细胞总蛋白提取考马斯亮蓝测蛋白含量.docx
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细胞总蛋白提取考马斯亮蓝测蛋白含量
蛋白样品的取得要紧包括破碎法、沉淀法、蛋白溶解等，能够依如实验目前选择最适合的方式，本文要紧总结了蛋白抽提的仪器和材料的预备，试剂溶液的配制和具体的操作步骤。
蛋白提取方式
1材料和方式
1.1材料
1.1.1组织和细胞的来源：
1.1.2
机械组织匀浆器
低温高速（>40,000g）
超速离心机
超生细胞破碎仪
超纯水装置
1.1.3试剂
三氯醋酸（TCA）
丙酮
二硫苏糖醇（DTT）
尿素
CHAPS
PMSF
乙醇
磷酸
考马斯亮蓝R350
抑肽素A
亮肽素
试剂纯度均应是分析纯或以上。
1.1.4溶液配制
（1）：
NaCl8g,KCl0.2g,Na2HPO41.44g,KH2PO4，溶于800ml水中，用HCl调pH至7.4，用纯水定容至1L;
（2）EDTA贮存液：
18.61gNa2EDTA•2H2O，溶于70ml纯水中，用10mol/LNaOH调剂pH值至8.0（约需2gNaOH颗粒），定容为100ml。
可高压灭菌后分装备用;
（3）亮肽素贮存液（50μg/ml，100×）
10mg/ml溶于水，-75℃保留;利历时配成50μg/ml储液，-20℃保留;
（4）抑肽素贮存液（70μg/ml，100×）
1mg/ml溶于甲醇，-75℃保留;利历时配成70μg/ml储液，-20℃保留;
（5）PMSF贮存液（10mM,100×）:
17.4mgPMSF，溶于1ml异丙醇中，-20℃保留。
DTT贮存液（1M）:
0.31gDTT溶于2mlH2O中，-20℃保留（DTT或含有DTT的溶液不能进行高压处置，可过滤除菌）。
（7）裂解液:
LysisbufferA
（9Murea,4%w/vCHAPS,1%w/vDTT,0.5%CAandacocktailofproteaseinhibitors）
LysisbufferB
（7Murea,2Mthiourea,4%w/vCHAPS,1%w/vDTT,0.5%CAandacocktailofproteaseinhibitors）
LysisbufferC
40mMTris-base（pH9.5）inultrapureH2O
LysisbufferD
（8Murea,4%CHAPS,40mMTris（base）,40ml）
LysisbufferE
（5Murea,2Mthiourea,2%SB3-10,2%CHAPS,1%w/vDTT,0.5%CAandacocktailofproteaseinhibitors）
LysisbufferF
100μLSDSsamplesolution（1%w/vSDS,0.375MTris-HCl,pH8.8,50mMDTT,25%v/vglycerol）
●CA、蛋白酶抑制剂混合物和DTT在临用前加入。
蛋白酶抑制剂混合物[3]
成份终浓度
蛋白酶抑制剂混合物PMSF35μg/mlor1mM
EDTA0.3mg/ml（1mM）
抑肽素0.7μg/ml
亮肽素0.5μg/ml
1.2方式
1.1.1组织蛋白提取方式
1.2.1.1三氯醋酸/丙酮沉淀法[1]
（1）冰上取材，称湿重，置液氮中冻存或直接进行下一步;
（2）在液氮中研碎样品或利用机械匀浆器磨碎组织;
（3）将粉末悬浮于含DTT（0.2%w/v）的10%三氯醋酸（w/v）的丙酮溶液中;
（4）蛋白–20℃沉淀留宿;
（5）35000×g（6℃）离心30min;
将沉淀重悬于含0.2%DTT的预冷丙酮中;
（7）-20℃放置1h;
35000×g（6℃）离心30min;
（9）在通风橱中让丙酮充分挥发，取得干燥的沉淀;
（10）在裂解液中从头溶解沉淀（50-100mg组织需要1ml裂解液）;
（11）15℃,40000×g，离心1hr;
（12）用Bradford法[2]测定上清的蛋白浓度，分装后置–75℃保留。
1.2.1.2超速离心法
（1）取材;
（2）用研钵在液氮冷冻条件下将样品研成粉末，每1g样品加入0.5ml裂解液，利用组织匀浆器匀浆30s;
（3）组织悬液15℃，10000×g离心10min;
（4）上清液4℃，150000×g超速离心45min;
（5）警惕躲开上层漂浮的脂质层，吸取离心上清6℃40,000g再次离心50min;
取离心上清。
Bradford法定量，分装后置–75℃保留。
1.2.2培育细胞蛋白提取
1.2.2.1循环冻融法
（1）吸出培育液弃去，0.01mol/LPBS洗一次;
（2）加入PBS，用橡胶刮搜集细胞于10ml离心管中;
（3）500×g，离心5min;
（4）弃上清，PBS洗三次（室温,500×g，5min），
（5）在离心管中加入1mlPBS，重悬细胞，用1ml微量加液器移入Eppendorf管中;
执行Biofuge存储程序8，500×g5min离心;
（7）用200μl微量加液器吸出PBS，弃去;
吸干残留的PBS，估量样品体积，加入5倍体积裂解液，巴氏滴管混匀，液氮中反复冻融三次（每次置液氮中3s，室温融化），DTT在第一次冻融后加入;
（9）执行Biofuge存储程序6，15℃，40000×g，离心1hr（Biofuge）;
（10）上清Bradford法定量，沉淀-75℃保留备用。
1.2.2.2超声破碎法
（1）取对数生长期的细胞，吸出培育液弃去，0.01mol/LPBS洗一次;
（2）加入PBS，用橡胶刮搜集细胞于10ml离心管中;
（3）室温，500×g，离心5min;
（4）弃上清，PBS洗3次（室温,500×g，5min）;
（5）在离心管中加入1mlPBS，重悬细胞，用1ml微量加液器移入Eppendorf管中，500×g离心5min;
吸干残留的PBS，估量样品体积，加入5倍体积裂解液，混匀，移入1.5mlEppendorf管中，冰浴中以最大功率超声破碎细胞（3×10s）;
（7）15℃,40000×g，离心1hr（Biofuge）;
上清Bradford法定量，沉淀-75℃保留备用。
2.结果和讨论
蛋白质提取的大体步骤包括清洗组织或细胞、裂解细胞、离心除去膜组分等取得溶解的蛋白质上清。
咱们破碎细胞采纳循环冻融法和超声波法;破碎组织采纳液氮研磨法和机械匀浆法。
循环冻融法操作简便，比较适合提取培育细胞的稳固蛋白，咱们后期实验对培育细胞要紧采取这种破碎方式。
利用超声破碎必需注意的是操纵强度在必然限度，即恰好低于溶液产生泡沫的水平。
因为产生泡沫会致使蛋白质变性，同时要注意散热。
匀浆是机体软组织破碎最经常使用的方式之一。
由于匀浆进程中蛋白质被蛋白酶降解的可能性较小，因此匀浆是简便、迅速和风险小的组织破碎方式，咱们实验室在破碎脑和脊髓组织时经常使用此法;由于神经组织比较柔软，液氮研磨法也很适合，本实验中咱们利用了这一方式破碎大鼠脊髓组织，中枢神经组织由于富含脂类，沉淀法和高速离心法能够使蛋白和脂类干扰物质有效分离，但沉淀法的缺点是再溶解时蛋白损失严峻。
高速离心的缺点是需要样品量大，如BeckmanL7-65超速离心机的离心管容量为8ml，不适用小量样品的制备。
在众多的裂解液配方中，咱们要紧采纳9M尿素,4%w/vCHAPS,1%w/vDTT,0.5%两性电解质加蛋白酶抑制剂混合物，缘故是这一配方经长期利用很稳固，裂解效率也较高，超级适合小量细胞蛋白提取要求。
针对富脂的中枢神经组织中脂类物质与蛋白彼此作用，高浓度的尿素能够造成强变性条件（但如果是再提高尿素浓度，尿素就容易析出，阻碍蛋白的溶解），过量的去污剂也能够减少脂类的污染，两性电解质能够提高蛋白的溶解度，同时有利于等待聚焦。
初期咱们加入Tris碱以避免蛋白的水解，可是由于盐离子的引入，致使IEF电压太低，阻碍聚焦。
蛋白抽提纯化进程中务必保证明验的试剂、仪器等整个实验进程中没有蛋白酶的作用，必然要抑制蛋白酶的活性，能够通过加入苯甲基磺醯化氟PMSF和AEBSF抑制苏氨酸蛋白酶和半胱氨酸、加入EDTA抑制金属，高的pH能够抑制大多说蛋白酶活性。
、
细胞总蛋白的提取及裂解液一．悬浮细胞计数107重悬于0.5mlPBS（0.01M）中，加入饱和浓度一抗（1/10）或（10ug/ml）4℃15-30min后，短暂离心4000转×3分，用PBS0.4-0.5ml重悬（室温）,加入饱和浓度二抗（1/100）或（20ug/ml）,迅速置于37℃水浴中2-5分后（迅速加入终止液0.5ml（冷pbs中含有400uMNa3VO4,5mMEDTA,10mMNaF））,离心4000转×3分，弃上清,置于冰浴中,加入裂解液0.2-0.3ml（裂解浓度108/ml？
）吸管轻轻混匀，冰点缓慢震摇孵育30分钟后加入10ul浓度为10mg/ml的PMSF贮存液，冰点孵育30分钟。
4度离心15000g20min。
上清液即为全数细胞溶解成份。
二．裂解缓冲液：
50mMTris-HClpH7.6或20mMHepespH7.4150-300mMNaCl1％（w/w）NP-40（0.5%Triton-X100）5mMEDTA（现加1ml加10ul）临用前加入蛋白酶抑制剂：
Na3VO4钒酸钠1mM（75mM—13.3ul/ml）（用0.2mol/L贮存液配制）PMSF苯甲酰氟1mM（10mg/mlPMSF用量：
10ul/ml）或10-20ug/mlSoybeanTrypsininhibitor（加10-20ul）Aprotinin抑肽酶10ug/ml（10ul/ml）（Leupeptin亮肽素10ug/ml未加）Westernblotting三．给你介绍一个裂解液：
50mMTris-HCl（PH8.0）缓冲液，含：
NaCl150mM叠氮钠0.02%SDS0.1%NP-401%PMSF100ug/ml（利用前临时加入）（10mg/mlPMSF用量：
10ul/ml）尽可能用少的裂解液裂解细胞，取上清电泳，最好用6xSDS上样buffer。
四．我的样品蛋白是如此制备的：
１．将与腺病毒转染液共培育２４小时的细胞消化下来２．离心搜集细胞３．向离心管里加入４０微升１×PBS缓冲液，随后再加入４０微升2×Lamilybuffer（由tris碱和SDS组成）裂解细胞４．将细胞裂解液放入滚水中加热五分钟，放冷后离心．５．测定蛋白浓度，加样电泳我所说的前沿有蛋白是指胶的底端，不是指加样孔下面有蛋白．胶的浓度应该没问题。
五．碧云天公司技术支持Western及IP细胞裂解液的要紧成份为20mMTris（pH7.5），150mMNaCl，1%TritonX-100，和焦磷酸钠,β-glycerophosphate，EDTA，Na3VO4，leupeptin等多种抑制剂。
能够有效抑制蛋白的降解，并维持原有的蛋白间彼此作用。
（-20℃保留，一年有效。
）若是是贴壁细胞，依照6孔板每孔加入100微升裂解液的比例（即细胞培育液量的1/20）加入裂解液。
六．军科院技术支持裂解液（50mmol/LTris?
HClpH8.0，150mmol/LNaCl，1％TritonX－100，100ug/mlPMSF）：
1mol/LTris?
HCl（pH8.0）2.5mlNaCl0.438gTritonX－1000.5ml蒸馏水至50ml混匀后，4℃保留。
利历时，加入PMSF至终浓度为100ug/ml（0.87ml裂解液加入1.74mg/mlPMSF50μl）。
七．操作方式：
蛋白样品制备：
（1）单层贴壁细胞总蛋白的提取：
1、倒掉培育液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培育液（或将瓶直立放置一会儿使残余培育液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。
2、每瓶细胞加3ml4度预冷的PBS（0.01MpH7.2～7.3）。
平放轻轻摇动1min洗涤细胞，然后弃去洗液。
重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培育液。
将PBS弃净后把培育瓶置于冰上。
3、按1ml裂解液加10ulPMSF（100mM），摇匀置于冰上。
（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。
）4、每瓶细胞加400ul含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，为使细胞充割裂解培育瓶要常常来回摇动。
5、裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培育瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml离心管中。
（整个操作尽可能在冰上进行。
）6、于4度下12000rpm离心5min。
（提早开离心机预冷）7、将离心后的上清分装转移倒0.5min的离心管中放于－20度保留。
考马斯亮蓝法
也称考马斯蓝染色法（coomassiebluestaining）又称Bradford法。
由于其突出的优势，正取得愈来愈普遍的应用。
G-250（CoomassiebrilliantblueG-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。
在下呈红色，最大在488nm；当它与蛋白质结合后变成青色，蛋白质-结合物在595nm波长下有最大光吸收。
其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。
蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时刻内达到平稳，完成反映十分迅速；其结合物在下1h内维持稳固。
该法是1976年Bradford成立，试剂配制简单，操作简便快捷，反映超级灵敏，比Lowry法还高4倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1000μg/mL，最小可测2.5μg/mL蛋白质，是一种经常使用的微量蛋白质快速测定方式。
考马斯亮蓝有G250和R250两种。
其中由于与的结合反映十分迅速，经常使用来作为蛋白质含量的测定。
考马斯亮蓝R250与蛋白质反映尽管比较缓慢，可是能够被洗脱下去，因此能够用来对条带染色。
考马斯亮蓝法测定蛋白质含量流程
该方式用于大多数蛋白质的定量是比较精准的，但不适用于小分子碱性多肽的定量。
如或。
去污剂的浓度超过0．2%阻碍测定结果。
如、SDS、NP-40等。
1．Bradford浓染液的配制：
将100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml95%乙醇，加入100ml85%的磷酸，然后，用蒸馏水补充至1000ml，此染液放4℃至少6个月维持稳固。
2．标准曲线蛋白质样本的预备：
尽可能利用与待测样本性质相近的蛋白质作为标准品，例如测定抗体，可用纯化的抗体作为标准。
若是待测样本是未知的，也可用抗体作为标准蛋白。
通常在20ug—150ug/100ul之间绘制标准曲线。
3．将待测样本溶于缓冲溶液中，该缓冲溶液应与制作标准曲线的缓冲溶液相同（最好用PBS）。
4．按1：
5用蒸馏水稀释浓染料结合溶液，如显现沉淀，过滤除去。
5．每一个样本加5ml稀释的染料结合溶液，作用5～30min。
染液与蛋白质结合后，将由红色变成蓝色，在595nm波长下测定其吸光度。
注意，不得超过30min．
6．依照标准曲线计算待测样本的浓度。
注意：
考马斯亮蓝和皮肤中蛋白质通过范德华力结合，反映快速，而且稳固，无法用一般试剂洗掉。
待一两周左右，皮屑细胞自然衰老脱落即可无碍。
蛋白质浓度测定的方式有很多，考马斯亮蓝测定蛋白质是实验室最多见的一种方式，它利用比色法和色素法混合方式、操作简便，下文介绍了考马斯亮蓝测定蛋白质浓度的原理、优缺点、操作和注意事项。
实验原理
考马斯亮蓝（CoomassieBrilliantBlue）法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质―染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方式。
这种蛋白质测定法具有超过其他几种方式的突出优势，因此正在取得普遍的应用。
这一方式是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。
考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰（lmax）的位置，由465nm变成595nm，溶液的颜色也由棕黑色变成兰色。
通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。
研究发觉，染料主若是与蛋白质中的碱性氨基酸（专门是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。
考马斯亮蓝染色法的突出优势是：
（1）灵敏度高，据估量比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg。
这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色转变专门大，蛋白质-染料复合物有更高的消光系数，因此光吸收值随蛋白质浓度的转变比Lowry法要大的多。
（2）测定快速、简便，只需加一种试剂。
完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。
由于染料与蛋白质结合的进程，大约只要2分钟即可完成，其颜色能够在1小时内维持稳固，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳固性最好。
因此完全不用像Lowry法那样费时和严格地操纵时刻。
（3）干扰物质少。
如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、等均不干扰此测定法。
此法的缺点是：
（1）由于各类蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此考马斯亮蓝染色法用于不同蛋白质测按时有较大的误差，在制作标准曲线时通常选用g—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的误差。
（2）仍有一些物质干扰此法的测定，要紧的干扰物质有：
去污剂、TritonX-100、十二烷基硫酸钠（SDS）等。
试剂与器材
一、试剂
考马斯亮蓝试剂：
考马斯亮蓝G―250100mg溶于50mL95%乙醇中，加入100mL85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000mL。
二、标准和待测蛋白质溶液
1.标准蛋白质溶液
结晶，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，依照其纯度用0.15mol/LNaCl配制成1mg/mL蛋白溶液。
2.待测蛋白质溶液。
人血清，利用前用0.15mol/LNaCl稀释200倍。
三、器材
试管1.5×15cm（×6），试管架，移液管管0.5mL（×2）;1mL（×2）;5mL（×1）;恒温
水浴;。
操作方式
一、制作标准曲线
取7支试管，按下表平行操作。
试管编号
0
1
2
3
4
5
6
标准蛋白溶液（mL）
0
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
0.15mol/LNaCl（mL）
0.1
0.09
0.08
0.07
0.06
0.05
0.04
考马斯亮蓝试剂（mL）
5mL
摇匀，1h内以0号管为空白对照，在595nm处比色
A595nm
绘制标准曲线：
以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在座标纸上绘制标准曲线。
二、未知样品蛋白质浓度测定
测定方式同上，取适合的未知样品体积，使其测定值在标准曲线的直线范围内。
依照所测定的A595nm值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量，从而计算出未知样品的蛋白质浓度（mg/mL）。
注意事项
在试剂加入后的5-20min内测定光吸收，因为在这段时刻内颜色是最稳固的。
测定中，蛋白-染料复合物会有少部份吸附于比色杯壁上，测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。
利用考马斯亮蓝法分析蛋白必需要把握好分光光度计的正确利用，重复测定吸光度时，比色杯必然要冲洗干净，制作蛋白标准曲线的时候，蛋白标准品最好是从低浓度到高浓度测定，避免误差。
考马斯亮蓝法测定牛血清蛋白的标准曲线？
一、标准曲线一样用分光光度法测物质的含量，先要制作标准曲线，然后依照标准曲线查出所测物质的含量。
因此，制作标准曲线是生物检测分析的一项大体技术。
二、蛋白质含量测定方式1、凯氏定氮法2、双缩脲法3、Folin-酚试剂法4、紫外吸收法5、考马斯亮蓝法三、考马斯亮蓝法测定蛋白质含量—标准曲线制作
（一）、试剂：
1、考马斯亮蓝试剂：
考马斯亮蓝G—250100mg溶于50ml95%乙醇，加入100ml85%H3PO4，雍蒸馏水稀释至1000ml,滤纸过滤。
最终试剂中含0.01%（W/V）考马斯亮蓝G—250,4.7%（W/V）乙醇，8.5%（W/V）H3PO4。
2、标准蛋白质溶液：
纯的牛血清血蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，依照其纯度同0.15mol/LNaCl配制成100ug/ml蛋白溶液。
（二）、器材：
1、722S型分光光度计利用及原理（）。
2、移液管利用（）。
（三）、标准曲线制作：
试管编号0123456100ug/ml标准蛋白（ml）0.00.10.20.30.40.50.60.15mol/LNaCl（ml）10.90.80.70.60.50.4考马斯亮蓝试剂（ml）5555555摇匀，1h内以1号管为空白对照,在595nm处比色A595nm1、2、以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标（六个点为10ug、20ug、30ug、40ug、50ug、60ug），在座标轴上绘制标准曲线。
1）、利用标准曲线查出回归方程。
2）、用公式计算回归方程。
3）、或用origin作图，测出回归线性方程。
即A595nm=a×X（）+6一样相关系数应过0.999以上，至少2个9以上。
4）、画图时近两使点在一条直线上，在直线上的点应该在直线双侧。
（四）、蛋白质含量的测定：
样品即所测蛋白质含量样品（含量应处置在所测范围内），依照操作步骤1操作，测出样品的A595nm，然后利用标准曲线或回归方程求出样品蛋白质含量。
一样被测样品的A595nm值在0.1—0.05之间，因此上述样品若是A595nm值太大，能够稀释后再测A595nm值，然后再计算。
（五）、注意事项：
1、玻璃仪器要洗涤干净。
2、取量要准确。
3、玻璃仪器要干燥，幸免温度转变。
4、对照：
用被测物质之外的物质作空白对照。
一、原理G-250（CoomassieG-250）是一种甲基取代的，分子中磺酸基的蓝色染料，在465nm处有最大吸收值。
考马斯亮蓝G-250能与蛋白质通过范得华彼此作用形成蛋白质—考马斯亮蓝复合物蓝色溶液，引发该染料的最大吸收λmax的位置发生红移，在595nm处有最大吸收值。
由于蛋白质—考马斯亮蓝复合物在595nm处的光吸收远高于考马斯亮蓝在465nm处的光吸收，因此，可大大地提高蛋白质的测定灵敏度。
蛋白质—考马斯亮蓝复合物溶液颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比。
利用溶液颜色的不同进行比色测定，适合于蛋白质类的，尤其适合于稀有蛋白质的微量分析。
考马斯亮蓝G-250试剂呈色反映颜色稳固、灵敏度高，最低测试蛋白质量在1ug左右。
二、操作步骤1.测定法别离取六只试管，其中一只加入1.0ml蒸馏水做空白，5只别离加入不同体积的浓度为100ug/ml牛血清标准液，补充水到1.0ml。
然后每只试管加入5.0ml考马斯亮蓝G-250试剂，摇匀放置5min，在紫外-595nm处测定吸光值。
以A595吸光值为纵坐标，牛血清清蛋白的ug数量为横坐标绘制标准曲线。
具体操作见下表。
蛋白质标准曲线测定加样试剂空白12345100ug/ml牛血清清蛋白/ml1.00.10.20.40.60.8牛血清清蛋白/ug01020406080/ml00.90.80.60.40.2考马斯亮蓝G-250试剂/ml5.05.05.05.05.05
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