生物传感器在环境污染监测中的应用研究.docx
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生物传感器在环境污染监测中的应用研究
・综述与专论・生物传感器在环境污染监测中的应用研究3
ApplicationofBiosensorinEnvironmentalPollutantsMonitoring
王建龙1 张 悦 施汉昌 钱 易
Wangjianlong1 ZhanYue ShiHanchang QianYi
清华大学环境科学与工程系 环境模拟与污染控制国家重点联合实验室,北京100084
StateKeyJointLaboratoryofEnvironmentSimulationandPollutionControl, DepartmentofEnvironmentalScienceandEngineer2ing,TsinghuaUniversity,Beijing100084
摘 要:
简要介绍了生物传感器的基本组成、工作原理、分类及特点,重点论述了生物传感器在环境污染监测方面应用的研究进展。
关键词:
生物传感器;环境污染;环境监测
Abstract:
Basedonbrieflyintroducingthebasiccomposition,principle,classificationandthecharacteristicsofbiosensors,thepaperfocusedonreviewingtheapplicationsofbiosensorsinthemonitoringofenvironmentalpollutants.
Keywords:
Biosensor;environmentalpollution;environmentalmonitoring
生物传感器是一类特殊的化学传感器。
国际纯粹和应用化学联合会（IUPAC对化学传感器的定义为:
一种小型化的、能专一和可逆地对某种化合物或某种离子具有应答反应,并能产生一个与此化合物或离子浓度成比例的分析信号的传感器。
生物传感器应用的是生物机理,与传统的化学传感器和离线分析技术（如HPLC或质谱相比有着许多不可比拟的优势,如高选择性、高灵敏度、较好的稳定性、低成本、能在复杂的体系中进行快速在线连续监测。
它在环境保护领域里有着广阔的应用前景。
生物传感器是将生物感应元件的专一性与一个能够产生和待测物浓度成比例的信号传导器结合起来的一种分析装置。
产生信号的来源包括:
质子（H+浓度的变化;一些气体如氨和氧气的排放或吸收;光的释放、吸收或反射;热的释放;生物质的改变等等。
然后传导器通过电化学、热学、光学或压电学的方法将这些信号转变成可以测量的信号如电流、电势、温度变化、光吸收或生物质的增加等。
这个信号能够进一步被放大、处理或储存起来以备后用。
最先问世的生物传感器是酶电极。
Clark和Lyons最先提出酶电极的设想,他们把酶溶液夹在两层透析膜之间形成一层薄的液层,再紧贴在pH电极、氧电极和电导电极上,用于监测液层中的反应。
最先创建固定化酶传感器的是Updike和Hicks。
此后,不同底物酶电极的报道相继出现。
20世纪70年代中期,人们注意到酶电极的寿命一般都比较短,提纯的酶价格也比较昂贵,而各种酶多数来自微生物或动植物组织,因此就自然地启发人们研究酶电极的衍生物:
微生物电极、细胞器电极、动植物组织电极以及免疫电极等新型生物传感器,使生物传感器的类型大大增多。
本文介绍了生物传感器的近期研究进展和在环境污染监测中的应用。
1 生物传感器的基本组成和工作原理生物传感器由敏感元件,即生物元件和信号传导器组成。
下面列出了各种用来制作生物传感器的生物元件和传导器。
原则上讲,任何一种接受器都可以与适当的传导器结合起来制造出具有操作性能
3863基金资助项目（课题编号:
818-Q-08
1联系人,电话:
62785684,62772837;传真:
62771472;Email:
wangj1@
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的传感器。
生物元件:
生物体、组织、细胞、细胞器、细胞膜、酶、酶组分、感受器、抗体、核酸、有机物分子。
传导器:
电热测量式、电流测定式、电导率测量式、阻抗测定式、光强测量式、热量测定式、声强测量式、机械式、“分子”电子式。
生物传感器的选择性取决于它的生物敏感元件,而生物传感器的其他性能则和它的整体组成有关
。
图1 生物传感器工作原理示意图
生物传感器的早期研究主要是以酶作为生物元
件。
现在所用的生物元件包括抗原或抗体、酶或基质、各种酶的混合体、整个细胞或部分细胞、植物或动物组织和神经受体。
生物传感器的工作原理主要决定于敏感元件（分子识别单元和待测物质之间的相互作用,有以下几种类型:
（1将化学变化转化为电信号。
（2将热变化转化为电信号。
（3将光效应转变为电信号。
（4直接产生电信号方式。
除上述四种外,随着科学技术的发展,基于新的原理的生物传感器将不断出现,例如正在研究利用细胞受体和自激振荡等作用现象的新型生物传感器。
2 生物传感器的分类
生物传感器一般可从以下三个角度来进行分类:
1根据传感器输出信号的产生方式,可分为:
生
物亲合型生物传感器和代谢型或催化型生物传感器。
2根据生物传感器中分子识别元件上的敏感物质可分为:
酶传感器、微生物传感器、组织传感器、细胞传感器、免疫传感器等。
3根据生物传感器的信号转化器可分为:
电化学生物传感器、半导体生物传感器、测热型生物传感器、测光型生物传感器、测声型生物传感器等。
生物传感器的分类如图2所示
。
图2 生物传感器的分类
3 生物传感器的特点
生物传感器这种新的检测手段与传统的分析方法相比具有如下的优点:
（1生物传感器是由选择性好的生物材料构成的分子识别元件,因此一般不需要样品的预处理,它利用优异的选择性把样品中的被测组分的分离和检测统一为一体,测定时一般不需加入其他试剂。
（2由于它的体积小,可以实现连续在线监测。
（3响应快,样品用量少,且由于敏感材料是固定化的,可以反复多次使用。
（4传感器连同测定仪的成本远低于大型的分析仪器,因而便于推广普及。
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4 生物传感器在环境监测中的应用
4.1 BOD生物传感器
BOD是目前最常用的、最重要的水质有机污染评价指标。
就BOD的分析技术而言,目前多采用传统稀释法。
这种方法操作烦杂,尤其是测样周期是5天,不能及时反应水质情况和反馈信息。
而生物传感器可在10~15min检测出BOD值,可对水质状况实行在线监测,因此具有广阔的应用前景。
BOD生物传感器的原理是:
当生物传感器置于恒温缓冲溶液中,在不断搅拌下,溶液被氧饱和,生物膜中的生物处于内源呼吸状态,溶液中的氧通过微生物的扩散作用与内源呼吸耗氧达到平衡,传感器输出一个恒定电流。
当加入样品时,微生物由内源呼吸转入外源呼吸,呼吸活性增强,导致扩散到传感器的氧减少,使输出的电流减少,几分钟后,又达到一个新的平衡状态。
在一定条件下,传感器输出电流值与BOD浓度呈线性关系。
已有许多人研究了测定BOD的微生物电极,第一个关于BOD微生物电极的报道是Karube等人于1977年发表的,他们利用从废水处理厂的活性污泥中分离的微生物,在有氧及丰富营养液中培养,然后制成微生物-胶原膜,把这个固定化的微生物膜与氧电极组装在一起即可测定BOD值。
但是,用活性污泥中的混合微生物制作BOD电极,其重现性不好,因为微生物的活性取决于微生物的种类。
1979年,Hikuma等又用单一酵母菌制得了BOD电极,这种电极是将酵母菌固定在醋酸纤维素膜上,制成的微生物膜与氧电极组合。
电极的响应时间为18min,电极持续使用了7天,测定400次。
此外,还有一些将酵母菌固定在氧电极表面或固定在纸片上制成微生物电极的报道。
除酵母外,另外还有用假单胞菌（Pseu2domonas、芽孢杆菌（Bacillus、发光菌、嗜热菌以及混合微生物种群制成的BOD传感器。
未来的BOD传感器有望使用半导体装置,使传感器小型化并可一次性使用。
BOD微生物传感器电极一个尚未解决的问题就是微生物细胞在测定废水中有毒物质时“中毒”。
中毒的微生物会错误地将污染水指示为“清洁”水,因此有必要用一标准校正溶液来监示电极的性能。
此外,由于一种微生物不可能对各种废水中的有机物都降解,因此,目前研制的各种BOD微生物传感器只适用于部分类型的废水,这个矛盾,恐怕一时难以克服。
可行的办法是用一台测定仪带多种不同微生物的BOD传感器,这样可以扩大应用。
另外,用常温微生物组成的BOD微生物电极有些共同的缺点,如不耐高温、微生物易受化学试剂如酸、碱、毒物的影响。
因此BOD微生物电极的使用寿命不长。
为了克服上述缺点,日本的轻部征夫研究了用嗜热菌组成的BOD微生物传感器,它的最适温度是65℃,并具有对化学试剂的抗毒作用。
在此温度下使用还可避免废水中杂质对微生物膜的污染,延长微生物膜的使用寿命。
4.2 酚类微生物传感器
炼油、煤气洗涤、炼焦、造纸、合成氨、木材防腐和化工等废水中常含有酚类化合物,各国普遍采用4-氨基安替比林光度法分析。
但硫化物、油类、芳香胺类等干扰其测定。
用酶电极安培传感器检测酚类化合物,电极表面的酶分子被氧（当酶是酚氧化酶如酪氨酸酶、漆酶时或过氧化氢（当酶是过氧化氢酶时氧化,接着被酚类化合物重新还原,酚类主要转化为苯醌或酚自由基,这些产物通常具有电化学活性,能在相对于饱和甘汞电极（SCE0V以下的电位还原,还原电流与溶液中酚类化合物的浓度成正比。
这种传感器结构简单,能防止高分子产物在电极表面的积累,且电极操作在电化学测量的最佳范围———0.2~0V（对SCE,此时噪音低,背景电流小,大大降低了检测限,干扰反应也少。
与全自动流动注射分析或液相色谱系统联用,该酶传感器能检测复杂的环境样品,准确度高,检测限可低于μg/L水平。
检测苯酚的酶有两类:
第一类属于含铜蛋白质———苯酚氧化酶,可以从真菌、马铃薯等物种中获得;另一类是从Trichosporoncutaneum中提取的黄素蛋白苯酚2-单氧合酶。
这类酶的不足之处是需要NADPH作为电子供体。
NADPH的功能是还原酶的FAD修补基团使酶能与氧结合（氧化苯酚。
这样就增加了使用成本和复杂程度,使得这种酶在制造酶电极时变得不太适合。
苯酚氧化酶的催化反应可以通过如下反应式加以说明（酪氨酸酶作催化
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剂将3,4-二羟基苯丙氨酸氧化成苯丙氨酸醌
。
3,4-二羟基苯丙氨酸 苯丙氨酸醌
由于此过程需要氧气,所以酶促反应的速度可以直接用Clark型氧传感器进行监测。
这种氧传感器的主要部件是一对插入到一种电解质溶液中的电极,电解质溶液通过透气性的憎水膜与待测溶液分开。
4.3 阴离子表面活性剂传感器
生活污水中烷基苯磺酸（LAS这类阴离子表面活性剂比较多,它们的自然降解性差,在水面产生不易消失的泡沫,并消耗溶解氧,甚至能改变污水处理装置中活性污泥的微生物生态系统。
利用能降解LAS的细菌,Nomura等人研制出一种用来探测阴离子表面活性剂浓度的生物传感器,它包括能降解LAS的细菌和一个氧电极。
其工作原理为:
当阴离
子表面活性剂存在时,细菌的呼吸作用增加,导致溶
解氧变化。
4.4 水体富营养化监测传感器
研究表明,水体富营养化的一个原因是氰细菌
（Cynobacteria大量增殖,这些细菌能杀死水生植
物,从而产生恶臭。
生物传感器可实现对水体富营
养化的在线监测。
由于氰基细菌的细胞体内有藻青蛋白（phycocyanin存在,其显示出的荧光光谱不同于其他的微生物,用这种对荧光敏感的生物传感器就能监测氰基细菌的浓度,预报藻类急剧繁殖状况。
4.5 生物传感器检测硝酸盐、亚硝酸盐及氨氮
生物传感器可用来分析水质中含有的硝酸盐、亚硝酸盐及氨氮等。
Kobos研究了测定硝酸盐的细菌膜电极,硝酸根在细菌细胞的硝酸盐还原酶和亚酸盐还原酶的作用下发生如下反应:
NO3-+NADH→NO2-+NAD++H2O
NO2-+3NADH→NH3+3NAD++2H2O
用一个氨敏电极可以检测产生的氨,把含有所需酶的固氮菌株耦合到一个氨敏电极中,从而得到对硝酸盐敏感的细菌式传感器。
许多测定硝酸盐的其它方法,大多数受到一些常见离子的干扰,如氯化物、高氯酸盐、氯酸盐、铁、硫酸盐和草酸盐等,为了消除这些物质,测定之前,总要进行预处理。
这种细菌式电极,相对地不受离子的干扰,因为它是以气敏电极为基础,气敏电极对离子不响应。
亚硝酸还原酶在电子传递体存在下,可使亚硝酸盐还原成铵盐:
NO2-+6e8H+→NH4++2H2O
Kiang等报道用亚硝酸还原酶膜与氧电极偶
联,静态测定亚硝酸盐浓度,获得成功。
将亚硝酸还原酶固定化后,添加到要测定的亚硝酸盐溶液中,再结合氨电极进行检测。
其线性范围可达1×10-4~5×10-2mol/L,酶活性可稳定三周,在pH=8.2时,浓度高于亚硝酸盐一倍的SO42-、SO32-、NO3-、ClO4-等均无干扰。
氨是环境监测中经常要检测的一个指标。
用复合玻璃电极和透气膜组成的氨气敏电极在检测氨时必需在强碱条件下进行（pH>11,有些挥发性化合物如胺等会干扰测定。
已有报道,由固定化硝化菌聚四氟乙烯透气膜和氧电极所组成的电极可用于氨的检测。
硝化菌以氨作为唯一能源并按下式消耗氧。
2NH3+3O2→2HNO2+H2O氨的浓度可以通过检测附着在氧电极上的固定化微生物的呼吸量来测定。
在pH9.0,温度30℃~38℃下,电极的响应时间为8min左右,若用脉冲法
测定,响应时间仅为4min,检测的最大浓度为42mg/L,最小浓度为0.1mg/L。
实验证明电极可连续测定1400次,使用两周以上。
4.6 生物传感器用于检测有毒有害物质
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生物传感器不仅可用来检测水质的常规污染指标,还可用于检测某种或某一类有毒有害污染物,如杀虫剂、除草剂、重金属等。
用于检测杀虫剂的最常见的酶是乙酰胆碱酯酶,它能催化乙酰胆碱水解成胆碱和乙酸。
有机磷杀虫剂中的一大分支,包括对硫磷、马拉硫磷、甲氟磷酸异丙酯等,它们能与酶结合成非常稳定的共价物磷酸激酶从而阻碍了酶的活性。
将固定化乙酰胆碱酯制成的生物传感器放入含有杀虫剂的试样中就可以测量出酶活性的抑制程度。
Goodson和Jacobs将酶固定在开孔的聚氨基甲酸酯泡沫垫片上,然后将垫片置于铂电极的表面。
使用的底物为人工合成的丁基硫胆碱酯。
乙酰胆碱酶能将硫酯水解成电活性很高的硫醇（硫醇能在铂阳极表面迅速地氧化成二硫化物。
当酶不受抑制时,就会输出一个最大的稳定信号,当溶液中含有抑制剂时,这个信号的大小就会降低一个与抑制剂浓度成比例的量。
这个反应可总结如下
:
重金属离子作为一个总体,从原则上讲,可以被任何具有-SH催化基团的酶加以检测。
重金属离子和硫醇基的结合会使酶的催化活性降低。
Gayet等筛选出了许多适合对金属离子进行检测的氧化酶。
这些酶用戊二醛固定在膜的表面,然后将膜放置在溶解氧传感器上面做成探头,可以用来测定重金属离子的浓度。
研究发现用这种探头可以测定Hg
2+
和Ag+
。
以用丙酮酸氧化酶制成的生物传感
器为例,当溶液中HgCl2的浓度为1.0μm或者Ag2NO3的浓度为0.1
μm时,响应基线会降低50%（酶活性降低50%。
当这种酶生物传感器的酶失活时,可以用10mM的EDTA进行清洗再生,从而实现这种传感器的重复使用。
另外,可采用细菌发光传感器检测污染物的急性毒性。
发光细菌因其独特的生理特性而被看作是一种较理想的生物指示剂。
发光细菌毒性实验因其
检测时间短（15min,灵敏度高（细胞基本物质代谢
受到影响前发光反应先受抑制而被世界各国广泛利用。
我国1995年也将这一方法作为环境毒性检测的标准方法。
4.7 CO2传感器
常规的电位传感器,常会有各种离子和挥发性酸的干扰。
Shiroaki等使用自养微生物和氧电极的CO2传感器,传感器对浓度在3%~12%之间的CO2
有线性响应,灵敏度高,寿命长于一个月,能进行连续自动在线分析。
Suzuki等人利用半导体技术研究出一种使用更为方便的CO2生物传感器。
4.8 亚硫酸传感器
NOX和SO2是酸雨和酸雾形成的主要原因。
用
常规方法检测这些化合物的浓度很复杂,因此简单适用的生物传感器便应运而生。
Karube等用亚细胞类脂类（含亚硫酸盐氧化酶的肝微粒体和氧电极制成安培型生物传感器,用于测定亚硫酸盐。
相当于2.7mg蛋白量的类脂质被固定在醋酸纤维膜上,该膜附着于氧电极两层Teflon气体渗透膜之间。
当SO2~3样品溶液经过氧电极表面时,微粒体在氧化样
品的同时消耗氧,引起电极周围溶解氧的降低,使传感器的电流随着时间的延长而急剧减小,直至10min后达到稳定状态。
在SO2~3的浓度小于3.4
×10-4mol/L时,电流与SO2~3的浓度呈线性关系,最小检测浓度为0.6×10-4mol/L。
30次实验的标准偏差为0.3×10-4mol/L。
用类脂质作传感器的生物单元,克服了分离亚硫酸氧化酶的困难,但类脂质的寿命仍取决于其中的亚硫酸氧化酶,在冷冻-20℃的贮存条件下,其活性可保持6个月,但在37℃
下使用和保存时,该传感器的寿命只有2天,能满足20次分析。
用硫杆菌和氧电极制作出的微生物传
感器,比Karube等制作的传感器要稳定,硫杆菌被固定在两个硝化纤维膜之间,由于亚硫酸盐存在时微生物的呼吸作用会增加,相应溶解氧的下降即可被测出。
4.9 甲烷传感器
甲烷是一种清洁燃料,但空气中甲烷含量在5%~14%之间具爆炸性。
从天然物质中提取并在
纯的培养环境中生长的甲烷氧化细菌,甲基单胞鞭毛虫（Methylomonasflagellata,利用甲烷作为唯一
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生物技术通报 BiotechnologyInformation 2000年第3期能源进行呼吸,同时消耗氧。
将甲基单胞鞭毛虫用琼脂固定在醋酸纤维膜上,制备出固定化微生物反应器（每个反应器固定有300mg细胞用以测定甲烷。
分析甲烷气总共需时间2min。
甲烷浓度低于6.6mmol/L时,电极间的电流差与甲烷浓度呈线性μ关系,最小检测浓度为13.1mol/L。
该传感器系统可用于大气中甲烷含量的快速、连续监测。
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