表观遗传学研究方法进展资料下载.pdf

表观遗传学研究方法进展资料下载.pdf

《表观遗传学研究方法进展资料下载.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《表观遗传学研究方法进展资料下载.pdf（9页珍藏版）》请在冰点文库上搜索。

E-mail:

zxg08sagcorg通讯作者:

罗利军，男，研究员，博士，研究方向:

水稻节水抗旱;

lijunsagcorgcn表观遗传（epigenetic）是指DNA序列不发生变化，但基因表达却发生了可遗传的改变。

这种改变是细胞内除了遗传信息以外的其他可遗传物质发生的改变，且这种改变在发育和细胞增殖过程中能稳定遗传1，2。

表观遗传学的现象很多，DNA甲基化（DNAmethylation）、组蛋白修饰（histonemodification）、基因组印记（genomicimprinting）、RNA编辑（RNAedi-ting）、基因沉默、核仁显性、休眠转座子激活和性别相关性基因剂量补偿效应等都是典型的表观遗传现象3，4。

表观遗传研究目前主要集中在DNA甲基化和组蛋白共价修饰两方面。

DNA甲基化（DNAmethylation）是常见的表观遗传现象，它是指在DNA甲基转移酶（DNAmethyl-transferases，DNMTs）的作用下将甲基添加在DNA分子中的碱基上。

常见的DNA甲基化发生在DNA链上的胞嘧啶（C）第5位碳原子和甲基间的共价结合形成5甲基胞嘧啶（5mC）5，6。

除此以外，在腺嘌呤（A）N6位置可以引入一个甲基形成N6甲基腺嘌呤（N6-mA）。

在真核生物中，DNA甲基化主要发生在CpG二联核苷酸上，也常在植物基因组CNG和CNN序列上发现7，8。

在某些区域，CpG序列密生物技术通报BiotechnologyBulletin2011年第9期度很高，可达均值的5倍以上，成为C和G的富集区，就像在DNA序列汪洋大海中浮现的一座座孤岛，称为CpG岛（CpGislands）9。

作为表观遗传学最重要的现象之一，DNA甲基化对基因的表达发挥着重要的调控功能，涉及异染色质形成、转座子扩散防御、基因印迹、源基因表达调控、转基因沉默和细胞分化等，在生命活动中起着重要的作用3，4，10。

组蛋白共价修饰（histonemodification）包括11:

乙酰化（acetylation）、甲基化（methylation）、磷酸化（phosphorylation）、核糖化（ribosylation）、泛素化（ubiquitylation）和类泛素化（sumoylation）。

这些修饰共同构成了可以通过特殊解码蛋白解读的组蛋白密码，在解码过程中影响基因表达12，13。

其中乙酰化和甲基化主要发生在组蛋白lys残基上，乙酰化与转录激活相关;

甲基化既可能与转录激活相关，也可能与转录抑制相关，激活或抑制取决于甲基化lys位点以及添加的甲基基团数目8，14，15，每个lys残基可以加上13个甲基基团，形成单甲基化、二甲基化、三甲基化3种形式，每种形式有其独特的功能16。

磷酸化是另外一种重要的调控方式17，在基因转录、DNA修复、细胞凋亡以及染色质凝聚等过程中起重要作用。

核糖化18是指组蛋白H1、H2A、H2B及H3和多聚ADP-核糖的共价结合，ADP-核糖基化被认为是在真核细胞内启动复制过程的扳机;

泛素化19是指将被降解的蛋白质连接上泛素标记，一些可以诱导基因启动子区域的H2B组蛋白会被修饰以启动基因表达;

类泛素蛋白20（smallubiquitin-likemodifiers，SUMO）对蛋白质的翻译后修饰被认为与蛋白质的细胞内定位、稳定性和转录活性有关，也可能参与异染色质结构的调节。

近年来，人们越来越认识到表观遗传在基因表达调控方面的重要性，并开发出一系列检测表观遗传修饰的方法，尤其是DNA甲基化和组蛋白修饰检测方法取得了较大进展，一方面方法的灵敏度和特异性都在不断提高;

1DNA甲基化研究技术目前全基因组或接近全基因组甲基化检测技术较多，主要分为3类:

第1类技术以限制性内切酶酶切为基础，用一个或多个酶限制性切割未甲基化DNA（如HpaII和NotI）或甲基化DNA（如McrBC）。

这些方法结合芯片、毛细管测序21等技术已经检测了多种生物的全基因组甲基化，但仅限于内切酶能够识别的CpG位点。

第2类技术依赖于全基因组DNA重亚硫酸盐转换，经重亚硫酸盐处理后基因组DNA未甲基化胞嘧啶（C）转换为尿嘧啶（U）（经扩增后最终为T），甲基化C保持不变22。

此方法可以进行单CpG位点解析并且可以结合芯片或高通量测序。

但此方法的局限性在于经过重亚硫酸盐转换后，序列特异性降低，在芯片上难以设计足够的特异性探针进行全基因组分析。

此外，如果用于较大基因组日常分析，此方法十分昂贵。

第3类技术以免疫学为基础，用5-甲基胞嘧啶特异性抗体或者用含有甲基结合结构域的蛋白通过免疫沉淀富集基因组甲基化或未甲基化片段23，称为甲基化DNA免疫共沉淀（methylatedDNAimmu-noprecipitation，MeDIPormDIP）10，2428，MeDIP结合芯片（MeDIP-chip）技术可以对任何物种进行高通量全基因组DNA甲基化作图29。

以上3类技术可以与测序或芯片技术组合形成多种方法:

如酶切结合测序、酶切结合芯片技术、亚硫酸氢钠结合测序、亚硫酸氢钠结合芯片技术、免疫沉淀结合测序和免疫沉淀结合芯片技术等。

11以限制性内切酶为基础的DNA甲基化检测技术111甲基化敏感扩增多态性（methylationsensi-tiveamplificationpolymorphism，MSAP）本方法是在扩增片段长度多态性（amplifiedfragmentlengthpol-ymorphism，AFLP）技术的基础上建立起来的30，31。

其基本程序是:

提取基因组DNA，根据HpaII、MspI两种酶对甲基化敏感程度不同，分别用EcoRI/HpaII、EcoRI/MspI两组酶组合对基因组DNA进行双酶切，连上接头后，用按照接头序列设计的引物加上一个选择性碱基进行PCR扩增，称为预扩增。

预扩增产物稀释后，再加入另外两个选择性碱基引物进行第二次PCR扩增，称为选择性扩增。

扩增产物变性后在6%的PAGE胶上电泳，最后采用银染或同位素放射自显影方法处理PAGE胶，统计和分析DNA条带即可得出基因组CpG位点甲基化状态。

还可以对差462011年第9期郑小国等:

表观遗传学研究方法进展异扩增片段回收克隆测序，通过比对可鉴定甲基化差异位点。

MSAP技术相对其他DNA甲基化测定技术有如下优点:

不需知道被测DNA的序列信息;

操作相对简便，在AFLP基础上可直接操作;

可在全基因组范围检测CCGG位点的胞嘧啶甲基化变化。

MSAP技术的局限性在于只能检测CCGG位点的胞嘧啶甲基化。

此方法常用于研究动植物全基因组甲基化状态。

112McrBC酶切法McrBC是一个DNA甲基化特异性限制性内切酶，识别（A/G）C基序中甲基化的C，切割一条或两条链上含有甲基化胞嘧啶的DNA。

McrBC不作用于非甲基化的DNA。

McrBC的DNA识别位点包含两个（G/A）mC形式的半位点。

半位点的间距最长可达3kb，但最适宜切割的间距是55103bp。

McrBC切割时需要GTP存在，当存在GTP的非水解类似物时，该酶可以特异性地结合到甲基化的DNA上，而不产生切割反应。

McrBC在一对PumCG序列元件上进行切割，因此可以检测相当大一部分的甲基化CpGs。

通常该方法结合芯片技术检测甲基化DNA，其基本程序是:

首先用McrBC酶对全基因组DNA进行酶切，然后将酶切片段与芯片杂交，对数据统计分析检测甲基化DNA。

该方法的局限性在于:

McrBC不能识别内部胞嘧啶甲基化了的HpaII/MspI位点（CCGG），而且该酶在每一对半位点之间切割一次，切割位点靠近这一对半位点的一侧，但通常距最近的甲基化碱基大约30bp。

当DNA片段含有多个McrBC识别半位点时（如含有甲基化胞嘧啶的基因组DNA），因该酶的切割位点具有不确定性，易导致切割位点重叠32。

12重亚硫酸盐法重亚硫酸盐法的原理是单链DNA在HSO3存在的条件下能有效地将未甲基化C转变成U，两轮PCR扩增后，该位点变为T，而m5C则保持不变，仍然为C。

通过扩增克隆测序比对，可以鉴别待测位点是否发生了甲基化22。

该技术很容易确定个体基因组DNA分子中各个单链的甲基化状态及甲基化位置。

在此基础上，可以结合DNA直接测序、限制性内切酶分析、甲基化特异性PCR扩、甲基化敏感的单核苷酸引物延伸法、高效液相色谱法以及锁式探针技术等方法测出相应序列的甲基化情况33。

121重亚硫酸盐结合DNA直接测序法该方法由Formmer等22提出，其基本过程是:

提取高质量基因组DNA平均分为两组，一组经重亚硫酸盐处理转换，另一组作为对照。

用引物进行扩增，对分别获得的两组扩增片段进行测序对比，如果处理后一组的C变为T，则这些转变的位点为没有发生甲基化的位点，若处理后仍然为C，则这些位点发生了甲基化。

该方法适用于特定基因甲基化检测，如鉴定某个基因在某种状态下的甲基化状态。

122联合重亚硫酸盐限制性内切酶分析法联合重亚硫酸盐制性内切酶分析法（combinedbisulfiterestrictionanalysis，COBRA）由Xiong和Peter报道33，34，其基本程序是:

先对样本DNA进行重亚硫酸盐处理，PCR扩增目的片段，随后用限制性内切酶消化，此酶识别序列中需包含CG序列，如BstUI（CGCG）。

若其识别序列中的C发生完全甲基化（5mCG5mCG），则PCR扩增后保留为CGCG，BstUI能够识别并进行切割;

若待测序列中，C未发生甲基化，则PCR后转变为TGTG，BstUI识别位点丢失，不能进行切割。

这样酶切产物再经电泳分离、探针杂交、扫描定量后即可得出原样本中甲基化的比例35，36。

用COBRA和Agilent2100Bioanalyzer对酶切产物进行直接分析，使COBBA的定量更快速、准确且无放射性污染37。

此方法相对简单，不需预先知道CpG位点及样本序列;

可对DNA甲基化水平进行定量研究;

需要样本量少，可用于石蜡包埋样本的分析。

本方法的局限性在于只能获得特殊酶切位点甲基化情况，因此检测阴性不能排除样品DNA中甲基化存在的可能。

此方法常用于样本量少，DNA甲基化定量检测试验中。

123亚硫酸盐结合甲基化特异性PCR法甲基化特异性PCR（methylation-specificPCRMS-PCR）是Herman等38首先提出的一种检测基因组DNA甲基化水平的常用方法33，38。

该法是将DNA经重亚硫酸盐处理，非甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变。

在PCR反应时，设计两套不同的引物对:

一对引物序列针对经亚硫酸氢钠处理后的甲基化DNA链设计，若用该对引物能扩增出56生物技术通报BiotechnologyBulletin2011年第9期片段，说明该检测位点发生了甲基化;

另一引物针对经亚硫酸氢钠处理后的非甲基化DNA链设计，若用该对引物能扩增出片段，说明该检测位点没有甲基化。

两套引物都具有很高的特异性39:

引物末端均设计至检测位点结束;

两套引物分别只能与重亚硫酸盐处理后的序列互补配对，即一对结合处理后的甲基化DNA链，另一对结合处理后的非甲基化DNA链，与未经处理的DNA序列无互补配对;

MSP引物覆盖序列中必须含有一个或一个以上的CpG岛，以保证引物的特异性，经克隆测序就检测出引物所覆盖序列的甲基化位点，引物覆盖序列中CpG岛所占比例越高，甲基化DNA检出率越高。

该法不足之处在于40:

引物的选择和设计非常关键，否则易导致假阳性;

如果亚硫酸氢钠对DNA处理不完全，也易导致假阳性。

可通过限制性内切酶酶解法检验PCR产物作进一步判断。

124甲基化敏感的单核苷酸引物延伸法甲基化敏感的单核苷酸引物延伸法（methylation-sensitivesingle-nucleotideprimerextension，Ms-SNuPE）可用于快速判断DNA片段中某些具体位点的甲基化状况。

由GonzalgoandJones提出41。

其基本原理是:

样本DNA经重亚硫酸盐处理后PCR扩增目的片段，产物电泳分离后平均分为两份作为Ms-SNuPE模板。

分别针对所检测的CpG位点设计上游引物，使3端引物紧邻C。

扩增时加32P标记的dCTP或dTTP进行单核苷酸延伸反应。

如果待测位点被甲基化，则同位素标记的dCTP会在反应延伸时连于引物末端;

若是未被甲基化，则标记的dTTP参与反应4244。

再电泳分离产物，成像。

根据某一CpG位点的C/T信号强度比，可定量其甲基化程度。

也可不经电泳，PCR产物直接转移到尼龙膜上，成像后即可得到所测多个CpG位点的平均甲基化程度。

Ms-SNuPE可快速定量多个CpG位点的甲基化程度，但序列较长时此方法不适用，且此方法具有放射性。

125高效液相色谱法（highperformanceliquidchromatography，HPLC）Oefner等45首先提出变性高效液相层析（denaturingHPLC，DHPLC）用于单核苷酸和DNA分析。

邓大君等46将其改进并与PCR联用建立了一种检测甲基化程度的分析方法，其原理是将经重亚硫酸盐处理的DNA进行差异性扩增，由于原甲基化的胞嘧啶经重亚硫酸盐处理被保留，因此在随后的PCR扩增时，其变性温度也相应上升，使PCR产物在色谱柱中保留的时间明显延长，从而判定出PCR产物的DNA序列甲基化状况。

126亚硫酸盐结合锁式探针法锁式探针（pad-lockprobe）及其应用是Nillssion等首次报道的47，48，其原理是只有当锁式探针和相应的检测靶DNA同时存在于连接体系中且完全互补配对时，线型锁式探针才能在连接酶的作用下被有效地连接成环型，而在没有相应靶DNA存在时锁式探针不被连接酶连接，仅以线性形式存在。

在核酸外切酶的作用下，线性形式存在的锁式探针被消化水解，而连接成环状的锁式探针就可以在接下来的扩增反应中得到扩增49。

对扩增产物或扩增信号进行分析，就可以判断连接体系中是否存在检测靶DNA。

锁型探针以前是用来获取外显子并进行测序的50。

亚硫酸盐结合锁式探针法的基本程序是51:

首先合成长约150nt的寡核苷酸链，酶切裂解转换成锁式探针;

然后锁式探针文库与经重亚硫酸盐处理的DNA退火，延伸，再与5端连接环化，并酶切除线状DNA分子;

最后用一对常用引物对所有的环状锁型探针进行PCR扩增，鸟枪法测序。

此方法有两个主要困难51:

亚硫酸盐处理DNA使所有未甲基化的胞嘧啶转换成了尿嘧啶，使序列复杂性显著减少，因此从亚硫酸盐处理的DNA中获得特异性的序列比天然DNA困难;

此方法获取灵敏度低、偏差高及等位基因随机缺失。

因此，用目前存在的方法获得精确高效的DNA甲基化分析是不可能的。

尤其是无法解决等位基因的缺失问题。

此外合成探针数量较多，工作量较大，价格昂贵。

127结合新一代测序技术的高通量单碱基解析新一代测序技术的出现，使全基因组测序单碱基分析成为可能。

可以通过高通量测序对比检测基因组DNA甲基化程度及位点52。

此方法的优势在于能够对全基因组甲基化进行精确分析。

最近，重亚硫酸盐结合新一代测序技术完成了拟南芥约120Mb基因组DNA甲基化图谱分析53。

13甲基化DNA免疫共沉淀（methyl-DNAimmu-noprecipitation，MeDIP）MeDIP方法是用5-甲基胞嘧啶特异性抗体或者662011年第9期郑小国等:

表观遗传学研究方法进展用含有甲基结合结构域的蛋白通过免疫沉淀富集基因组甲基化或未甲基化片段23，54，其基本程序是:

（1）提取全基因组DNA，经超声波打断成长度为400500bp的片段;

（2）加热变性，将变性的单链DNA样品平均分为两份;

（3）其中一份加入甲基化DNA特异性抗体，另一份作为TotalinputDNA样品;

（4）使用亲和层析分离上一步样品中的甲基化DNA片段的抗体复合物，样品中其余的非甲基化DNA片段被洗脱，纯化得到甲基化DNA片段（MeD-IPDNA）。

得到纯化的甲基化DNA片段后可以结合荧光定量PCR技术定量检测DNA甲基化，也可结合芯片技术检测基因甲基化。

131MeDIP结合实时荧光定量PCR技术（Me-DIP-qPCR）实时荧光定量PCR技术是在PCR反应体系中加入荧光试剂，利用荧光信号实时检测PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

实时荧光定量PCR能够专一，灵敏，快速，高重复地精确定量起始模板的浓度。

实时定量PCR技术与MeDIP技术结合，先通过MeDIP技术富集甲基化的DNA片段，再利用实时荧光PCR技术进行检测，经过数据分析处理得到检测的生物样品中特定位点的甲基化水平的精确数值。

此方法的特点是:

高特异性;

不需要标记探针;

精确度高，重复性好;

灵敏度高。

132MeDIP结合芯片技术（MeDIP-chip）甲基化免疫共沉淀结合芯片技术基本程序是29:

用Me-DIP的方法富集甲基化的DNA片段，与全基因组对照分别标记后（MeDIPCy3，InputCy5）混合与设计的芯片杂交，用高解析度芯片扫描仪检测杂交信号;

对杂交结果进行数据提取、标准化、峰值分析和报告。

但到目前为止不能通过MeDIP方法准确估计甲基化水平，而且低CpG密度区域甲基化分析存在问题。

14单分子实时测序法直接检测DNA甲基化（sin-gle-molecular、real-timesequencing，SMRT）SMRT是最新开发的方法，由Flusberg等55提出，本方法不需要亚硫酸盐处理，而利用DNA聚合酶进行边合成边收集荧光信号的方法进行测序。

其原理是:

DNA聚合酶催化荧光标记的核苷酸结合到核苷酸链上，当核苷酸掺入时，通过荧光脉冲到达和持续的时间检测可以获得聚合酶动力学信息，从而可以直接测定DNA模板上的核苷酸修饰，包括:

N6-甲基腺嘌呤，5-甲基胞嘧啶，5-羟甲基化胞嘧啶。

PacificBiosciences公司发明了一种直径只有几十纳米的纳米孔（zero-modewaveguides，ZMWs），单分子的DNA聚合酶被固定在这个孔内。

聚合酶链式反应开始时由于荧光标记的A、T、C和G较快速地从外面进入到孔内又出去，它们形成了较稳定的背景荧光信号。

当这些荧光标记的脱氧核苷酸被掺入DNA链的时候，它的荧光就同时能在DNA链上探测到。

当它与DNA链形成化学键的时候，它的荧光基团就被DNA聚合酶切除，荧光消失。

这种荧光标记的脱氧核苷酸不会影响DNA聚合酶的活性，并且在荧光被切除之后，合成的DNA链和天然的DNA链完全一样。

该技术还需进行优化，第一个是把双链DNA环化反复测序，DNA聚合酶能够以环化的DNA作为模板滚环复制，反复测一段DNA序列。

这种反复测序，纠正了偶尔出现的复制错误，从而使测序精度非