗体交联DC表面的MHCII类分子能增强LPS未诱导的和诱导的CaMKII的活化。

因此，我们的研究进一步表明Ca2+/CaMKII与MHCII类分子之间存在着相互正向调节，在DC的成熟和功能中发挥重要的调控作用。

四、MHCII类分子逆向信号促进TLR触发巨噬细胞与树突状细胞的天然免疫应答反应及其机制研究

目前对于MHCII类分子的非经典功能的研究比较少。

既然MHCII类分子与TLR均主要表达于专职抗原提呈细胞上，我们设想MHCII类分子能否感应或辅助感应危险信号，或者对危险信号激发的免疫反应具有调控作用呢？

利用基因敲除小鼠及RNA干扰技术，我们对这一问题进行了研究。

与野生型小鼠（MHCII+/+）相比，MHCII缺陷（MHCII-/-）小鼠腹腔巨噬细胞和骨髓来源的DC在LPS、CpGODN和poly（I:

C）刺激后，产生的IL-6、TNF-α、IL-12和IFN-β显著降低。

在巨噬细胞和DC中干扰MHCII类分子的表达后，也明显降低了TLR配体诱导的上述细胞因子的分泌。

预先用特异抗体交联MHCII类分子后可显著上调LPS诱导的炎性细胞因子和I型干扰素的产生。

信号通路研究发现，MHCII类分子干扰后能抑制LPS诱导的MAPK、NF-κB的活化和IRF3的磷酸化。

另外，在TLR配体活化的巨噬细胞和DC中MHCII类分子能招募活化的Lck。

降低MHCII类分子的表达能抑制LPS诱导的Lck、PLCγ1和CaMKII的活化。

钙流检测发现，MHCII类分子干扰后能显著降低LPS促发的巨噬细胞胞浆中的钙流。

利用LPS诱导内毒素休克的体内实验显示，MHCII-/-小鼠的血清中IL-6、TNF-、IL-12和IFN-的水平较野生型小鼠明显降低。

综上所述，我们发现MHCII类分子能辅助TLR配体诱导非受体型蛋白酪氨酸激酶Lck的活化及下游的PLCγ1的活化，维持胞浆钙流的充分上升及钙信号下游的CaMKII的活化，从而促进炎性细胞因子和I型干扰素的产生，表明MHCII类分子的逆向信号能对TLR触发的信号转导以及天然免疫应答产生正向的调控作用，从而提出了MHCII类分子新的非经典功能，即MHCII类分子在先天免疫应答中也起重要的作用。

总之，我们四部分的内容研究了CaMKII、靶向CaMKIIα的miR-148/152以及MHCII类分子的相互作用及其对TLR信号转导的调控及相关的机制,证明了CaMKII和MHCII类分子是抗原提呈细胞—巨噬细胞和DC中TLR信号充分活化所必需的，同时发现了新的可以调控DC成熟和功能的miRNA（miR-148/152），揭示了CaMKII和MHCII这两种重要的分子可以在两种主要的抗原提呈细胞—巨噬细胞和DC中相互调控，从而共同参与维持免疫系统的平衡和稳定。

该研究结果拓宽了人们对于MHCII类分子的性质与功能的认识，丰富了TLR免疫识别及其调控机制的研究内容，也有望为免疫相关疾病发病机制的研究与治疗方法的寻找提供新的启示。

关键词：

巨噬细胞，树突状细胞，Toll样受体，钙/钙调素依赖性蛋白激酶II，MicroRNA，MHCII类分子，天然免疫

TheregulationofTLR-triggeredinnateimmuneresponseofmacrophagesandDCsbyCa2+/calmodium-dependentproteinkinaseIIandMHCIImolecule

LiuXingguang

ABSTRACT

TheabilityoftheinnateimmunesystemtorecognizeandrespondtomicrobialcomponentshasbeenlargelyattributedtoToll-likereceptors（TLRs）.Asanimportantkindofpatternrecognitionreceptors（PRRs）,TLRscomprisealargefamilyconsistingofatleast12membersandaremainlyexpressedonantigen-presentingcellssuchasmacrophagesanddendriticcells（DCs）.Recognitionofpathogen-associatedmoleculepatterns（PAMPs）byTLRsleadstoavarietyofsignalingeventsthatinitiateinnateimmunityandactivateimmunecellstoproduceproinflammatorycytokinesandtypeIinterferon（IFN）.Inaddition,TLRsignalingcaninducetheup-regulationofMHCIIandco-stimulatorymolecules,facilitateDCmaturationandinstructdevelopmentofantigen-specificadaptiveimmunity,especiallyTh1response.TLRsplayimportantrolesinlinkinginnateandadaptiveimmuneresponses.LessefficientactivationofTLRresponsemaynotevokepotentanti-infectionoranti-tumorimmunity,however,excessiveactivationofTLRmayalsoinduceimmunopathologicalprocesssuchasendotoxinshockandautoimmunediseases.VariousothersignalpathwaysareinvolvedinthetightregulationofTLRsignalingtoenhanceorattenuatetheiractivation,whichmaintaintheimmunologicalbalance.However,theseregulatorymechanismsremaintobefullyunderstooduptonow.

Calcium（Ca2+）functionsasamajorsecondmessengerthatregulatesabroadrangeofimportantcellularprocesses.ManyofthecellularresponsestoCa2+signalareinducedormodulatedbyafamilyofmultifunctionalCa2+/calmodulindependentproteinkinases（CaMKs）,amongwhichCaMKIIisaubiquitousserine/threonineproteinkinaseencodedby4separategenes（,,and）.CaMKIIcanphosphorylateupto50diversesubstratesincludingenzymes,kinases,ionchannels,andtranscriptionfactors,andisinvolvedinabroadrangeofcellularfunctions,suchasmetabolism,neurotransmitterrelease,cellproliferationandgeneexpression.PreviousstudiesshowedthatCaMKII-αplayedimportantrolesinimmuneresponses,includedTcellactivation,DCmaturationandantigenpresentation.LPShasbeenshowntoelicitCa2+fluxinmurinemacrophages,whichisimportantforTNF-production;CaMKIIwasalsoreportedtoenhanceplatelet-activatingfactor（PAF）-primedandLPS-inducedTNF-productioninTHP-1cells，suggestingapossibleinvolvementofCa2+fluxandCaMKIIinTLR4signaling．However,theexactrolesofCa2+andCaMKIIinTLR-triggeredproductionofproinflammatorycytokinesandtypeIinterferon,andthecross-talkbetweenCa2+/CaMKIIpathwayandTLRsignalingarestillpoorlycharacterized.

MicroRNAs（miRNAs）areshort,endogenous,non-codingRNAinvolvedinarangeofcellularprocesses.miRNAsalsoplayimportantrolesintheregulationofimmunologicalfunctionsincludinginnateimmuneresponsesofmacrophages;development,differentiationandfunctionofTcellsandBcells.However,fewmiRNAshavebeenfoundtobeabletoregulatetheinnateresponseandantigen-presentingfunctionofDCstodate.SinceCaMKIIhasbeenshowntobeanimportantregulatorofthematurationandfunctionofDCs,wewonderwhetherandwhatmiRNAscanregulatetheinnateresponseandAPCfunctionofDCsbytargetingCaMKII-α.

PreviousstudiesshowedthatantigenstimulationofDCinducesanincreaseincytosolicCa2+.Ca2+andCaMKIIwereshowntoregulatetheexpressionlevelofMHCIIinDCs.ThesestudiesindicatethatCa2+/CaMKIIcancross-talkwithMHCIIsignaling.Howerer,whetherligationofMHCIIbyantibodycaninduceCaMKIIactivationneedsfurtherinvestigation.

MHCIIarepredominantlyexpressedbyAPCsincludingdendriticcells,macrophagesandBcells,whiletheseAPCsarethemajorresponderstodangersignalssuchasmicrobialcomponents.PreviousstudiesshowedthereversesignalmediatedbyMHCIIcanregulatemanyimmuneresponsesinBcellandactivatedTcells.ItisreasonablystraightforwardtoproposethatMHCIImightberesponsibleforthesesignalsorregulatetheimmuneresponseinitiatedbydangersignals,whilewhichneedtobeconfirmed.

Inthisstudy,weintegratedtothinkaboutthefourquestionsraisedaboveandinvestigatedtheregulationofT