基因诊断操作手册Word下载.docx
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可先用3ml的1×
红细胞裂解液洗一次,2500rpm,10min,1×
核裂解液600l,20%SDS30l,蛋白酶K4-6l,依细胞量而定,消化2h,(或放4℃过夜,第二天再处理),羊水可用异丙醇沉淀DNA。
贴壁细胞抽提DNA:
弃上清,加2-3ml破膜液或1×
PBS洗1
(2)次,弃上清,吸尽余液;
加1×
核裂解液1ml(700l),20%SDS50l(40l),慢慢加,边加边观察溶液粘稠度,蛋白酶K10l,混匀,37℃摇床上2h(51rpm/分,3h);
取1ml(800l)饱和酚加入方形培养瓶,轻轻混匀,将混合液转移至15ml离心管,余下步骤同常规羊水DNA抽提(400l苯酚/400l氯仿→800l氯仿)
二、聚丙烯酰胺凝胶电泳
分为变性胶与非变性胶两种,区别在于前者中含有一定浓度的变性剂(尿素、甲酰胺或两者合用)。
其基本原理是单体丙烯酰胺在过硫酸铵与TEMED(N,N,N’N’-四甲基乙二胺)的催化与诱导下聚合成长链,当有N,N’-亚甲双丙烯酰胺参与聚合反应时,长链与长链之间就交联成凝胶,其孔径由链长与交联度决定,当DNA分子进入凝胶,在电场下进行泳动时,可根据各自迁移率的不同而得以分离。
非变性胶可用于双链DNA分子的分离与纯化,变性胶可用于单链DNA分子的分离与纯化。
由于变性聚丙烯酰胺凝胶电泳可消除DNA分子不同构象对迁移率的影响,常用于进行遗传病家系的单体型分析。
1、试剂:
1)30%丙烯酰胺:
丙烯酰胺29g
N,N’-亚甲双丙烯酰胺1g
加去离子水至100ml室温避光保存
2)10%过硫酰铵(APS):
过硫酰铵1g
加去离子水至10ml4℃避光保存
3)TEMED(N,N,N’,N’-四甲基乙二胺)4℃避光保存
4)10×
TBE:
Tris碱108g
硼酸55g
0.5MEDTA(pH8.0)40ml
加去离子水至1000ml高压蒸气灭菌,室温保存
5)8%丙烯酰胺(含50%尿素):
丙烯酰胺38g
N,N’-亚甲双丙烯酰胺2g
10×
TBE25ml
尿素250g
加去离子水至500ml室温避光保存
6)6×
非变性载样缓冲液:
二甲苯青FF0.025g
溴酚蓝0.025g
0.5MEDTA(pH8.0)300l
蔗糖4g
加去离子水至10ml4℃保存
2×
变性载样缓冲液:
二甲苯青FF0.0083g
溴酚蓝0.0083g
0.5MEDTA(pH8.0)100l
加去离子甲酰胺至10ml4℃保存
7)固定液:
无水乙醇50ml
冰醋酸2.5ml
加一蒸水至500ml
染色液:
AgNO31g
加一蒸水至500ml
显色液:
NaOH3.75g
甲醛(30%)2.7ml
加一蒸水至500ml
2、操作步骤:
1)选择合适的垂直电泳槽与大小相配的两块玻璃板(其中一块为U形),及两玻璃板间的间隔片和点样梳。
2)用洗涤剂清洗干净两块玻璃板,烘干或晾干。
3)装配灌胶板:
在两块玻璃板间放好间隔片,在玻璃板两边夹好夹子,插上点样梳,根据梳子的松紧调整间隔片及夹子的位置,在两块玻璃板的底边封好一层胶带。
4)配制胶液(丙烯酰胺有神经毒,操作时必须戴手套)。
6%非变性胶:
30%丙烯酰胺6ml
TBE1.5ml
10%过硫酸胺300l
去离子水加至30ml
8%变性胶:
8%丙烯酰胺(含50%尿素)50ml
10%过硫酸铵500l
5)封底胶:
胶液配好后,充分混匀,取出5ml胶液加入TEMED15l,快速混匀,将玻璃板倾斜,迅速倒进两块玻璃板之间封底。
6)灌胶:
待底胶凝固后,剩余胶液内加TEMED20l,混匀,将玻璃板倾斜,缓慢灌入胶液(注意灌胶时应连续,避免产生气泡,有气泡要及时去除)。
7)胶液灌好后,在玻璃板上方插入相应的点样梳(插梳子注意去除梳齿下残留的气泡,且不要将梳子全部插入胶内,留约2mm在胶外,以免拔梳子时将胶孔桥拔断)。
8)室温下让凝胶聚合约1-2小时。
9)配制1L0.5×
TBE电泳缓冲液(50ml10×
TBE加去离子水至1L),混匀后,加入上下电泳槽中。
10)小心拔下梳子,用电泳槽内的TBE冲洗胶孔(避免残留的丙烯酰胺再聚合,导致点样孔不整齐,影响电泳的带形),去掉封口的胶带以及玻璃板两边的夹子,将胶板用固定夹固定在电泳槽上(有凹面的玻璃朝向电泳槽),接通电源,300V(400V)预电泳10分钟。
11)非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳时,在待上样的DNA样本中加入1/5体积的6×
非变性载样缓冲液,混匀后上样(上样时注意不要有气泡冲散了样品,且上样速度尽量快些,以免样品扩散)。
上样结束后,300V恒压电泳,待二甲苯青FF指示剂电泳至合适的位置后停止电泳。
变性聚丙烯酰胺凝胶电泳时,在待上样的DNA样本中加入等体积的2×
变性载样缓冲液,置PCR自动热循环仪上95℃变性5分钟,变性结束后样本立即插入冰上,上样(上样前需用注射器将上样孔再冲洗一次,以免残留的尿素结晶使得DNA电泳带型模糊变形)。
上样结束后350V恒压电泳(最好是用带循环水装置的电泳设备于50℃恒温电泳,可保证胶板温度均匀),待二甲苯青FF指示剂电泳至合适的位置后停止电泳。
12)电泳结束后取下胶板,小心掀开玻板,移去间隔片,用银染法显色:
将凝胶小心移入一托盘内,固定液固定2分钟,一蒸水漂洗一次→染色液染色10分钟→一蒸水漂洗两次,每次半分钟→显色液显色,至出现清晰DNA产物带型,凝胶用一蒸水漂洗一次后,转移到保鲜膜上,用保鲜膜包好。
电泳结果拍照或用图像处理系统进行扫描。
表1DNA在聚丙烯酰胺凝胶中的有效分离范围及标准参照染料迁移率
聚丙烯酰胺[%(W/V)]
有效分离范围(bp)
二甲苯青FF
溴酚蓝
3.5
1000-2000
460
100
5.0
80-500
260
65
8.0
60-400
160
45
12.0
40-200
70
20
15.0
25-150
60
15
20.0
6-100
12
表2:
变性的聚丙烯酰胺凝胶中标准参照染料迁移率
%聚丙烯酰胺
5
35
130
6
26
106
8
19
76
10
55
28
表3:
各浓度聚丙烯酰胺凝胶的配制
组分
制备浓度(%)
30%丙烯酰胺(ml)
11.6
16.6
26.6
40.0
50.0
66.6
双蒸去离子水(ml)
67.7
62.7
52.7
39.3
29.3
12.7
5×
TBE(ml)
10%过硫酸铵(ml)
0.7
总体积
100ml
3、常见问题及对策
问题
可能原因
解决办法
带模糊或拖尾
1、胶板过热
2、缓冲液与凝胶TBE浓度不一致
3、DNA量太多
1、降低电压或缓冲
液离子强度
2、用同一批TBE制
胶及配制电泳缓冲液
3、减少点样量
带型扭曲
1、上样孔变型
2、泳道上有气泡
1、重新制胶
2、重新制胶
带型不平
1、底胶不平
2、胶板两边松紧不一
1、重新制胶
2、重新制胶
制胶时漏胶
1、底胶没封好
2、胶带封口不严
3、所用试剂失效(主要是10%APS)
1、重灌底胶
2、重新封口
3、重新配制试剂
三、DMD基因诊断与产前诊断
假性肥大型进行性肌营养不良(Duchenne/Beckermusculardystrophy,DMD/BMD)是一类发病率较高的X连锁隐性遗传病。
Duchenne和Becker型进行性肌营养不良(DMD/BMD),是常见的遗传性肌病,在3500个活产男婴中就有一个DMD患者,BMD的发病率约为1/30000。
二者是由DMD基因不同突变类型导致不同的临床表现。
DMD多于5岁前发病,表现为上楼梯困难,走路时呈鸭型步态,不能跳跃,常伴有肌肉假性肥大,以腓肠肌明显,病情进展迅速,大多在13岁之前失去独立行走能力,随着病情加重,20岁左右死于呼吸衰竭和/或心脏并发症。
与DMD相比,BMD起病年龄较晚,症状较轻、进展较缓慢,多于16岁之后失去独立行走能力,寿命可达到40~50岁。
充分了解DMD基因的特点、突变类型及特点,有助于我们有效选择适合的检测方法,为该类疾病的遗传咨询和产前诊断提供有效的信息。
以下是我室目前所用的方法。
一、基因诊断与产前诊断方法:
1、检测缺失:
多重PCR-聚丙烯酰胺凝胶电泳。
2、连锁分析:
PCR-变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(仅限于DMD/BMD疾病的分析)。
3、性别鉴定:
SRY(Y染色体上性别决定区域)的检测。
(仅限于产前诊断)
二、基因诊断流程:
临床确诊或高度怀疑为DMD/BMD(包括排除性诊断)→遗传咨询门诊就诊→采集家系成员抗凝外周血(先证者、母亲、父亲及先证者的兄弟姐妹与家系内的其他待证者)→提取gDNA→多重PCR-聚丙烯酰胺凝胶电泳(18个外显子)+PCR-变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(DMD基因内部的9个位点)→发现缺失,在基因水平上可以确诊为DMD,未见缺失,在基因水平不能确诊,但也不能排除为DMD的可能(非缺失型或未检测的外显子缺失型或其他类型的缺失、重复、点突变等)。
通过连锁分析可以判断待证者是否遗传与先证者相同的DMD基因及DMD基因部分交换的情况,如携带致病DMD基因,男性为患者,女性为携带者;
未遗传与先证者相同的致病DMD基因,则可排除患与先证者同类型DMD的可能。
三、产前诊断流程:
产前诊断必须建立在先证者基因诊断或临床诊断确诊为杜氏/贝氏进行性肌营养不良病患者的基础上!
有DMD家族史且先证者基因诊断确诊或临床确诊为DMD/BMD→遗传咨询门诊就诊→采集家系成员抗凝外周血及胎儿羊水或脐带血(先证者、母亲、父亲、胎儿及先证者的兄弟姐妹与家系内的其他待证者)→提取gDNA→多重PCR-聚丙烯酰胺凝胶电泳(18个外显子)+PCR-变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(DMD基因内部的9个位点)+性别鉴定(SRY)→发现缺失,在基因水平上可以确诊为DMD,未见缺失,在基因水平不能确诊,但也不能排除为DMD的可能(非缺失型或未检测的外显子缺失型或其他类型的缺失、重复、点突变等)。
通过连锁分析可以判断待证者(包括胎儿)是否遗传与先证者相同的DMD基因及DMD基因部分交换的情况,如携带致病DMD基因,男性为患者,并建议其引产,女性为携带者,建议继续妊娠,但怀孕后必须对胎儿进行产前诊断;
未遗传与先证者相同的致病DMD基因,则可排除患与先证者同类型DMD的可能,建议继续妊娠。
四、实验条件:
(SRY祥见脆性X)
外显子多重PCR扩增
A、B组mPCR组合及引物
外显子
引物名称
引物序列
片段(bp)
终浓度
(ng/ul)
A组
4
DMD-4F
5’-TTgTCggTCTCCTgCTggTCAgTg-3’
5’-AAgCCCTCACTCAAACATgAAgC-3’
196
1.0
DMD-4R
DMD-8F
5’-gTCCTTTACACACTTTACCTgTTgAg-3’
5’-ggCCTCATTCTCATgTTCTAATTAg-3’
360
1.8
DMD-8R
DMD-19F
5’-TTCTACCACATCCCATTTTCTTCCA-3’
5’-gATggCAAAAgTgTTgAgAAAAAgTC-3’
459
2.3
DMD-19R
44
DMD-44F
5’-CTTgATCCATATgCTTTTACCTgCA-3’
5’-TCCACACCCTTCAgAACCTgATCT-3’
268
1.35
DMD-44R
17
DMD-17F
5’-gACTTTCgATgTTgAgATTACTTTCCC-3’
5’-AAgCTTgAgATgCTCTCACCTTTTCC-3’
416
2.1
DMD-17R
DMD-45F
5’-AAACATggAACATCCTTgTgggAC-3’
5’-CATCCTATTAgATCTgTCgCCCTAC-3’
546
3.0
DMD-45R
48
DMD-48F
5’-TTgAATACATTggTTTAAAATCCCAACATg-3’
5’-CCTgAATAAAgTCTTCCTTACCACAC-3’
506
2.5
DMD-48R
51
DMD-51F
5’-gAAATTggCTCTTTAgCTTgTgTTTC-3’
5’-ggTAgAgTAAAgTgATTggTggAAAATC-3’
388
1.95
DMD-51R
DMD-60F
5’-AggAgAAATTgCgCCTCTgAAAgAgAACg-3’
5’-CTgCAgAAgCTTCCATCTggTgTTCAgg-3’
139
0.75
DMD-60R
B组
Pm
Pm-F
5’-gAgATCTAgCAgTggATACATAACAAATTgCATg-3’
5’-TTCTCCgAAggTAATTgCCTCCCAgATCTgAgT-3’
535
Pm-R
3
DMD-3F
5’-TCATCCATCATCTTCggCAgATTAA-3’
5’-CAggCggTAgAgTATgCCAAATgAAATCA-3’
410
2.2
DMD-3R
DMD-6F
5’-CCAgATgTAggTCAAAAATgTAATgAA-3’
5’-gTCTCAATCTTCTTACCTATgACTATgg-3’
202
1.05
DMD-6R
DMD-12F
5’-gATAgTgggCTTTACTTACATCCTTC-3’
5’-gAAAgCACgACgCAACATAAgATACACCT-3’
331
1.7
DMD-12R
13
DMD-13F
5’-AATAggAgTACCTgAgATgTAgCAgAAAT-3’
5’-CTgACCTTAAgTTgTTCTTCCAAAgCAg-3’
238
1.2
DMD-13R
43
DMD-43F
5’-gAACATgTCAAAgTCACTggACTTgATgg-3’
5’-ATATATgTgTTACCTACCCTTgTCggTCC-3’
357
1.9
DMD-43R
47
DMD-47F
5’-CgTTgTTgCATTTgTCTgTTTCAgTTAC-3’
5’-gTCTAACCTTTATCCACTggAgATTTg-3’
181
0.9
DMD-47R
50
DMD-50F
5’-CACCAAATggATTAAgATgTTCATgAAT-3’
5’-TCTCTCTCACCCAgTCATCACTTCATAg-3’
271
1.4
DMD-50R
52
DMD-52F
5’-AATgCAggATTTggAACAgAggCgTCC-3’
5’-TTCgATCCgTAATgATTgTTCTAgCCTC-3’
113
DMD-52R
mPCR扩增体系及条件
分别将9对引物按照一定比例混合,混合后每一对引物的中浓度在4~15ng/μl范围之内,分为A、B两组。
mPCR应用GoldTaqDNA聚合酶来扩增,反应体系为20ul(见表1-3)。
mPCR反应体系
试剂(Reagents)
体积(Volume)
10Buffer
2.0l
MgCl2
dNTPs(10mM)
0.65l
GoldTaq(5U/l)
0.3l
Primers(4-15ng/l)
4.0l
DNA模板(30ng/l)
ddH2OAddto
20.0l
mPCR反应条件和程序:
采用touchdown方法,前面10个循环中,每循环降低1℃、延长2s,共30个循环。
95℃11min→95℃60s
↙↖10cycle
62℃35s→72℃100s→95℃60s
(-1℃、+2s/cycle)↙↖22cycle
50℃40s→72℃90s→72℃20min→4℃∞
PCR产物检测:
聚丙烯酰胺凝胶电脉,银染法检测。
取PCR产物1.5ul(产量低要多加,产量高反之),6%聚丙烯酰胺凝胶电泳1.2小时,恒定电压300V。
银染后扫描。
连锁分析PCR:
9个微卫星位点引物序列
位点
长度(bp)
Tm值(℃)
2CA
2CA-F
5’-ttcagtttctctcggtgttcct-3’
5’-tacacctgcacatgtgatgaaa-3’
112
2CA-R
7CA
7CA-F
5’-ttctggttttctggtctg-3’
5’-gaatcaatctctctgtcaag-3’
226
7CA-R
44CA
44CA-F
5’-tccaacattggaaatcacatttcaa-3’
5’-tcatcacaaatagatgtttcacag-3’
57
44CA-R
45CA
45CA-F
5’-gaggctataattctttaactttggc-3’
5’-ctctttccctctttattcatgttac-3’
172
45CA-R
49CA
49CA-F
5’-cgtttaccagctcaaaatctcaac-3’
5’-catatgatacgattcgtgttttgc-3’
249
49CA-R
50CA
50CA-F
5’-aaggttcctccagtaacagatttgg-3’
5’-tatgctacatagtatgtcctcagac-3’
241
59
59CA
59CA-F
5’-tgtctgtcttcagttatatg-3’
5’-ataacttacccaagtcatgt-3’
251
59CA-R
63CA
63CA-F
5’-tagaacccaaatgacaacca-3’
5’-aagatagcaggcaacaataaga-3’
63CA-R
3’CA
3’CA-F
5’-tttccaaacttcactaaaac-3’
5’-aaaatgttgttgtactggtc-3’
133-139
3’CA-R
PCR反应体系为20ul(表1-6),反应程序为:
在95℃3min,95℃40s,于相应的Tm进行退火35s,72℃延伸35s(时间可根据片断大小进行调整),30-33个循环,72℃总延伸8min,4℃保存。
9个微卫星位点PCR扩增体系
0.4l
Taq(5U/l)
0.2l
Primers(100ng/l)
各0.5l
ddH2OAddto
20l
变性聚丙烯酰胺凝胶电脉,银染法检测。
取PCR产物3-6ul(产量低要多加,产量高反之),加等量2×
变性载样缓冲液,于96℃变性15分钟,立刻置冰上,8%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳3-4小时(依片断大小而定),恒定电压350V。
四、SMA基因诊断与产前诊断
儿童期起病的进行性脊肌萎缩症(spinalmuscu2laratrophy,SMA),是较常见的常染色体隐性遗传病。
本病由于下运动神经元变性导致进行性、对称性肌萎缩和肌张力减低。
其发病率为1∶6000~1∶10000[1],居致死性常染色体隐性遗传病的第2位,仅次于囊性纤维变。
儿童期的SMA分3型[2]:
SMAⅠ型,又称婴儿重型、Werdnig-Hoffmann病,患儿出生后6