一株高产蛋白酶菌株的筛选及其产酶条件广东轻工职业技术学院Word文件下载.docx
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C,initialpHof7.0androtationspeedof200rpm.Attheoptimalcondition,thehighestproteaseactivityoffermentationbrothreached376U/mL.
Keywords：
protease；
highproducing；
screening；
enzyme-producingcondition
引言
近年来，我国的水产养殖量和加工量一直居世界首位[1-2]。
但是，在捕捞和加工过程中，低值水产品往往占总产量的30%~50%[3-4]。
如果这些低值水产品得不到高值化利用，将造成大量蛋白质资源的浪费。
随着人们对低值水产品综合利用的重视，蛋白酶及其高产菌种的应用日益增加。
为了直接利用高产蛋白酶菌种对低值水产品进行开发高值化产品，本实验主要筛选蛋白酶高产菌种，以及初步研究所得菌种的产酶条件。
1材料与方法
1.1筛选材料与试剂
筛选材料：
南海海域大型鱼类的肠道组织；
酪氨酸：
分析纯，市售；
Folin试剂及其它试剂：
分析纯，市售。
1.2培养基
富集培养基：
葡萄糖40g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，Na2HPO42g/L，KH2PO41g/L，MgSO4·
7H2O0.5g/L，pH7.0。
分离平板培养基：
葡萄糖10g/L，酵母膏5g/L，脱脂奶粉10g/L，NaCl1g/L，琼脂10g/L，pH7.0。
斜面培养基：
葡萄糖10g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，琼脂10g/L，pH7.0。
种子培养基：
葡萄糖10g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，KH2PO42g/L，MgSO4·
基础发酵培养基：
葡萄糖40g/L，蛋白胨5g/L，K2HPO41.5g/L，MgSO4·
1.3富集培养与平板初筛
用组织捣碎器将鱼类肠道组织捣碎，取10g接入200mL的富集培养基中，于28°
C、200rpm的条件下培养16h。
然后，将培养液进行梯度稀释，涂布于分离平板培养基上，于28°
C培养48h，挑取具有透明圈的菌落，接入斜面培养基，培养24h，置于4°
C冰箱内保藏，备用。
1.4摇瓶发酵筛选
将平板初筛所得各菌株的斜面菌种接入种子培养基，于26°
C、150rpm的条件下培养12h。
然后，按10%的接种量将种子液接入发酵培养基，于28°
C、200rpm的条件下培养36h。
测定发酵液中的蛋白酶活力，筛选出高产菌株。
1.5高产菌株的鉴定
采用普通光学显微镜和扫描电镜对菌体形态进行观察，按《Bergy’sManualofDeterminativeforBacteriology》的方法对高产菌株的生理生化特征进行分析[5]，参考文献介绍的16SrDNA鉴定方法对高产菌株进行分子生物学鉴定[6-7]。
1.6碳源和氮源对产酶的影响
改变基础发酵培养基的碳源和氮源，分别以葡萄糖、蔗糖、乳糖和可溶性淀粉为唯一碳源，分别以蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、硫酸铵、尿素为唯一氮源，经36h摇瓶发酵，测定发酵液中的蛋白酶活力，根据结果选择最佳的碳源和氮源。
1.7环境条件对产酶的影响
采用最佳的碳源和氮源配置发酵培养基，分别在不同的温度、初始pH和摇瓶转速下进行产酶发酵，测定各种环境条件下的蛋白酶活力，确定最佳的摇瓶发酵条件。
1.8产酶曲线的分析
在最佳的摇瓶发酵条件下进行产酶发酵，每隔6h测定发酵液中蛋白酶活性，根据蛋白酶活力变化情况，确定最佳的产酶时间。
1.9蛋白酶活力的测定
采用GB/T23527-2009中的Folin法测定发酵液中的蛋白酶活力[8]。
样品测定时，调节发酵液pH至7.5，于4°
C、10000rpm下离心去除菌体，以pH7.5的磷酸盐缓冲液对上清液进行适当稀释，取1mL稀释液，加入1mL酪蛋白溶液（10.0g/L），于40°
C水浴中反应10min，再加入1mL三氯乙酸溶液（65.4g/L）终止反应，经过滤，取1mL滤液，加入5mL碳酸钠溶液（42.4g/L）和1mLFolin试剂，混匀，置于40°
C水浴中显色反应20min，于680nm波长下测定吸光值。
在样品测定前，先配制一系列标准浓度的酪氨酸溶液，取1mL标准溶液，按上述方法进行显色反应，于680nm波长下测定吸光值，以酪氨酸浓度为横坐标、吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。
根据标准曲线的回归方程，计算样品反应液中的酪氨酸生成量，从而确定样品的蛋白酶活力。
蛋白酶活力的定义为：
在pH7.5和40°
C的条件下，1min水解酪蛋白生成1µ
g酪氨酸为1个活力单位（U）。
2结果与讨论
2.1酪氨酸的标准曲线
酪氨酸的标准曲线如图1所示。
其线性回归方程为：
y=0.0109x+0.0048，相关系数R2为0.9997。
图1酪氨酸标准曲线
Fig.1Standardcureoftyrosine
2.2蛋白酶高产菌株的筛选
通过对富集培养液进行平板分离，共挑取32株在菌落周围具有透明圈的菌株。
采用摇瓶发酵方法对各菌株进行复筛，其中蛋白酶活力较高的8株菌株的发酵结果如图2所示。
从图2可看出，菌株PE11发酵液中的蛋白酶活力最高，故被选为进一步研究的菌株。
图28株菌的摇瓶发酵筛选结果
Fig.2Screenresultof8strainswithshakeflaskfermentationtest
2.3菌种PE11的鉴定
在普通显微镜下，菌种PE11的革兰氏染色阳性。
其扫描电镜（×
10,000）的摄像如图3所示，菌体呈杆状，大小约为（2.6~4.7）µ
m×
（0.5~0.6）µ
m。
通过生理生化试验，结果如表1所示。
通过形态特征和生理生化特征的分析，可初步判断菌种PE11为芽孢杆菌属。
对菌种PE11的16SrDNA进行PCR扩增，PCR产物经纯化、测序，获得1512bp的序列，经过在NCBI中对其同源性进行检索，发现菌种PE11与解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens）的许多菌种的同源性达99%。
其中，菌种PE11与BacillusamyloliquefaciensV3（登录号:
KJ123715.1）的亲缘关系最近。
采用Neighbor-joining法构建系统发育树，菌种PE11的系统发育树如图4所示。
经过16SrDNA分子生物学的分析，菌种PE11被进一步鉴定为解淀粉芽孢杆菌。
图3菌种PE11的扫描电镜照片（×
10,000）
Fig.3SEMphotographsofcellmorphologyofstrainPE11（×
表1生理生化试验结果
Table1PhysiologicalandbiochemicalcharacteristicsofstrainPE11
试验项目
反应结果
芽孢染色
氧化酶
接触酶
淀粉水解
明胶液化
酪素水解
甲基红试验
V-P试验
形成吲哚
葡萄糖发酵
柠檬酸利用
硝酸盐还原
+
-
注：
“+”表示阳性，“-”表示阴性。
图4菌种PE11的系统发育树
Fig.4ThesequencephylogeneticanalysisofstrainPE11
2.4碳源和氮源对产蛋白酶的影响
分别以不同碳源和氮源配制培养基，发酵结果如图5所示。
对于不同碳源，有利于产蛋白酶的顺序为：
可溶性淀粉＞乳糖＞蔗糖＞葡萄糖（见图5A）。
张竹慧等研究角蛋白酶产生菌的产酶特性时，同样发现淀粉优于葡萄糖[9]。
对于能够利用淀粉等慢速碳源的菌种，慢速碳源的代谢可能更加有利于酶的合成。
从图5B可以看出，有机氮源对蛋白酶产生的促进作用强于无机氮源，这可能与有机氮源含有诱导作用的肽链有关。
在所用的氮源中，牛肉膏和蛋白胨的促进作用较为明显，其中牛肉膏的促进效果最佳。
实验结果与文献中一株枯草芽孢杆菌产蛋白酶的氮源筛选结果相似[10]。
图5碳源和氮源对产蛋白酶的影响 （A：
碳源；
B：
氮源）
Fig.5Effectofdifferentcarbonresourceandnitrogenresourceonyieldofprotease
（A:
carbonresource;
B:
nitrogenresource）
2.5环境条件对产蛋白酶的影响
以可溶性淀粉和牛肉膏配制培养基，分别在不同的温度、初始pH和摇瓶转速下进行发酵，产蛋白酶结果如图6所示。
温度对菌种PE11的产蛋白酶有明显的影响（见图6A），在30°
C下发酵的蛋白酶活力最高。
从图6B中可看出，初始pH过高或过低均不利于产酶，在pH为7.0~7.5范围内的产酶效果较好，其中在初始pH为7.0下发酵的蛋白酶活力最高。
从文献报道来看，合成蛋白酶的发酵是好氧发酵[11-12]，因而摇瓶转速可间接影响蛋白酶的合成。
从图6C中可看出，在摇瓶转速50~200rpm的范围内，过低的摇瓶转速不能满足菌种对溶氧的需求，产酶效果随转速增加而呈上升的趋势，200rpm时的蛋白酶活力达到最高。
当摇瓶转速增加至一定程度后，继续增加转速并不一定能够增大溶氧，菌体反而因激烈振荡受到一定伤害，这可能是250rpm时的蛋白酶活力略有下降的原因。
因此，摇瓶发酵的最佳环境条件可确定为：
C、初始pH7.0和转速200rpm。
图6环境条件对产蛋白酶的影响
A：
温度；
初始pH；
C：
转速
Fig.6Effectoffermentationconditionsonyieldofprotease
A:
temperature;
initialpH;
C:
rotationspeed
2.6最佳条件下的产酶曲线
在最佳发酵条件下，菌种PE11的产蛋白酶时间曲线如图7所示。
从图7可看出，当发酵时间为36h，发酵液中蛋白酶活力达到最高，此时的蛋白酶活力为376U/mL。
此后，蛋白酶活力随发酵时间延长而呈下降趋势。
因此，在本实验条件下，最佳的产蛋白酶时间为36h。
经查阅我国相关文献，在蛋白酶活力的测定方法和酶的活性单位定义的相同情况下，细菌发酵液中的最高蛋白酶活力大多居于100~200U/mL之间[13-14]，少数居于300~400U/mL之间[15]。
现对于上述文献的报道，菌种PE11具有较强的蛋白酶产生能力。
图7菌株PE11的产酶时间曲线
Fig.7Timecourseofprotease-producingofstrainPE11
3结论
以南海海域大型鱼类的肠道组织为筛选材料，本实验筛选获得一株蛋白酶高产菌种PE11。
通过菌体形态观察、生理生化实验和16SrDNA鉴定，菌株PE11被鉴定为解淀粉芽孢杆菌。
通过筛选菌株PE11产蛋白酶的碳源和氮源，优选可溶性淀粉和牛肉膏分别为最佳的碳源和氮源。
通过考察环境条件对菌株PE11产蛋白酶的影响，以及分析产酶时间曲线，确定了菌株PE11产蛋白酶的最佳条件为：
菌种PE1具有较强的生产应用的潜力，但仍需进一步提高其产酶量，以及研究所产蛋白酶的酶学性质。
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