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论文评阅人：

TheApplicationOfDatabase

学科门类：

工学

XX

XXX教授

食品科学

学位授予单位：

2010年月日

论文答辩日期：

集

美

大

学

硕

士

位

论

文

数

据

库

的

应

用

黄

娟

学术诚信声明

兹呈交的学位论文，是本人在导师指导下独立进行的研究工作及取得的研究成果。

除文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。

本人依法享有和承担由此论文产生的权利和责任。

声明人（签名）：

时间：

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作者（签名）：

导师（签名）：

水杨酸、水杨酸甲酯生物活性研究

摘要

水杨酸（salicylicacid，SA）、水杨酸甲酯（methylsalicylate，MeSA）是食品、化妆品等领域应用的一种酚类香料。

存在于植物体内的SA、MeSA可强化植物的抗逆性，常被作为植物应对胁迫反应的一种信号分子。

有关SA、MeSA生物活性及机理的探究报道目前主要为细胞、生理层面，至今还鲜见从分子水平对SA、MeSA生物活性和作用机制的探讨。

本文利用稳态的邻苯三酚自氧化法、微生物法、紫外光解法、琼脂糖凝胶电泳法分别研究了SA、MeSA在水、O/W微乳液中清除有毒物—超氧自由基（·

O2-）、单线态氧（1O2）、亚硝胺的生物活性及其主要影响因子；

在此基础上，研究了水、O/W微乳液体系中SA、MeSA对DNA紫外辐射损伤的拮抗活性。

并与传统抗氧化剂（Vc）进行了对照。

辅以时间分辨脉冲辐解技术，通过观测SA、MeSA分别与DNA相互作用的特征瞬态吸收谱和生成-衰减动力学，获得了SA、MeSA快速修复DNA的损伤产物的原初证据，测取了反应的速率常数。

探讨了反应的分子机理。

全文共分为六章：

第一章引言部分。

详细介绍了SA、MeSA的结构与性质，综合评述SA、MeSA农业、食品、医学等方面应用及其生物活性的研究进展情况，并在此基础上提出了本论文的设想。

第二章采用邻苯三酚自氧化法对水、O/W微乳液体系中SA、MeSA清除·

O2-的性能及其主要影响因子进行了研究。

结果表明：

SA、MeSA对·

O2-均具有良好的清除能力。

在水浴20min，25℃、pH8.20的最佳条件下，1.60mmol/L的SA、MeSA水溶液对·

O2-的清除率为41.53%、46.60%；

在O/W乳液体系中相应为27.49%、37.74%。

第三章利用微生物法研究水、微乳液体系中SA、MeSA对1O2的抑制效果。

SA、MeSA对1O2均具有良好的抑制能力。

尤其O/W微乳液体系中SA、MeSA对1O2的清除率最高分别可达74.70%、95.31%，比等浓度的Vc（63.17%）还要高。

MeSA水溶液对1O2的清除率最高可达94.37%，效果优于等浓度的Vc（88.69%）。

第四章利用紫外光解法研究SA、MeSA在水、微乳液体系中对亚硝胺合成的阻断效果及其主要影响因子。

研究结果表明，在最佳反应条件下，与水溶液体系对比，1.28mmol/L的SA、MeSA在O/W微乳溶液中对亚硝胺合成的阻断率可升高至72.27%、73.34%；

3.20mmol/LSA、MeSA在O/W微乳溶液中对亚硝胺合成的阻断率可分别高达74.77%、81.48%。

第五章利用琼脂糖凝胶电泳、脉冲辐解技术分别研究了水、微乳液体系中强光、电子束引发SA、MeSA与DNA的相互作用。

通过凝胶电泳分别确定了SA、MeSA在两种不同体系中对DNA紫外辐射损伤所产生的拮抗、协同作用及其相应的浓度。

与水溶液体系结果对比，O/W微乳液体系中，0.1～0.8mmol/LSA、MeSA、Vc对DNA紫外辐照损伤均显示了明显的拮抗作用，而未出现协同破坏作用。

脉冲辐解实验观测结果表明：

在SA、MeSA与DNA的瞬态反应中，0.1mmol/LSA、MeSA均可通过电子转移反应，分别产生相应的酚氧自由基（Ph[SA]O·

、Ph[MeSA]O·

）、并快速修复DNA的损伤产物-DNA羟基加合物（DNA-OH），反应速率常数分别为9.07×

109dm3·

mol-1·

s-1和5.23×

s-1。

第六章结论与建议。

对本文的研究结果进行了总结，提出了今后继续开展相关研究内容的建议。

关键词水杨酸，水杨酸甲酯，活性氧，亚硝胺，小牛胸腺DNA，微乳液，脉冲辐解

StudyOntheBiologicalActivitiesOfSalicylicAcid

andMethylSalicylate

Abstract

Salicylicacid（SA）andMethylSalicylate（MeSA）areimportantphenolicspicesappliedintheareaoffoodandcosmeticproducts.SAandMeSAinplantsmayservetostrengthentheplants’resistancetoadverseconditionassignalmoleculesinplantstoresponsetostress.Sofar,investigationreportswithregardtothebiologicalactivityandmechanismsofSAandMeSAhavebeenconductedmainlyincellularandphysiologicallevels,butrarelyinmolecularlevel.

Inthispaperweusesteady-statepyrogallolautoxidationmethod,microbiologicalmethod,UVmethodandagarosegelelectrophoresistostudythebiologicalactivitiesandmainaffectingfactorsofSAandMeSAtoremovetoxicantssuchassuperoxidateradicals（·

O2-）,singletoxygen（1O2）andnitrosaminesinwaterandO/Wmicroemulsion.Basedonthis,weinvestigatedtheantagonisticactivitiesofSAandMeSAinwaterorO/WmicroemulsionsystemtoDNAdamagesbyUVradiationandcomparedthatwithtraditionalantioxidant.Withtheassistanceoftime-resolvedpulseradiolysistechnology,throughtheobservationofthefeaturetransientabsorptionspectraandkineticsofinteractionsbetweenSA,MeSAandDNA,theoriginalevidencethatSAandMeSAmayquicklyrepairthedamagedproductofDNAwasobtainedandtherateconstantofreactionweremeasured.Themolecularmechanismofthereactionwasalsodiscussed.

Thispaperisdividedintosixchapters:

Chapter1:

Introduction.ThestructureandnatureofSAandMeSAareintroducedindetails.ThecomprehensivereviewonSAandMeSAapplicationsinagriculture,foodandmedicineandresearchprogressofthebiologicalactivitiesofSAandMeSAisalsoinvolvedinthischapter,basedonwhichtheassumptionofthispaperisputforward.

Chapter2:

TheperformanceofSAandMeSAinclearing·

O2-inwaterorO/Wmicroemulsionsystemandthemainaffectingfactorsareassessedbypyrogallolautoxidationmethod.TheresultshowedthatbothSAandMeSAhaveagoodclearanceabilitytowards·

O2-.Inoptimalconditions（waterbathfor20min,25℃,pH8.20）,theclearanceof1.60mmol/LSAandMeSAinaqueoussolutionto·

O2-are27.49%and37.74%,and42.20%,78.90%inO/Wmicroemulsionsystem.

Chapter3:

TheinhibitoryeffectofSAandMeSAon1O2inwaterorO/Wmicroemulsionsystemisassessedthroughmicrobiologicalmethod.Theresultsshowedthat:

SAandMeSAhadafavorableinhibitionabilityto1O2,Especiallyin8mmol/LMeSAaqueoussolution,thehighestclearanceratecouldreach94.37%,whichisbetterthanVc（88.69%）withthesameconcentration.

Chapter4:

TheBlockingeffectanditsmainaffectingfactorsforSAandMeSAonnitrosaminesinwaterandO/Wmicro-emulsionsystemareinvestigatedusingUVmethod.Theresultsshowthatunderoptimalreactionconditions,1.28mmol/LSAand1.28mmol/LMeSAinO/Wmicroemulsionsolutionhaveahighnitrosamine-blockingrateupto72.27%and73.34%，respectively,comparedwiththatinaqueoussystem.

Chapter5:

WeinvestigatedtheinteractionsbetweenDNAandSAorMeSAinwaterandO/Wmicroemulsionsysteminducedbystronglightandelectronbeamwithagarosegelelectrophoresisandpulseradiolysisrespectively.TheantagonisticandsynergisticeffectofSAandMeSAonDNAdamageduetoUVradiationandthecorrespondingconcentrationsaredeterminedbygelelectrophoresisintwodifferentsystems.Comparedwiththatinaqueoussolution,0.1～0.8mmol/LSA,MeSAandVcinmicroemulsionsystemhavenotshownsynergisticbutsignificantantagonisticeffecttoDNAdamagecausedbyUVradiation.Thefindingsobtainedfrompulseradiolysisconfirmedthat0.1mmol/LSA,MeSAcouldrepairthedamageproductsofDNA（DNA-OH）bytransferringelectronsquicklyandproducecorrespondingphenoxyradicals（Ph[SA]O·

）.Therateconstantsoftransientreactionare9.07×

s-1and5.23×

s-1,respectively.

Chapter6:

Conclusionsandrecommendations.Makeasummaryfortheresultsofthisstudyandproposerecommendationsforfurtherrelaedresearchinthefuture.

Keywords:

SalicylicAcid，MethylSalicylate，ReactiveOxygenSpecies，Nitrosamine，CalfThymusDNA，microemulsion，pulseradiolysis

目录

第一章引言1

1.1SA、MeSA的结构与性质1

1.2SA和MeSA的应用及其生物活性研究进展2

1.2.1SA、MeSA在农业、果品、蔬菜保鲜等领域的应用2

1.2.2SA、MeSA在医学上的应用6

1.2.3SA、MeSA的生物活性机理研究进展7

1.3本论文的设想8

第二章水溶液和微乳液体系中SA、MeSA清除·

O2-性能的研究10

2.1材料与方法10

2.1.1材料与试剂10

2.1.2实验仪器10

2.1.3实验方法11

2.3结果与分析12

2.3.1水溶液体系中SA、MeSA清除·

O2-的测定12

2.3.2O/W微乳液体系中SA、MeSA清除·

O2-的测定16

2.3结果与讨论21

第三章水溶液体系和O/W微乳液体系中SA、MeSA对单1O2的抑制作用研究23

3.1材料与方法23

3.1.1材料与试剂23

3.1.2实验仪器23

3.1.3实验方法24

3.2结果与分析24

3.2.1水溶液体系中SA、MeSA对1O2的抑制作用24

3.2.2O/W微乳液体系中SA、MeSA对1O2的抑制作用25

3.3结果与讨论25

第四章SA、MeSA以及SA微乳、MeSA微乳对亚硝胺合成阻断作用研究27

4.1材料与方法27

4.1.1材料与试剂27

4.1.2实验仪器27

4.1.3实验原理与方法28

4.2　结果与分析28

4.2.1水溶液体系中SA、MeSA对亚硝胺合成阻断作用研究28

4.2.2SA、MeSA微乳对亚硝胺合成阻断作用研究33

4.3结果与讨论36

第五章UV引发SA、MeSA与DNA相互作用的凝胶电泳及脉冲辐解38

5.1材料与方法38

5.1.1材料与试剂38

5.1.2实验仪器38

5.1.3实验方法39

5.2结果与分析39

5.2.1水溶液体系中SA、MeSA对DNA紫外辐射损伤的凝胶电泳39

5.2.2水溶液体系中SA与DNA相互作用的脉冲辐解42

5.2.3水溶液体系中MeSA与DNA相互作用的脉冲辐解47

5.2.4SA、MeSA微乳液对DNA紫外辐射损伤的凝胶电泳51

5.3结果与讨论55

第六章结论与建议57

致谢59

参考文献60

在学期间发表的学术论文68

第一章引言

1.1SA、MeSA的结构与性质

我国地域辽阔，拥有极其丰富的生物资源，在动、植物和微生物资源中，蕴藏着对人类具有重要作用的天然有机化合物，为人类利用自然资源创造了得天独厚的条件。

从植物中提取出来的不少天然有机物具有一定的生物活性，为生物化学工业、医学化学工业提供了原料[1]。

挖掘开发具有生物活性的天然产物是多年来的研究热点。

水杨酸（SA，邻羟基苯甲酸），分子式为：

C7H6O3，结构式：

SA纯品为白色结晶性粉末，溶于乙醇、乙醚、丙酮、松节油等有机溶剂。

存在于自然界的柳树皮、白珠树叶及甜桦树中，是植物体内自身合成的一种类似植物激素的简单酚类化合物[2,3]。

SA是香料、食品、染料、医药和农药等工业的重要中间体[3-7]，主要应用于香料、紫外线吸收剂、医药、农药、染料等工业。

药用级SA本身就是一种外用药品，制成SA软膏，可用于皮肤病的冶疗，对于杀灭真菌、霉菌有良好疗效。

我国国标GB7916-1987规定化妆品中SA的最高允许用量质量分数为0.5%（以酸计）[8]。

大部分水果，尤其是浆果和干果，都含有SA。

平均每100gm（实质等同性）蔬菜中含有0～6mgSA，某些草药和香料的SA含量也很高。

人体吸收的SA量大约为每天10～200mg[9]。

SA与醇类反应，可制得一系列酯类香精，如与甲醇反应制得水杨酸甲酯（MeSA，邻羟基苯甲酸甲酯），分子式：

C8H8O3，结构式：

MeSA为无色或淡黄色液体，有特征性芳香气味，易溶于乙醇、乙醚、冰醋酸等有机溶剂，微溶于水[10]。

是一类重要的酯类化合物，天然存在于冬青叶中，是很多植物的有效成分。

近些年来，MeSA的生物功能不断被发现，如在医学领域MeSA有消炎镇痛作用，局部用于关节或肌肉疼痛，常做搽剂治疗风湿痛之用[11-14]。

此外，MeSA还可作为化妆品、牙膏、食品等的香料；

还用作溶剂和中间体制造涂料、油墨、杀虫剂、杀菌剂、上光剂及纤维助染剂等[7]。

全世界大概每年使用10～100吨的MeSA[15]。

尤其在农业上，SA、MeSA已被证实可以强化植物的抗逆性，被作为植物应对胁迫反应的一种信号分子[16]。

随着SA、MeSA在许多领域的广泛应用，SA、MeSA的需求量将大大增加。

1.2SA和MeSA的应用及其生物活性研究进展

1.2.1SA、MeSA在农业、果品、蔬菜保鲜等领域的应用

1.2.1.1SA、MeSA在农业上的应用

SA、MeSA是一种经济安全的植物生长调节剂，在果蔬和农作物中的应用具有用量少、处理成本低、使用安全方便等优点。

SA、MeSA通过调节植物体内的生理生化反应来发挥作用，不会造成环境污染，对人、畜安全，可在植物生长的各个时期施用，适应绿色无公害农业发展的要求[17]。

20世纪60年代以来，人们逐渐认识了SA和MeSA一些生理功能。

例如，外源SA能改变光周期诱导植物开花、影响植物产热、性别调控和抑制乙烯的生物合成，参与植物离子吸收、气孔开闭、种子萌发、果实产量等[18-21]。

SA和MeSA被认为是一类新型植物激素[18]，20世纪90年代以来的生物化学研究表明，SA和MeSA是植物体内重要的内源信号物质，在植物诱导抗病性以及系统获得抗病性过程中起到信号转导作用[22]。

SA和MeSA等信号物质能诱导脂类过氧化产物的积累，可以诱导植物抗病相关防御基因的表达以及相应防御物质的产生[23,24]，也可能在植物防御虫害、植株间传递伤害信息方面起传递信号的作用[25]。

已有相关研究报道SA、MeSA能诱导植物产生抗热性、耐寒性、抗氧化和抗旱性、抗盐性、抗病性以及重金属的胁迫。

1.2.1.1.1抗热性、耐寒性

高温胁迫能够在植物体内产生过氧化物和超氧化物造成氧化胁迫[26]，对植物细胞产生破坏作用。

郁松林将“京秀”葡萄幼苗分别用40℃高温和150μmol/LSA不同时间处理，发现在高温胁迫和外源SA处理在叶片和果肉细胞中游离态和结合态SA含量均明显上升，游离态水杨酸的变化与52kDMAPK类和42kDCDPK类的蛋白激酶活性变化有高度的一致性。

证明了SA的确是高温胁迫应激响应中的信号分子[27]。

陈秋明等研究发现高温胁迫下，活性氧迅速产生并攻击生物分子，造成膜脂过氧化，DNA突变，蛋白质变性等。

此时，植物体内抗氧化系统起着维持活性氧代谢平衡的重要作用。

超氧化物歧化酶（SOD）是抗氧化系统的第一道防线，能将·

O2-歧化为O2和H2O2，减轻·

O2-对细胞的伤害。

外源SA提高了高温胁迫下百合植株中的SOD活性，从而将过量生成的·

O2-迅速分解为O2和H2O2[28]。

Dat等报道外施SA后，烟草中过氧化氢酶（CAT）活性减少的同时，细胞内的H2O2水平上升，能提高植物抗热能力[29]。

SA还可显著提高豌豆、高羊茅、马铃薯、芥菜及黄瓜幼苗的耐热性[30-32]，经SA预处理可以有效提高葡萄在高温下的抗氧化能力[33]。

有研究证明，外源SA可缓解低温胁迫对黄瓜幼苗生长所产生的抑制作用[34]。

肖崇德通过实验发现，在冷害胁迫时，用10～1000μmol/L的SA喷施暧季型草坪草，能够提高草叶抗氧