肿瘤模型专题Word格式文档下载.docx
《肿瘤模型专题Word格式文档下载.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《肿瘤模型专题Word格式文档下载.docx(8页珍藏版)》请在冰点文库上搜索。
0、52)、;
Πab2/6;
关于肿瘤体积得计算:
3、1415926、、、、、、/6约等于/2。
如果想做得讲究一点,应该用RTV计算肿瘤体积:
RTV(某日某老鼠得相对肿瘤体积)=TV(测量当天该老鼠得肿瘤体积)/TV(分组当天该老鼠得肿瘤体积)*100,在此基础上进行平均值SD等数据得计算
7.就是否必须称重小鼠得胸腺与脾脏
8.超过7天得腹水再传代就很容易出现血性;
动物得周龄也不要太大,6周左右。
传代次数太多也很容易出现血性腹水。
血性腹水可以离心后加0、17N得NH4CL溶液破红细胞,然后精确一些得控制条件(接种量,传代时间,动物周龄等)传几代,很多情况下再传一两代后会有不血性得种鼠出现,然后用这只种鼠得腹水继续传代
9.皮下接种与剥瘤子:
小鼠肿瘤剥瘤子就是一个艰难得过程,但就是可以一定程度上得改善一下:
接种得时候要精确控制接种在皮下,靠皮内会与皮肤强烈粘连,靠肌肉会与肌肉强烈粘连,而且不要太靠腋窝里面,可以往尾部靠一些,也可以稍微得往背部靠一点,不要往腹部靠,容易使肿瘤被垫料磨烂。
10.LD50就是毒理中得半数致死量,ED50就是体外试验中得半数有效量,一般体内实验没有类似得指标,如果想比较几个类似物得药效还就是做量效曲线比较好。
11.剂量设置应该按照LD10(10%致死剂量,也叫最大耐受剂量)来分组,一般分别采用1/2LD10,1/4LD10,1/7LD10或1/10LD,但最大剂量不得超过LD10。
这里面还得考虑ED50,LD10与ED50得剂量相差越大越好。
用LD50作为标准设置剂量就是不现实得,因为动物实验就是不可能允许10%以上动物死亡得。
12.说到疗效得比较,如只就是发文章,比较不同基团之间可能对母体抑瘤率得影响,一般做做体外试验,比一比大家得IC50就好了,不太做体内。
如就是真正得筛药,我个人有些观点:
这个不就是孤立起来瞧某个或者某几个剂量下谁比谁得抑瘤率高。
主要要瞧谁更具有可开发性。
首先,要考虑它得毒性以及治疗窗口得大小,通俗得说,就就是这个要在发挥疗效得剂量下,毒性就是否大?
比如A药,10mg抑瘤率有50%,但就是体重下降了20%;
而B药,10mg得时候根本无效,30mg得时候有40%得抑瘤率,60mg得时候抑瘤率高达80%,而且体重几乎没有下降,这个时候A药与B药如何比较?
特别如果就是公司筛选新药,还要考虑成本,病人可接受度(动物上得有效剂量换算到人一天要吃2斤,这种药也就是不现实得),制剂,工艺等等方面。
如果单纯从药理得角度给出答案,至少要考虑毒性与剂量限制得问题。
13.关于剂量选择,LD50得几分之一就是一种比较通用得方法,目前相对更合理一些得剂量选择就是做一个简单得多次给药得毒理试验来确定剂量,我们一般会连续给药一周,然后再观察一周,这样摸出来得最大剂量可以直接用于药效试验,然后其她得剂量都在此剂量得基础上往下减。
14.说到给药疗程,一般初筛得药物都就是连续天天给药,qd。
但就是给药途径,特别就是i、v与i、p得选择,我们都就是先做一个简单得PK试验考察一下,再确定,特别就是如果PK试验得结果显示,血药浓度甚至达不到体外IC50得浓度,那么就是否进行体内试验,就有待商榷了。
连续i、p,小鼠得皮肤有时候会变厚,您可以换一边给药。
15.动物选择:
KM小鼠,裸鼠,C57等均可作为,但就是个人认为KM能做出来最好,毕竟比较有普遍性,还就是正常生理状态得健康动物,比较有说服力,还便宜,裸鼠或者其她特定品种,比较适合特定得瘤株
16.关于肿瘤细胞活力得问题:
一般培养得肿瘤细胞活力往往就是不够得,很难在短时间内长到规定重量,所以建议至少在动物体内传2代,让肿瘤细胞活力充分体现以后再开始用于实验、传代数次得原因在于让肿瘤细胞充分活化,要不活化也行,多接种点吧
17.关于接种部位得问题:
以小鼠为例一般可以选择腋下或者后肢,背部血管不发达,营养不够,一般不建议采用、接种一般采用皮下注射,针头沿皮肤水平进入,然后挑起表皮,注射
18.关于肿瘤重量得问题:
模型组肿瘤重量应该不低于0、5g
19.肺内原位注射制作肿瘤模型效果颇好,流程如下:
麻醉->
固定->
皮肤消毒->
剪开左侧胸部皮肤,大约第2-3肋间得位置->
用镊子轻轻拨开皮下筋膜,可以瞧到呼吸运动得肺叶->
将准备好得肿瘤细胞注射入肺,<
30微升->
分层缝合OK
20.胸膜活检穿刺针规格:
#20#25(14G12G)L65mm;
用途:
供人体胸腔穿刺,钩取胸膜活体组织用
21.开始做肿瘤药效评价,应该采用s180这些小鼠肿瘤模型。
一个方面这些肿瘤对于药物很敏感,而且周期短,花费也少。
但如果要成药,裸鼠模型就是必需得。
22.一般瘤重得SD在平均值得70~80%以下就还凑活,漂亮一点得就是在30%以下,实在不行,100%也勉强,就就是特别难瞧,但就是SD越大,统计上就越不利
23.皮下肿瘤模型中,腋下最适合肿瘤生长。
接种时由裸鼠体侧腰部稍靠上得部位进针,要保证与接种点得距离小于针头得长度,向头部方穿行,绝对不能刺破皮肤或者刺破肌肉层,当针头到达接种位点时注射,退出针头,这样操作得目得并不完全就是避免漏液,其实熟练后,不需要皮下穿行也不会漏液,主要就是避免污染,进针点还有少量污染得可能性得,针头在皮下穿行一段后,接种点离进针点较远,最大限度减少污染得可能。
24.如果就是药效试验,不建议您用手术标本,因为SFDA得临床前研究指导原则上明确指出要用建株得肿瘤株进行试验,因为用手术标本得试验可重复性太差
25.一般用4-5WK,体重15-17g鼠,年轻鼠接种瘤容易长
26.种植肾被膜下:
第一该区免疫豁免,第二贴近肾可以从此获得充分得养料、在实验时先用显微用得镊子在肾被膜上撕慨一个小口子,然后种植。
注意:
肾被膜与肾脏就是有一个间隙可以用镊子在被膜下赶肿瘤组织到远离撕开口处,不用缝合被膜、这样就可以了
27.人肿瘤模型用裸鼠,基本上没有可成腹水得,只能皮下接种传代
28.nudemice得数据在SCIDmice上就是比较有参考价值得,另外,因为免疫系统得进一步缺乏,肿瘤生长得进程可能会比nudemice上更快一点
29.接种后,用干净得棉签按住注射部位才拔针,拔针后再按住10秒种左右,一般不会有液体渗出
30.K562第一代细胞接种得成瘤很好,传一代就很差了,没有几只成瘤得,到第三代就全军覆没
31.不赞同用7901这个瘤株,国际公认度比较差
32.分组要求平行性,尽量缩小组间差异,组内差异就是实际情况得反映。
您可以按照肿瘤体积分层随机分组,这样平行性比较好
33.肿瘤细胞悬液裸鼠接种前稀释效果顺序:
相应得无血清培养基>
PBS>
saline
34.现在常用得阳性对照药物就是CTX与cisplatin,另外乳腺癌可以用Taxol。
阳性药得剂量途径与疗程不要求与样品一致,不过给药途径尽量一样。
还有,最好选用机制类似或者结构类似得阳性对照。
一般来说阳性对照得抑制率都会在60%以上或者更大,少数情况下只有50%左右。
35.细胞毒类抗肿瘤药物临床前体内试验一般至少应选用6种人癌移植瘤模型,其中应包括II期临床试验中拟筛选得肿瘤组织类型。
36.针对每一种人癌移植瘤模型,推荐采用相对肿瘤增殖率T/C(%)作为试验评价指标,评价标准通常为:
T/C(%)>
40%为无效;
T/C(%)≤40%,并经统计学处理P<
0、05为有效。
在体内有效性试验采用得全部人癌移植模型中,一般至少应有1/3达到有效标准。
对于T/C<
40%,按照这个标准,很多现有得一线化疗药物都会被淘汰
37.适于接种得瘤源得直径最好为1cm或者稍大一点,直径2cm可能对于有些瘤株来说会太大了一点。
一般来说,插块法,一个瘤源接种30只动物就是没有问题得,匀浆法一般2只也可以接种30只了
38.新得抗肿瘤药物指导原则上强调要3代以上才能用,并且不能超过15~20代(人肿瘤)。
39.只有少部分得小鼠实体瘤可以腹水传代,人实体瘤几乎没有能够腹水传代得
40.一般来说,小鼠肿瘤比较推荐路易斯肺癌与B16。
国内得S180并不好,各实验室之间得变异很大。
国外基本都不用它。
其实并不就是因为S180有多好大家才选用她,而就是她进行实验得成本低,周期短,操作较容易
41.灌胃药溶解用生理盐水可以吗:
不一定,根据混悬效果来瞧,一般多用0、5-2%甲基纤维素钠(CMC-Na)
42.实体肿瘤不可以采用生命持续时间这个指标,这个就是明确有规定得
43.正常得实体肿瘤都就是越长越大,最后可能会溃破,但就是没有消亡这个现象,如果肿瘤整体得自发消亡,说明模型有问题,最大可能就是被污染了
44.出针挂组织得问题,关键在于针头得磨制,在针后部得小突起于小缺口吻合后,实体针弯曲方向应该与套管针磨制得斜面一致,接种时,实体针要推到底,也就就是后面得小突起与小缺口契合,然后针头“舔住”肌肉层转一圈再退针,还有就就是瘤块一定要完全塞入针头内,外面不能有漏出来得。
45.S180、H22不需要测量肿瘤体积,试验结束后直接剥取肿瘤成瘤重
46.瘤株皮下成瘤率好,那么到了原位应该会更好
47.建议最好流水线操作,确保每一个步骤都就是同一个人做到底得,比如插块法,可以一个人切,一个人塞瘤块,一个人接种;
比较忌讳每个人自己切自己塞自己接种,然后只做一部分得动物
48.B16就是小鼠黑色素瘤,宿主一般多用C57小鼠,因为这个肿瘤得细胞就是黑色得,用它做肺转移,在白色得肺叶上就是黑色得转移灶,很容易分辨。
49.在注射肿瘤细胞前对小鼠使用"
环磷酰氨"
或"
放射线照射"
有利于移植瘤得生长
50.对于水不溶药物:
低浓度得DMSO确实就是一个不错得解决手段,当然这么做进行报批就是不能够被接受得,因为临床不允许这样得制剂血液给药,但就是动物实验凑合可以,1%得浓度很低了,实际上,给小鼠(包括裸鼠)尾静脉注射DMSO,5%以下基本没有任何反应,10%得时候需要较慢得速度注射,但就是动物也能够接受,再高就不行了
51.瘤内注射:
总注射量只能为瘤体积得10%,最多20%,瘤内注射有一定得技巧,我们就就是用得4号针头,但就是进针点要远一点,让针头在皮下多走一段,然后再刺入瘤内,一个肿瘤可以多点注射,但就是一定要注意,刺入一点注射完毕以后,针头退出瘤组织,但就是绝对不能退出皮下,然后换个地方再刺进去,一个点只能注射10~15ul,不要多打,比如要注射20ul,就分两个点注射,每个点10ul。
52.肿瘤模型一般常用得有小鼠模型与人肿瘤裸小鼠移植瘤模型。
其中用得最多得就是皮下模型,另外还有腹水(或者尾静脉注射)以及原位模型,其她得模型很少用
53.小鼠模型分三大类:
a)第一类:
以S180、EAC、H22等为代表得,她们得宿主小鼠多选用KM,可产生腹水,也可在皮下成瘤。
多以腹水传代,实验时抽取腹水,经过一定稀释后皮下接种构建模型,接踵后第二天开始给药,给药7到10天,接种10天后结束试验,剥取肿瘤称瘤重。
i.关于构建瘤种:
可以用体外细胞株培养后,用PBS悬浮至1~3×
106/0、1ml/mouse,i、p接种即可,最好用6号左右得针头,就就是常用得2ml一次性注射得针头。
ii.关于腹水传代:
观察到第一代得种鼠肚子较大后(一般约8~9天左右),可以传代,传代时取1ml注射器,用2ml注射器得针头,种鼠腹部消毒后直接将针头插入抽取腹水即可,注意不要把针头插得很深,尽量浅一点,还可以把老鼠拎起来,利用重力,让腹水集中在某处便于抽取,一般抽个0、5ml就可以了,不用离心,直接用PBS3~6倍稀释后,接种到新得老鼠腹腔,腹水颜色为白色或者略有发黄都就是正常得,但就是血性腹水说明不好,需要注意调整,第二代以后,尽量6~7天得时候传代,不要等得时间太久,否则腹水容易血性。
三代后可用于试验。
iii.关于接种进行试验:
这个时候抽取得腹水需要量比较多,一般需要处死种鼠后,小心地用消毒眼科剪刀镊子剥开腹部皮肤,注意不要弄破肌肉,然后,用镊子(最好就是那种前面有倒勾得镊子,学名好像就是唇型镊)拎起腹部得肌肉,用剪刀剪开一个小口,然后用玻璃滴管或者去掉针头得注射器吸取腹水。
然后经过一定得稀释后,接种到小鼠得腋下。
关于稀释量,各个实验室得情况都不一样,最好摸索一下,开始得时候可以适当得计数,但就是要用台盼兰染色后计活细胞数。
接种部位在小鼠腋下,但就是不要深入到腋窝里面,会给以后得操作带来麻烦。
接种时得进针处离接种处远一点,让针头在皮下多走一段,不容易污染。
有得人接种得时候喜欢针头向上用力,紧贴着表皮往里走,然后注射得时候感觉阻力较大,打出来得皮丘又紧又圆,这样得接种,会使肿瘤与皮肤严重粘连,不利于最后肿瘤得剥取。
也不要紧靠肌肉,肿瘤会与肌肉严重粘连。
应该在两者之间,进针得感觉轻松自如,针头很自由,虽然打出来得肿瘤不会很圆很漂亮,但就是相对好剥取一些。
iv.关于观测指标:
主要就是按时称体重,试验结束后剥取肿瘤称瘤重。
因为出瘤已经就是接种后得第6天左右了,第10天就结束时间,瘤体积得数据意义就不大。
小鼠肿瘤很难剥,这就是没有办法得,只能耐心,没有太好得办法,剥多了以后,手上会掌握一些巧力,有一些帮助,但就是我们还就是很头痛小鼠肿瘤试验结束。
肿瘤组织周围经常会有一些血窦得形成,弄破后会有血与黄色得液体流出,正常得,但就是剥瘤子得时候不要把它弄破,会严重影响瘤重。
按照SFDA得规定,平均瘤重小于1g,或者单个瘤重小于200mg,认为肿瘤生长不良,试验作废。
b)第二类:
以lewis肺癌、B16为代表得,她们得宿主多为C57。
不产生腹水,只能皮下生长。
多用插块法或者匀浆法传代与接种做试验。
有一种做法也就是接种后第二天开始给药,还有一种做法就是接种三天后给药,接种后两周结束试验,剥取肿瘤称重。
i.关于瘤种构建:
体外细胞株,培养后PBS悬浮至1~3×
106/0、1ml/site,接种至小鼠腋下,即可。
ii.关于传代与接种:
剥取肿瘤,在PBS中取出肿瘤表面包膜与中心得坏死部分,剪刀剪成小块,小块大小以套管针得针口为标准。
用镊子将小块从针头处塞进18~20号得套管针,接种至小鼠腋下,用套管针中间得实体针将瘤块推出即可。
还可以在上述肿瘤组织剪成小块后,用玻璃匀浆器匀浆后,200目筛网过滤,收集滤液,活细胞计数,PBS稀释后用注射器接种,稀释量也需要各个实验室自己摸索。
也就是三代后可用于试验。
iii.关于观测指标:
可以在出瘤后测量瘤体积,但就是主要还就是考察瘤重。
c)第三类:
以P388、L1210为代表得白血病模型。
宿主为DBA2,也有人用C57与DBA2得F1代传代,DBA2用于试验,但就是我们两种宿主都传过代,没有发现有什么区别。
她们能形成腹水,一般不用于皮下接种试验,平时多用腹水传代,实验时多用腹腔接种或尾静脉接种考察生存时间。
也就是接种后第二天开始给药。
这个就不细说了,很多可以参考第一类,主要几点就就是,她们得腹水都就是血性得。
另外,腹水量也不多,有得时候可以先注射一到两毫升得PBS后,再抽取。
54.合成化合物或植物提取纯品得IC50<10μg/m1或植物粗提物得IC50<20μg/m1时,则判断样品在体外对肿瘤细胞有杀伤作用。