核桃粉及核桃油提取工艺研究与开发教材.docx

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核桃粉及核桃油提取工艺研究与开发教材

核桃粉及核桃油提取工艺研究与开发技术项目报告

　　　　新疆新粮油脂有限责任公司

　　　　　　　　　　２０１６年７月８日

　　核桃粉及核桃油提取工艺研究与开发技术项目报告

一、立项的目的和意义

（一）我国及新疆省核桃资源丰富

核桃，落叶乔木，原产于近东地区，又称胡桃、羌桃，与扁桃、腰果、榛子并称为世界著名的“四大干果”。

既可以生食、炒食，也可以榨油、配制糕点、糖果等，不仅味美，而且营养价值很高，被誉为“万岁子”、“长寿果”，是一种药食两用植物。

核桃喜光，抗逆性强、耐寒、耐酸、耐旱、抗病能力强，适应多种土壤生长，喜水、肥，同时对水肥要求不严，落叶后至发芽前不宜剪枝，易产生伤流，核桃是被子植物。

我国是世界核桃的主要生产国，种植历史悠久，分布甚广，种植面积达到3175万亩，产量近50万吨，总面积和产量均居世界第一位。

核桃作为重要的干果油料树种，既是传统的营养保健果品，又是重要的油料能源资源。

联合国粮农组织数据库资料显示，2005年全世界核桃栽培总面积在200万公顷以上，年总产量为170万吨。

中国核桃栽培历史长达2000多年，有20多个省区种植，种植面积和总产量均居世界第一位，但由于中国人口众多，年人均核桃占有量仅有0.38公斤，人均消费量更少，核桃产业发展空间广阔种植面积约133万hm2，总产量居世界第二位（约120万吨），仅次于俄罗斯。

我国核桃主要分布于新疆，云南、陕西、山西、四川、甘肃、河北、河南地区及边远山区。

甘肃省位于我国青藏高原、黄土高原的内陆西北地区，海拔大多在1000米以上，大部分处于干旱、半干旱及半湿润地区，空气干燥，日照时间长、昼夜温差大，适合核桃生长，所以核桃资源非常丰富。

目前，新疆叶城，阿克苏　喀什，和田等地区，核桃种植面积已达150多万亩，年产量80多万吨，本项目产品有鲜明的区域性资源优势，出口贸易大为方便。

（二）核桃及其提取物有很高的营养保健功能

核桃具有很高的营养价值，其蛋白质含量高，每100克核桃中，含蛋白质为15～20克，蛋白质亦为优质蛋白，脂肪50～64克，核桃中的脂肪71%为亚油酸，12%为亚麻酸，核桃中脂肪和蛋白是大脑最好的营养物质。

糖类为10克，以及含有钙、磷、铁、胡萝卜素、核黄素（维生素B2）、维生素B6、维生素E、胡桃叶醌、磷脂、鞣质等营养物质。

八种人体必需氨基酸的种类齐全，配比合理；核桃脂肪中含有人体正常发育必需的脂肪酸和不饱和脂肪酸（亚油酸、亚麻酸、花生烯酸），其中油酸和亚油酸含量很高，不饱和脂肪酸占脂肪总含量的90%；维生素、矿物元系含量丰富。

核桃油有着卓越的营养保健价值和非凡的食疗功效。

核桃油含有多种有益人体健康的无机元素钙、磷、铁、铜、锌和微量元素钾等，这也增强了核桃的营养保健功能。

《本草纲目》记载：

“食之令人肥健，润肌，黑须发。

多食利小便，去五痔……通润血脉，骨肉细腻……补气养血，润燥化痰，益命门，利三焦，温肺润肠，治虚寒喘嗽。

”唐朝《食疗本草》中已经记载了胡桃的药用。

到了明朝，李时珍更是将胡桃视为中药中的佳品。

认为它“气味甘，平、温，无毒”，具有“补气养血，润燥化痰，益命门，利三焦，温肺润肠，治虚寒喘嗽，腰脚重痛，心腹疝痛，血痢肠风，散肿毒，发痘疮，制铜毒”等多种功效。

（三）综合利用核桃资源，提高社会经济效益

我国是核桃种植大国，核桃资源丰富，目前国内核桃利用率较高，以初级加工为主，核桃深加工产业刚起步，但因核桃还有丰富的蛋白质和不饱和脂肪酸，其中的不饱和脂肪酸高达90%，加之近年来核桃的保健功能日益受到人们的重视，所以核桃深加工产业显示出极强的生命力。

在核桃加工中，核桃仁是产量最大的一种产品，因而，核桃仁有望成为一种廉价的提取原料。

利用现代生物工程技术和科学生产工艺，使核桃仁中的各种营养成分尤其是蛋白质和不饱和脂肪酸尽可能的释放出来，是这一产业的发展趋势。

因此，开发新型、天然、绿色的保健品—核桃蛋白粉、核桃油，既可充分利用资源，提高产品的附加值，又可以带动我省地区经济的发展，具有广阔的应用前景。

因此，进一步开发先进成熟的相关技术，利用核桃仁产品提取蛋白和植物油，对于延长产业链、提高增值效益、满足市场需求，都具有积极作用和现实意义。

而且经采用先进技术提取加工后的粉渣，其蛋白质等营养成分不被破坏，可做为上好蛋白粉，从而实现资源充分利用，符合科学发展观和循环经济的要求。

二、目前存在的问题及研究进展

（一）蛋白提取的研究进展

目前国内外在蛋白类化合物的提取上多采用有机溶剂萃取法、微波提取法、超声提取法、超临界流体萃取法等。

有机溶剂萃取法是根据蛋白类化合物与杂质极性不同来选择适合的有机溶剂。

主要采用碱液溶解蛋白质的方法，常用氢氧化钠进行提取。

微波萃取实际上主要是微波对萃取溶剂及样品的加热作用，它能够穿透萃取溶剂和物料使整个系统更加均匀地加热从微观上讲，微波所产生的电磁场加速样品向萃取溶剂界面的扩散速率。

超声波提取（ultrasonicextraction，UE）是近年来应用到中草药有效成分提取分离中的一种方法，其原理是利用超声波空化作用加速植物有效成分浸出，另外超声波次级效应，如机械震动乳化、扩散、击碎、化学效应等，也能加速提取成分的扩散、释放并与溶剂充分混合而利于提取。

该法具有设备简单、操作方便、提取时间短、产率高、无需加热，有利于保护热不稳定成分、省时、节能、提取率高等优点，但超声波作用的时间和强度需要一系列试验来确定，超声波发生器工作噪声比较大，需注意防护，工业应用有一定困难，而且在大规模提取时效率不高，故常作为一种强化或辅助手段。

超临界流体萃取（supercriticalfluidextraction,简称SFE或SCFE）的原理是利用超临界流体的溶解能力与其密度的关系，即利用压力和温度对超临界流体溶解能力的影响而进行的。

核桃蛋白主要有四种蛋白质构成!

它们是清蛋白’球蛋白，醇溶蛋白和谷蛋白,分别占核桃蛋白总量的6.81%、17.57%、5.33%、70.11%。

由此，可以分别采用氯化钠溶液提取清蛋白和球蛋白,采用乙醇溶液提取醇溶蛋白，以及采用氢氧化钠溶液提取谷蛋白，提取液在25摄氏度下经磁力搅拌器搅拌，浆液在78-82摄氏度，打浆2-3次为宜，蛋白质溶出率90%。

以碱溶酸沉为基础,对核桃蛋白的提取工艺条件进行了优化。

在确定等电点的基础上,分析了辅助浸提方式、pH值、温度、时间、固液比对核桃蛋白提取率的影响。

研究表明,核桃蛋白质等电点为4.6;在超声波处理条件下,固液比1:

90,温度55℃,碱溶pH值7.5,时间70min为提取条件,其核桃蛋白提取率达55.83%。

以提油后的核桃粕为原料,采用单因素试验和正交试验的方法,对核桃粕中蛋白质提取工艺进行研究,得到最佳提取条件:

pH8.5,料液比1∶30,在50℃下超声波提取60min,然后在pH4.5条件进行酸沉淀。

在此条件下,核桃蛋白质的提取率可达到85%左右。

我们对这三种方法进行对比，选择了最为适宜的方法即单因素实验和正交试验的方法进行提取蛋白。

核桃蛋白的测定常采用凯式定蛋法和光谱分析法。

我国核桃及其制品中总蛋白含量的测定（GB/T5009.52003）就是采用光谱分析法。

上述这些核桃中化合物提取、纯化的方法都有其各自的缺点和不足，如有机溶剂萃取法易使提取物中含有杂质，此法提取率不高还容易造成有机溶剂的残留；超声波萃取大规模提取时效率不高，不适合工业化生产，仅仅可以作为一种强化或辅助手段；超临界流体萃取存在生产成本过高等问题。

（二）核桃油的提取的研究进展

目前国内外核桃油的萃取主要采用水蒸气蒸馏法、压榨法、溶剂萃取法等，这些方法都有自己的不足之处，蒸气蒸馏法存在的弊端在于蒸馏过程中水及高温会破坏植物油中较为脆弱的部分；压榨法萃取的核桃油包含蜡等非挥发性物质，相对使得压榨核桃油的保存期限较短；溶剂萃取法所得核桃油含有树脂、油脂、等。

（三）亚临界流体萃取技术的特点

（1）HFC-134a（四氟乙烷）亚临界流体无色、无毒、无味，不燃烧爆炸；由于碳氢氟键的键能非常高，因而具有较好的热稳定性和化学稳定性，当其处在高于沸点，但低于临界温度和临界压力状态时，具有较低的粘度和较高的扩散系数，因而传质速度快，溶解能力强，同时，该物质的沸点较低，在减压条件下可以充分气化，非常有利于溶剂的回收，而且避免了萃取分离全过程高温作业（不高于45℃），非常适合于“热敏性”有效成分的提取、分离。

（2）萃取流程均处在比较安全的中、低压状态下完成，设备的有效容积受工艺的制约小，系统的安全性能指标相对提高，同时，大幅度降低了装置制造过程的工艺难度和工程造价。

（3）在亚临界流体萃取方法中特别设计夹带剂系统，在萃取前或萃取过程当中利用乙醇作为夹带剂改变溶剂的极性，使得溶媒与夹带剂发挥协同作用，提高萃取效率。

（4）与传统溶剂萃取工艺相比，在同等提取率指标下，可缩短提取时间1倍左右（因产品而异），溶媒存在于闭路系统而使其损耗和排放污染均显著低于溶剂萃取，由于避免了传统溶剂依靠较高温度试现脱除和回收的高耗能工序，因而综合能耗可降低40%左右，而且保证了制品的生物活性。

绝大多数有机溶剂易燃易爆，而“HFC-134a”却无此危险。

此外，“HFC-134a”亚临界萃余物不受溶剂污染，原有的水溶性成分以及蛋白等物质不变性，仍可用做饲料或继续提取剩余的极性成分。

（5）与国内现有的亚临界丙丁烷萃取相比，突出优势在于更高的安全性。

（6）“HFC”的毒性AEL（8和12小时TWA）可允许的空气暴露浓度为1000PPm（v/v），并且该密实气体作为气雾携带剂已在医药行业得到大量应用，说明用该溶剂萃取的中间体无医用、食用安全性障碍。

（四）核桃产品的开发现状

目前核桃产品以初加工产品为主，占核桃制品的95%，主要有核桃蛋白粉、核桃油、核桃乳等几个品种，这些产品品种单一，适口性差，远不能满足人们对于营养、快捷、方便和药用保健产品的消费需求，市场上很难找到，我省核桃产品因市场推广、消费引导不力也未能建成外地销售市场，甘肃本地产品市场份额已下降至20%左右，迫切需要新的开发思路。

三、课题研究内容

（一）研究方法及主要技术路线

针对国内外市场状况，特别是把握今后核桃制品精细加工技术和新主流品种的趋势，结合原材料的物料学特性，应用食品工艺、亚临界及超声波提取技术、干燥、质量管理等先进的理论和技术，进行项目的研究和转化应用。

项目的技术路线是：

产品定位→工艺流程设计→解决关键技术→确定工艺参数→小试→中试→检测→生产应用。

（二）主要研究内容

本项目通过合理的设计研究解决核桃去皮及蛋白提取存在的问题，通过试验选择合理的工艺流程、工艺参数为提取核桃蛋白及核桃油提供依据，本研究的主要内容有：

（1）比较不同产地、核桃去皮效果。

（2）研究确定亚临界提取核桃油的工艺及参数。

（3）溶剂提取法对核桃中蛋白的提取效果，确定其工艺流程、主要影响因素和工艺参数。

（4）研究超声波增强-溶剂提取对核桃中蛋白的提取效果，确定其工艺流程、主要影响因素和工艺参数。

（5）研究亚临界对核桃中蛋白的提取效果，确定其工艺流程、主要影响因素和工艺参数。

（6）研究超声波-亚临界-乙醇夹带符合技术对核桃中蛋白的提取效果。

（7）提取物除杂纯化。

（8）蛋白粉、核桃油精炼化。

（9）通过对制品的感官、理化及微生物指标的评价选出工艺简单合理，成本低廉的提取核桃蛋白、核桃油的生产工艺。

四、研究材料与方法

1、材料与设备

材料

核桃、氢氧化钠、盐酸、无水乙醚、石油醚、硫酸铜、硫酸钾、磷酸氢二钠、柠檬酸、无水亚硫酸钠，均为分析纯。

1.1.2设备

HH—2型数显电子恒温水浴锅；格兰仕牌WD800G型微波炉；AS10200AT型超声波仪；Sigma3k15型离心机；DZF—6090型真空干燥箱；DHG—9140A型数显电热鼓风干燥箱；BT—224S型电子天平；BuchiB—290型喷雾干燥机。

2、方法

工艺流程

石油醚

↓

核桃→去壳→核桃仁→去皮→粉碎→去油→碱溶→过滤→酸沉→离心→弃上清液→核桃蛋白→喷雾干燥→核桃蛋白。

1.2.2核桃原料预处理

将去壳后的核桃仁用0.6%NaOH碱液55℃浸泡核桃仁20min，采用高压小流量清水枪喷淋，清水浸泡，将去皮后的核桃仁置于55℃的烘箱中烘干，研碎成粉末[5]。

采用石油醚浸泡核桃粉末处理48h，期间需更换石油醚1次，并进行搅拌3~4次，保证最大限度去掉核桃油。

1.2.3酸沉剂的选择核桃仁中含有少量的酚类物质，对核桃蛋白的颜色具有一定的影响，而且这类颜色很难在脱色过程中洗脱掉。

采用磷酸盐—柠檬酸缓冲溶液为酸沉剂，核桃蛋白的颜色更佳。

1.2.4理化指标测定

（1）水分测定采用GB/T5009.3—2003，直接干燥法。

（2）脂肪含量的测定依据GB/T1477.2—2008。

（3）蛋白质含量的测定依据GB/T5009.5—2003，

凯氏定氮法。

（4）在本实验中蛋白提取率以浸出率为指标。

蛋白浸出率按照下式计算

式中：

X—浸出率，%；m1—去油处理后的核桃原料粉质量，g；m2—干物质质量，g。

1.2.5核桃蛋白提取工艺的优化

（1）核桃蛋白等电点的确定。

用酸调节核桃蛋白溶液至不同pH值：

4.0，4.2，4.4，4.6，4.8，5.0，5.2，5.4，5.6，5.8，6.0，过滤后，烘干，称质量，分析核桃蛋白的等电点。

（2）辅助浸提方式的选择。

碱液pH值9.0，温度55℃，固液比1∶30，时间60min的条件下，选取辅助浸提方式分别为：

碱提（磁力搅拌器）、水浴、超声波、水浴—微波、水浴—光波，确定较佳方式。

（3）pH值的选择。

在55℃，固液比1∶30，超声波处理60min的条件下，选取碱液pH值分别为：

7.0，7.5，8.0，8.5，9.0，9.5，进行单因素试验，确定较佳的因素水平。

（4）温度的选择。

在pH值9.0，固液比1∶30，超声波处理60min的条件下，选取温度分别为：

40，45，50，55，60，65℃，进行单因素试验，确定较佳的因素水平。

5）时间的选择。

在温度55℃，固液比1∶30，pH值9.0，超声波条件下，选取处理时间分别为：

30，40，50，60，70min，进行单因素试验，确定较佳的因素水平。

（6）固液比的选择。

在温度55℃，pH值9.0，超声波处理60min的条件下，选取固液比分别为：

1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，1∶60，1∶70，1∶80，1∶90，1∶100，1∶110，1∶120，进行单因素试验，确定较佳的因素水平。

（7）核桃蛋白提取正交试验。

为了优化核桃蛋白的提取工艺，得到较高的提取率，以浸出蛋白质为指标，依据单因素试验选取碱液pH值、温度、时间、固液比进行4因素3水平L（34）正交试验。

通过正交验，分析核桃蛋白提取过程中各因素对核桃蛋白提取率的影响，并确定最佳核桃蛋白质提取参数。

正交试验因素与水平设计见表1。

（8）核桃蛋白喷雾干燥[6]。

根据设备情况，对核桃蛋白喷雾干燥选取料液的质量分数为10%，进风温度为165℃，出风温度为50℃，进料温度35℃，抽风量19m3/h，进料流量11mL/min。

3、结果与分析

2.1等点电的测定

等电点pH值对提取率的影响见图1

由图1可知，在pH值为4.6~5.0，核桃蛋白的提取率的波动范围不大，其中，pH值为4.6时，核桃蛋白的提取率最高。

由此可以判断，核桃蛋白等电点为4.6。

以下试验中，酸沉pH值均选择4.6。

2.2辅助浸提方式的选择辅助提取方式对核桃蛋白提取率的影响见表2。

由表2可知，采用超声波进行辅助提取时，核桃蛋白的提取率最高，可以达到48.85%，其他提取方式都较小。

故选取超声波作为核桃蛋白的辅助提取方式，在以下试验中，均以超声波为核桃蛋白的辅助浸提方式。

2.3pH值对提取率的影响

碱液pH值对提取率的影响见图2。

从图2可知，pH值为7.5时，核桃蛋白的提取率最高，达到48.9%。

pH值为7.0和9.0时的提取率次之。

在实验中发现，pH值的变化会影响所提取核桃蛋白成品的颜色，而且随着PH值的增大，颜色也越来深。

在pH值为9.0时，形成了一些酚醛类物质，使成品颜色呈现紫褐色，但在pH值7.0~8.0范围内，颜色较浅，故综合考虑，选取7.0，7.5，8.0为pH值的3个水平。

2.4温度对提取率的影响：

温度对提取率的影响见图3

从图3可知，随着温度的增加，核桃蛋白质的提取率逐渐增加，超过55℃之后，提取率开始呈下降趋势。

这主要是由于温度升高，蛋白质的变性引起的。

温度为55℃时，核桃蛋白的提取率最高；50℃和60℃时的提取率次之。

故选取50，55，60℃为温度的3个水平。

2.5、时间对提取率的影响：

时间对提取率的影响见图4

从图4可知，随着浸提时间的增加，核桃蛋白提取率也提高，当时间为70min时，略有下降，这可能是提取时间增加后，少量蛋白质被分解的原因。

因此，选取50，60，70min

为时间的3个时间水平段。

2.6、固液比对提去率的影响：

固液比对提去率的影响见图5

从图5可知，随着固液比的增加，核桃蛋白质的提取率逐渐增加，在（1∶90）~（1∶100）时，核桃蛋白的增加有一个明显的提高。

故选择1∶90，1∶100，1∶110为固液比的3个水平。

2.7、核桃蛋白提取的正交实验

正交实验结果见表3

由表3可知，各因素的水平对试验结果影响的主次顺序为：

D（固液比），B（温度），A（pH值），C（时间）。

其最优方案为A2B2C3D1，即碱液pH值为7.5，浸提温度为55℃，提取时间为70min，固液比为1∶90。

2.8喷雾干燥蛋白质粉末理化性质见表4。

由表4可知，喷雾干燥出的核桃蛋白脂肪含量较高，这主要是由于实验过程中去油不彻底引起的。

同时也说明核桃蛋白质具有很好的吸油性。

在实际生产过程中，核桃残渣中只含有少量的油脂，因此采用此法生产核桃蛋白质时，其油脂不会如此高，蛋白质的含量会大大提高。

4、核桃蛋白粉、核桃油的纯化精制

分析提取物中杂质的成分，有针对性的选择精制纯化条件，采用溶剂提取、板框过滤、脱酸、脱色等工艺，对所得蛋白粗品、油脂提取物进行纯化，以获得高纯度核桃蛋白和核桃油。

5、结论

采用碱溶酸沉方法提取核桃蛋白质，其等电点为4.6，辅助浸提方式为超声波；提取优化参数为：

pH值7.5，温度55℃，固液比1∶90，时间60min，在此条件下，得到的蛋白提取率可达55.83%。

采用喷雾干燥制取干燥后的成品干粉，其颗粒度较均匀细致，不会出现黏壁现象。

6.测定项目和方法

（1）核桃中蛋白含量测定

粉状、固液体试样：

称取0.5～5g试样（使试样中含氮30～40mg），精确至0.001g，放入凯氏烧瓶中（避免粘附在瓶壁上）。

1．1．2液体试样：

取10～20±0.05mL试样（使试样中含氮30～40mg），移入凯氏烧瓶中，蒸发至近干。

1．2消化向凯氏烧瓶中依次加入硫酸铜（4.1）0.4g、硫酸钾（4.2）10g、硫酸（4.3）20mL及数粒玻璃珠。

将凯氏烧瓶斜放（45°）在电炉上，缓慢加热。

待起泡停止，内容物均匀后，升高温度，保持液面微沸。

当溶液呈蓝绿色透明时，继续加热0.5～1h。

取下凯氏烧瓶冷却至约40℃，缓慢加入适量水，摇匀。

冷却至室温。

1．3蒸馏采用下列方法之一蒸馏。

1．3．1常量蒸馏向接收瓶内加入50mL4%硼酸溶液（4.5）及4滴甲基红-次甲基蓝混合指示液（4.8）。

将接收瓶置于蒸馏装置的冷凝管下口，使冷凝管下口浸入硼酸溶液中。

将盛有消化液的凯氏烧瓶连接在氮素球下，塑料管下端浸入消化液中。

沿漏斗向凯氏烧瓶中缓慢加入70mL40%氢氧化钠溶液（4.4）（使漏斗底部始终留有少量碱液，封口）。

加碱后烧瓶内的液体应为碱性（黑褐色）。

通入蒸汽，蒸馏20min（始终保持液面沸腾）。

至少收集80mL蒸馏液。

降低接收瓶的位置，使冷凝管口离开液面，继续蒸馏3min。

用少量水冲洗冷凝管管口，洗液并入接收瓶内，取下接收瓶。

1．3．2微量蒸馏将消化好并冷却至室温的消化溶液（7.2）全部转移到100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，摇匀。

向接收瓶内加入10mL4%硼酸溶液（4.5）和1滴混合指示剂（4.8）。

将接收瓶置于蒸馏装置的冷凝管下口，使下口浸入硼酸溶液中。

取10±0.05mL稀释定容后的试液，沿小玻璃杯移入反应室，并用少量蒸馏水冲洗小玻璃杯，一并移入反应室。

塞紧棒状玻璃塞，向小玻璃杯内加入约10mL40%氢氧化钠溶液（4.4）。

提起玻璃塞，使氢氧化钠溶液缓慢流入反应室，立即塞紧玻璃塞，并在小玻璃杯中加水，使之密封。

通入蒸汽，蒸馏5min。

降低接收瓶的位置，使冷凝管管口离开液面，继续蒸馏1min。

用少量蒸馏水冲洗冷凝管管口，洗液并入接收瓶内。

取下接收瓶。

7．4滴定用0.1mol/L盐酸标准滴定溶液滴定收集液至刚刚出现紫红色为终点。

同一试样做两次平行试验，同时做空白试验。

分析结果的表述

常量蒸馏按式

（1）计算：

常量蒸馏按式

（1）计算：

X（%）=[（V-V0）*0.014*C]*F*100/M

微量蒸馏按式

（2）计算：

X（%）=[（V-V0）*0.014*C]*F*100/M*10%

式中：

X——食品中蛋白质含量（质量百分率），%（m/m）或%（m/V）；

V——滴定试样时消耗0.1mol/L盐酸标准滴定溶液的体积，mL；

V0——空白试验时消耗0.1mol/L盐酸标准滴定溶液的体积，Ml;

C——盐酸标准滴定溶液的摩尔浓度，mol/L；

0.014——1mL1mol/L盐酸标准滴定溶液相当于氮的质量，g；

M——试样的质量，g；

F——氮换算为蛋白质的系数。

标准曲线的绘制：

用移液管分别吸取芦丁标准溶液0.25ml、0.50ml、1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml置于10ml容量瓶中，加入三氯化铝溶液2ml、乙酸钾溶液3ml，用甲醇溶液定容至刻度，摇匀，室温下放置30min。

同时做空白。

标准曲线中芦丁含量分别为0.00125mg/ml、0.00250mg/ml、0.00500mg./ml、0.0100mg/ml、0.0150mg/ml、0.0200mg/ml。

在波长420nm处测定吸光度。

以吸光度值为横坐标，浓度值为纵坐标，绘制标准曲线。

试料溶液的制备及测定：

称取试样0.2-1.0g，精确至0.0001g，置于150mL具塞三角瓶中，加入甲醇溶液30mL，盖紧瓶塞，将三角瓶置于将三角瓶置于（65±2）℃的恒温水浴振荡器中在（160±10）r/min的振荡频率下振摇2h，趁热过滤，滤液置于50mL容量瓶中，用甲醇溶液清洗滤纸和残渣，合并滤液，冷却至室温，加甲醇溶液至刻度，为试料待测液。

准确吸取1.0ml试料待测液置于10ml容量瓶中，分别加入三氯化铝溶液2ml、乙酸钾溶液3ml，用70%甲醇溶液定容至刻度，摇匀，室温下放置30min。

于波长420nm处测定吸光度值，将其带入标准曲线方程计算出总黄酮的