双水相萃取技术的应用研究进展Word格式.docx
《双水相萃取技术的应用研究进展Word格式.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《双水相萃取技术的应用研究进展Word格式.docx（9页珍藏版）》请在冰点文库上搜索。
双水相萃取技术（Aqueoustwo-phaseextraction,ATPE）是指把两种聚合物或一种聚合物与一种盐的水溶液混合在一起,由于聚合物与聚合物之间或聚合物与盐之间的不相溶性形成两相[1],是近年来引人注目,极有前途的新型分离技术[。
ATPE技术始于20世纪60年代,从1956年瑞典伦德大学Albertsson[4]发现双水相体系到1979年德国国家生物工程研究中心（GBF）的Kula[5]等人将双水相萃取分离技术应用于生物产品分离,虽然只有二、三十年的历史,但由于其条件温和、容易放大、可连续操作等特点,目前,已成功的应用于蛋白质、核酸和病毒等生物产品的分离和纯化,以及生物转化及生物分析中[6]。
2.2 双水相萃取的原理
（1）分配系数
双水相萃取与一般的水-有机物萃取的原理相似,都是依据物质在两相间的选择性分配[7]。
当萃取体系的性质不同,物质进入双水相体系后,由于分子间的范德华力、疏水作用、分子间的氢键、分子与分子之间电荷的作用,目标物质在上、下相中的浓度不同,从而达到分离的目的。
溶质（包括蛋白质等大分子物质、稀有金属以及贵金属的络合物、中草药成分等）在双水相体系中服从Nernst分配定律:
K=Ct/Cb
其中:
K——分配系数;
Ct、Cb——分别代表溶质在上相、下相中的浓度。
系统固定时,分配系数K为一常数,与溶质的浓度无关。
当目标物质进入双水相体系后,在上相和下相间进行选择性分配,这种分配关系与常规的萃取分配关系相比,表现出更大或更小的分配系数。
如各种类型的细胞粒子、噬菌体的分配系数都大于100或者小于0.01,因此为物质分离提供了可能[9]。
（2）萃取率
当某一物质A的水溶液,用有机溶剂萃取时,则萃取率E应该等于:
E=有机相中被萃取物的量/两相中被萃取物的量×
100%
萃取率反应了物质被萃取的完全程度。
2.3 双水相萃取的特点
双水相萃取是一种可以利用较为简单的设备,并在温和条件下进行简单操作就可获得较高收率和纯度的新型分离技术。
与一些传统的分离方法相比,双水相萃取技术具有以下独有的特点:
（1）两相间的界面张力小,一般为10-7—10-4mN·
m-1（一般体系10-3—2×
10-2mN·
m-1）,因此两相易分散,而且它比一般的有机萃取两相体系界面张力低的多,这样有利于强化相际间的物质传递。
（2）操作条件温和,由于双水相的界面张力大大低于有机溶剂与水相之间的界面张力,整个操作过程可以在常温常压下进行,对于生物活性物质的提取来说有助于保持生物活性和强化相际传质。
（3）双水相体系中的传质和平衡速度快,回收率高,分相时间短,传质过程和平衡过程速度均很快,自然分相时间一般为5—15min,因此相对于某些分离过程来说,能耗较低,而且可以实现快速的分离。
（4）大量杂质能够与所有固体物质一起去掉,与其他常用固液分离方法相比,双水相分配技术可省去1—2个分离步骤,使整个分离过程更经济。
（5）含水量高,一般为75%—90%,在接近生理环境的体系中进行萃取,不会引起生物活性物质失活或变性。
（6）一般不存在有机溶剂的残留问题,现已证明形成双水相的聚合物（如PEG）对人体无害,可用于食品添加剂、注射剂和制药,因此对环境污染小。
（7）聚合物的浓度、无机盐的种类和浓度,以及体系的pH值等因素都对被萃取物质在两相间的分配产生影响,因此可以采用多种手段来提高选择性和回收率。
（8）易于连续化操作,设备简单,并且可直接与后续提纯工序相连接,无需进行特殊处理。
例如可以采用高分配系数和高选择性的多级逆流分配操作。
（9）分配过程因素较多,可以采取多种手段来提高分配选择性或过程收率。
双水相萃取技术的应用
3.1 在生物工程中的应用
双水相萃取在生物工程中有着广泛的应用,可以萃取分离抗生素、酶、分离提纯蛋白质及萃取其他生物活性物质。
（1）萃取分离抗生素
朱自强等用8%的PEG2000与20%的（NH4）2SO4组成的双水相体系直接萃取青霉素G发酵液,分配系数高达58.39,浓缩倍数为3.53,回收率为93.67%,青霉素G对糖的分离因子和对杂蛋白的分离因子分别为13.36和21.9。
Su在室温以及pH=10的条件下,利用16.1%的PEG和12%的硫酸盐,0.5mol·
L-1高氯酸钠组成的双水相体系成功地从鸡蛋蛋清中分离出高纯度的溶解酵素。
（2）萃取分离酶
Babu等用18%的PEG1500与14%的磷酸盐组成的双水相从菠萝中萃取菠萝蛋白酶和多酚氧化酶,菠萝蛋白的纯化倍数为4.0,酶活性恢复达到22.8%,而多酚氧化酶的纯化倍数为2.07,酶活回收率达到90%。
Sarote等利用80%的PEG及15%的（NH4）2SO4组成的双水相体系从木瓜乳浆中萃取出高纯度的木瓜蛋白酶。
Mirjana利用PEG4000/Dex体系从Polyporussquamosus发酵液中分离果胶酶,该酶主要分配在上相,酶活回收率80.2%,纯化倍数2.45。
Duarte等采用16%的PEG6000和8%的磷酸盐组成的双水相系统从3种不同的微生物中纯化碱性木聚糖酶,净化因子为57,产量为41%。
Pan等利用PEG1500/NaH2PO4体系从Trichodermakoningii发酵液中分离纯化U-木糖苷酶,该酶主要分配在下相,下相酶活回收率96.3%,纯化倍数33。
Wu等利用PEG8000/（NH4）2SO4体系从Kluyveromycesmarxianus发酵液中分离胞外多聚半乳糖醛酸酶,该酶主要分配在上相,酶活回收率91%,纯化倍数19。
黄瑛等采用10%的PEG2000、15%的磷酸盐和1%的NaCl组成的双水相系统从洋葱假单细胞G-63发酵粗酶液中提取脂肪酶,当系统的pH为8.0时,分配系数4.36,纯化因子3.98,脂肪酶的回收率达到87.25%。
（3）分离提纯蛋白质
刘杨等以PEG/硫酸钠双水相体系,经一次萃取从钝顶螺旋藻（Spirulinaplatensis）细胞破碎液中富集分离藻蓝蛋白。
结果表明,萃取最适宜的条件为12%PEG4000,15%Na2SO4,1%KCl,藻蓝蛋白收率为91.2%,分配系数达到8.01,分离因数达到6.33。
对于螺旋藻藻蓝蛋白的富集分离,双水相萃取法与传统的盐析沉淀法相比,具有节省操作时间、简化操作过程、降低能耗和成本以及易于工艺放大等优点。
Long等描述了生物偶联技术对胶状金纳米粒子在聚乙二醇（PEG）/葡聚糖双水相系统（ATPS）中分离蛋白质的影响。
山葵过氧化物酶（HRP）通过直接吸附结合胶状Au纳米粒子。
虽然HRP很少存在于相中,但HRP/Au纳米粒子结合分离到PEG相,结合15nm胶状金的因子高达150∶1。
其他蛋白质/金纳米粒子结合在右旋糖酐相中分离大于2000∶1,而自由蛋白为5∶1。
分离程度取决于聚合物浓度,分子量,纳米粒子直径,在某些情况下取决于纳米粒子在ATPS中的浓度。
通过结合金纳米粒子大幅度提高蛋白质分离,在既不改变蛋白质的化学性质或聚合物的亲和力配体,增加聚合物浓度,也不增加盐类浓度的情况下,很大程度上归因于偶联物表面积的增加。
吸附胶体粒子从而提供一个有吸引力的路线,以增加酶和其他蛋白质在ATPS中的分离。
此外,这些结果表明在净化生物分子/纳米粒子结合中ATPS分离作为一个强有力的手段,正越来越多地应用于诊断和材料方面。
Silva等[25]研究了不同分子量的PEG和pH值在聚乙二醇（PEG）+磷酸钾+尿素+水双水相体系中的液-液平衡,描述了实验技能和分析方法,得出了25℃时PEG（1450,3350,10000）+磷酸钾（pH7和9）+尿素（质量分数为6%）+水的双水相体系的平衡数据。
每个体系测得了4条连接线。
研究了25℃时pH7和9,尿素质量分数为3%和6%的体系中溶解酵素、过氧化氢酶、U-牛乳糖的分离现象。
（4）萃取其他生物活性物质
Luechau等研究了聚乙二醇-磷酸盐双水相体系分离DNA（pDNA）,让一个高分子量（HMW）PEG1450和一个低分子量（LMW）的聚合物PEG300与磷酸氢二钾结合。
实验结果表明质粒pTX0161在PEG-磷酸盐双水相具有不同的分配系数。
在HMWPEG（PEG1450-磷酸盐体系）,pDNA只分离到下相。
在LMWPEG（PEG300-磷酸盐体系）,pDNA根据双水相体系中的相组分、体系温度和溶菌液的浓度分离到不同相。
在体积比大于1的体系中,pDNA主要分离到上相。
体积比在0.5—1时,pDNA主要分离到界面。
体系比小于0.5的体系,大部分pDNA在下相。
在4—25℃时,分离到上相的量减少,但是分离到界面的量稳步增多。
在25℃时,大于80%的pDNA分离到界面。
随着温度上升至40℃,分离到下相的量稳步增多,分离到界面的量下降。
在20℃时,pDNA分离到界面的量逐渐增多,溶菌液浓度为60%W/W时,达到80%的最高回收率。
在25℃时,大于80%的pDNA从浓度大于35%W/W的溶菌液分离到界面。
在30℃溶菌液浓度为0—20%时,pNDA由上相转到界面。
Tubio等[27]研究确定了从T-胰凝乳蛋白酶（ChTRP）中分离胰岛素（TRP）的最佳条件,并将其应用到用聚乙二醇/柠檬酸钠（PEG/NaCit）双水相体系从牛胰腺中液-液萃取胰岛素。
研究发现PEG的分子量、pH和连接线长度影响TRP和ChTRP的分离。
由分子量为3350的PEG和柠檬酸钠形成的双水相体系在pH为5.20表现为最好的分离。
NaCl的加入量达到7%（W/W）时上相/下相的体积比下降到0.1,这导致胰腺TRP在上相的回收率达到60%,是净化的3倍。
生物质量达到总体系的25%（W/W）不影响产量和净化参数。
Salabat等[28]研究了L-色氨酸、L-苯基丙氨酸、L-酪氨酸3种氨基酸298.15K时在聚乙二醇+盐+水双水相体系中的分离现象,分相盐为硫酸镁、硫酸钠、硫酸铵,并且还研究了连接线长度、盐、侧链结构对氨基酸分配系数的影响。
结果表明,增加氨基酸的疏水性和连接线的长度会使分配系数相应的增加。
另外,含有Na2SO4的体系比其他2种盐氨基酸的分配系数大。
实验数据由改进后的Virial-type模型计算,比较模型与实验数据得出具有很好的一致性。
3.2 在药物分析中的应用
双水相萃取技术作为一种新型的萃取技术已经成功地应用于药物分析中。
梁华正等[29]研究有机溶剂/磷酸氢二钾双水相体系对栀子黄废液中栀子苷的萃取条件,并将萃取后的栀子苷用于栀子蓝色素的生产。
根据分相后上下相中栀子苷的分配系数及两相体积比,选择合适的双水相体系,并改变溶剂与废液的体积比、磷酸氢二钾加入量、废液pH值以及萃取温度等参数,研究萃取栀子苷的最佳条件。
实验结果表明,乙醇/磷酸氢二钾为合适的萃取体系。
当双水相体系总量为10mL时,乙醇与栀子黄废液的体积比为6∶4,加入磷酸氢二钾1.0g,体系分相完全后栀子苷分配系数（K）为4.56,两相体积比（R）为6.38,栀子黄废液pH值及萃取温度在正常条件下对K值及R值影响不大。
放大实验表明,以乙醇/磷酸氢二钾体系萃取栀子黄废液中的栀子苷,所得栀子苷纯度可达62.12%,收率可达96.32%。
萃取后的栀子苷经U-葡萄糖苷酶水解精氨酸显色后得到栀子蓝色素,色价E1%1cm（590nm）65.92。
高云涛等[30]利用超声提取集成丙醇-硫酸铵双水相体系对苦荞麦苗中总黄酮进行提取分离,研究丙醇-硫酸铵双水相的形成和提取条件对总黄酮得率的影响。
结果表明,提取率为1.86%,提取物中总黄酮含量为19.3%,明显高于回流提取法。
提取物对脂质过氧化具有良好的抑制作用,最大抑制率为68.2%,方法操作简便、条件温和,环境友好。
李羚等利用丙醇硫-酸铵双水相体系与超声耦合对回心草中多酚进行提取分离。
通过单因素试验与正交试验得出提取回心草多酚的最佳条件为丙醇用量7mL,硫酸铵用量5.5g,超声时间30min,多酚得率为0.081%。
将该方法与有机溶剂回流提取法进行了比较,结果表明两种方法提取率相当,但本法提取时间短,操作简单,条件温和。
3.3 在金属分离中的应用
传统的金属离子溶剂萃取方法存在着溶剂污染环境、对人体有害、运行成本高、工艺复杂等缺点。
近年来,利用双水相技术萃取分离金属离子达到了较高的水平。
Bulgariu等将Cd（Ⅱ）加入到碘化物在pH2.05—7.12的PEG（1500）-（NH4）2SO4双水相体系中萃取到PEG相。
红外光谱显示随着（NH4）2SO4溶液的酸度增加PEG氧化醚的质子不增加,但是PEG相中水的含量减少。
金属萃取到PEG相中改变了水分子与聚合物链的结合;
吸光度随着pH值的改变而改变。
显微镜方法表明通过具体的相互作用在PEG相中萃取金属的固着点依赖于物质的种类。
这也取决于聚合物链结构的变化。
Bulgariu等还研究了将几个实验参数作为函数在PEG（1550）-（NH4）2SO4双水相体系中萃取Zn（Ⅱ）。
PEG-盐双水相体系由2个不混溶相组成,聚合物相和盐相,这可以用来做萃取实验。
在没有恰当的萃取剂时,体系由体积相等的质量分数40%的PEG和质量分数为40%的（NH4）2SO4构成,Zn（Ⅱ）主要留在盐相。
改变盐溶液的pH值,萃取效率改变不大。
增加Cl-,观察到Zn（Ⅱ）的萃取效率提高。
在有Cl-时,Zn（Ⅱ）的萃取效率取决于盐溶液的酸度和加入体系中Cl-的浓度。
Silva等[47]在磷酸钾与高分子-聚氧化乙烯（1500g·
mol-1）和三嵌段共聚物PEO（聚氧化乙烯）-PPO（聚环氧丙烷）-PEO构成的双水相体系中研究[Fe（CN）5（NO）]2-和[Fe（CN）6]3-阴离子的分离现象。
实验使用了疏水性不同的两种共聚物,L35（50%环氧乙烷,1900g·
mol-1）和F68（80%环氧乙烷,8400g·
mol-1）。
研究了温度、连接线长度、相的疏水性函数在每个双水相体系中[Fe（CN）5（NO）]2-和[Fe（CN）6]3-阴离子的分配系数。
比较阴离子的分配系数的大小L35<
F68<
PEO。
随着温度的升高,阴离子的分配系数降低,表明分离过程是放热过程。
热力学参数由Van’tHoff方程获得,热量计的测量表明阴离子转移到上相是由于热焓的作用。
3.4 在其他方面的应用
双水相萃取除了以上的应用外,还用于萃取食用色素、分离环境污染物（如苯酚和对苯二酚）等。
Chethana等用PEG6000与（NH4）2SO4组成的双水相从甜菜根中萃取甜菜色素,70%—75%甜菜色素被萃取到上相,90%以上的糖类被萃取到下相。
许林妹等采用十二烷基聚氧乙烯醚（AEO9）双水相胶束体系进行苯酚的萃取,考察Na2SO4和NaCl对质量浓度为50g/LAEO9水溶液体系浊点的影响。
结果表明,Na2SO4对浊点下降的影响比NaCl大,当盐的浓度均为0.6mol/L,添加Na2SO4时浊点为28.5℃,而添加NaCl时为36.5℃。
研究了无机盐（Na2SO4和NaCl）、普通离子型表面活性剂（十六烷基三甲基溴化铵CTAB和十二烷基硫酸钠SDS）和Gemini型酯基季铵盐阳离子表面活性剂（Ⅱ-12-6）对苯酚萃取率E的影响。
结果表明,盐的加入会使E下降,但Na2SO4对E的影响比NaCl要小;
添加SDS使E下降,并随着n（SDS）∶n（AEO9）的增加而下降;
而添加CTAB或Ⅱ-12-6均使E明显提高,且随着n（CTAB）∶n（AEO9）、n（Ⅱ-12-6）∶n（AEO9）的增加而进一步提高;
但在同等条件下添加Ⅱ-12-6的E高于添加CTAB。
刘传芳等采用非离子型表面活性剂辛基酚聚氧乙烯醚（TritonX-114）组成的双水相系统（ATPS）萃取对苯二酚,依据胶束分相和分配,实现对苯二酚的萃取和分离。
讨论表面活性剂浓度对萃取率的影响,尝试用反萃取方法回收进入微胶束相的对苯二酚。
结果表明:
双水相微胶束对对苯二酚的萃取率取决于TritonX-114的浓度,双水相微胶束对对苯二酚的萃取率随TritonX-114浓度的增加而增大;
反萃取时溶液的pH值等因素对反萃取率的影响很大,通过调节pH值可以使反萃取率增大。
4 结论与展望
双水相萃取技术作为一种新型的分离技术,可以利用不复杂的设备、并在温和条件下进行简单的操作就可获得较高收率和有效成分,克服了常规萃取有机溶剂对生物物质的变性作用,在萃取过程中保持生物物质的活性及构象等明显的技术优势,并且取得了一些阶段性的成果,在生物工程、药物分析、金属分离等方面有着广阔的应用前景。
然而,有关双水相的应用和研究还不够,一些技术难题还有待于解决。
如:
易乳化、相分离时间长,成相聚合物的成本较高,水溶性高聚物大多数粘度较大,不易定量控制;
水溶性的高聚物难以挥发,使反萃必不可少,高聚物回收困难等等。
今后,随着对双水相体系研究的深入,以及其他双水相体系的不断开发,例如离子液体双水相体系,其形成机理,热力学模型、动力学模型以及工艺技术等方面的问题最终会被突破和解决,其应用领域将进一步拓宽,双水相萃取将会成为一种优良的分离技术。
升级会员 