烟曲霉感染诊断方法Word下载.docx

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聚合酶链反应（PCR）分子生物学技术是一种新型的烟曲霉感染诊断方法，诊断的灵敏性高，越来越被人们所关注。

目前成了国内外研究的热点，其技术的关键部分有聚合酶链反应（PCR）扩增、DNA分子探针、限制性酶切片段长度多态性分析（RFLP）、随机扩增DNA多态性（RAPD）等方法，其中PCR法具有特异性强、重复性好、全封闭反应、灵敏、快速等优点，因此，欧洲和美国FDA推荐其用来诊断IPA，也被称为目前最理想的分子生物学方法。

PCR诊断的检测标本有血清、脑脊液、BAL、尿液等，检测靶基因各实验室各有不同，检测方法也在不断改进，由开始的普通PCR、半定量PCR、定量PCR到实时PCR到定量实时PCR、巢式PCR等等[12]。

PCR检测体系的靶基因主要包括烟曲霉菌一些基因位点的保守序列或是线粒体DNA片段。

首先将标本中可能存在的烟曲霉菌DNA提取出来，利用实时荧光定量PCR将其扩增得出初始标本中的曲霉菌DNA拷贝数或是利用传统PCR将其扩增后，利用其他分析方法对扩增后产物进行分析，从而得到初始标本中的曲霉菌的量和种类等相关信息。

PCR诊断技术类似于烟曲霉DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。

有实验研究表明：

从49名已证明为侵袭性肺曲霉病（IPA）病人和50名可能为IPA病人获取BAL标本，靶基因为烟曲霉真菌219bp片段长度18srRNA基因，采用定量PCR检测方法检测的敏感性和特异性分别为67%和100%。

另外，从22名BAL标本烟曲霉培养阴性病人获取标本做定量PCR检测，敏感性为36%[13]。

还有实验室采用实验诱导建立兔IPA模型，然后用定量实时PCR方法进行分析，未处理对照组敏感性和特异性分别为80%和100%，而抗真菌治疗组的敏感性降低到50%[14]。

M.Hummel和B.Spiess等采用一种巢式PCR方法测定病人脑脊液曲霉DNA，靶基因为烟曲霉真菌138bp片段长度18srRNA基因，敏感性和特异性很高。

他们尝试用巢式PCR检测曲霉病病人的脑脊液标本来确定是否有曲霉DNA，这种方法曾经在临床和实验上检测血液和BAL很有效。

虽然脑脊液曲霉病诊断很困难，让人振奋的是使用巢式PCR检测6个脑脊液曲霉病病人标本都为阳性，敏感性100%[15]。

CathalE.OSullivan和MikiKasai等发展了一种基于荧光共振能量转移技术（FRET）的烟曲霉特异性定量实时PCR法，检测标本为实验兔IPA模型BAL和肺组织，靶基因为5.8s区域基因。

FRET定量实时PCR法检测烟曲霉DNA有很高的敏感性和特异性，在不久的将来将用人类标本进一步评估测定该方法[16]。

CatrionaHalliday和QiXuanWu等发展了一种巢式定性实时PCR方法用于探测临床标本中曲霉物种的DNA，这种检验方法比实时PCR法敏感性高，并且应用了低循环控制PCR系统，从而又进一步节省了检测时间[17]。

CorneliaLass-FlorlEberhardGunsilius和JasonP.Trama等研究表明：

抗真菌治疗开始后，全血标本用于做PCR诊断的优点被限制，敏感性降低[18，19]，因此，组织标本被推荐做曲霉PCR检测。

CorneliaLass-Florl和EberhardGunsilius等实验室检测靶基因是一个高度保守序列多拷贝18srRNA。

抗真菌治疗后，病人血标本用来证明病人感染曲霉的PCR敏感性阈值只需40%，而肺组织仍需100%[19]。

KaisuRantakokko-Jalava和SannaLaaksonen等发展了一种探测BAL和组织病理标本中烟曲霉线粒体DNA的实时PCR方法。

伴随定性检测，该方法诊断敏感性为73%，特异性为93%，阳性预测值为73%，阴性预测值为95%[20]。

除了上面简单介绍的几种PCR方法，还有自动化重复序列PCR（rep-PCR）[21],酶免疫测定PCR[22]，快速高通量多路径实时PCR[23]等等.各实验室采用各种改良PCR技术，通过获取临床病例或者实验动物模型，分析不同检测标本如血清、脑脊液、BAL、尿液等等，检测各个靶基因，检测阈值不同，检测敏感性和特异性也各有不同。

值得注意的是，由于PCR易受呼吸道曲霉定植和空气中存在的曲霉孢子的污染、不能判断是活菌还是死菌、某些抗凝血药、DNA释放的非连续性以及实验室存在的实验误差，这些问题往往限制了PCR方法在IPA诊断中的使用[24]。

总之，PCR诊断技术是一项快速、敏感、特异性好的诊断技术，对烟曲霉感染的辅助诊断很有意义。

但是因为各实验室采用的检测方法不一，检测标本来源及靶基因也各有不同，以及采集标本来自抗真菌治疗病人等等影响了烟曲霉感染PCR诊断的重现性和可靠性。

为此，我们迫切需要烟曲霉感染PCR诊断技术的实验规范化。

PCR法的检测结果与真菌感染之间的关系、临床诊断价值以及指导临床抗真菌治疗作用方面，有待进一步研究。

5、其他的诊断方法

除了上述四种烟曲霉感染诊断的常用方法，还有其他的一些诊断方法用于烟曲霉感染的诊断，如：

活检组织菌丝显影法，扩增片段长度多态现象分析法（AFLP[25]，BG试验法[3]等。

伴随烟曲霉感染诊断技术的不断改良，快速、敏感、特异地诊断烟曲霉感染越来越被人们所关注。

各实验室在改良实验技术的同时，通过各种实验技术的结合用于烟曲霉感染的诊断，互补各实验技术的优缺点。

如：

AndreaFrancesconi和MikiKasai等研究表明应用GMEIA和定量实时PCR合并诊断BAL标本中烟曲霉菌特异性抗原和DNA能提高检测的敏感性和特异性，减少诊断时间，从而早期正确使用抗真菌药物，改善烟曲霉菌感染，并且可以防止诊断阴性结果病人的滥用抗真菌药物[7]。

BirgitSpiess和DieterBuchheidt等建立了一种低循环控制实时PCR，其测定方法快速、敏感、特异，能定量化检测高危病人BAL标本和血标本中烟曲霉DNA。

这是一种结合了实时PCR和低循环控制PCR的新型检测方法。

实时PCR的敏感性比低循环控制PCR好，但后者用于检测真菌荷载比前者好，两种PCR方法相结合而成的低循环控制实时PCR法值得我们关注[6]。

CatrionaHalliday和QiXuanWu等结合实时PCR和巢式PCR并应用低循环控制PCR系统发展了一种巢式定量实时PCR检测技术。

这种新型检测烟曲霉感染的PCR技术因为结合了巢式PCR技术比普通实时PCR技术敏感性高，并且比传统的巢式PCR技术快速[17]。

SvetlanaChallier和StephanieBoyer等发展了一种检测血清烟曲霉菌DNA的特异性实时PCR技术结合酶联免疫吸附测定技术能提高侵袭性曲霉病的诊断率[26]。

CorneliaLass-Florl和EberhardGunsilius等评价抗真菌药物治疗期间全血标本的PCR阈值时发现：

一旦标本来源于抗真菌药物治疗后病人，PCR诊断的优点被限制，因此推荐结合使用真菌培养法和显微镜检查法提高真菌检测的敏感性[19]。

结语

随着临床上烟曲霉感染发病率的增多，并且预后极差，死亡率高达80％－90％，迫切需要发展一种快速、敏感、特异、规范化的诊断技术致力于早期发现烟曲霉菌感染，早期治疗烟曲霉感染，以及防止阴性感染结果病人的抗真菌药物滥用。

随着对曲霉菌菌体抗原结构的不断研究，不排除在未来能够发现更具有特异性的曲霉菌抗原成分，并在此基础上开发新型的血清学与分子生物学检测方法，IPA的诊诊断技术的会得到不断提高和规范化。

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