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小结................................................................................................15

参考文献........................................................................................15

胰岛素及其生产应用

摘要

胰岛素（insulin，INS），自1921年由加拿大Toranto大学的Banting发现后，使得糖尿病的治疗成为可能，这是人类历史上最伟大的医学发现之一。

根据其来源或作用时间可分为几大类。

其生产工艺在近些年也得到了很大的提高，使治疗相应的疾病的疗效也得到了大幅度量的提升。

基因工程的发展，更是大幅度的提高了出产胰岛素的质量和数量，给无数糖尿病患者带来了福音。

其生产现在大都采用大肠杆菌发酵提取，创造的经济效益相当可观。

关键词：

胰岛素（insulin,INS）,糖尿病治疗，基因工程，大肠杆菌发酵。

summary

Insulin,Since1921byBantingdiscoveredToranto,CanadaUnversity.makepossibletohavethetreatmentofdiabetes.Thisisoneofthegreatestmedicaldiscoveryinhumanhistory.Accordingtothesourceordurioncanbedividedintoseveralcategories.Theproductiontechnologyhasbeengreatlyimprovedinrecentyears.Correspondingtreatmentthecurativeeffectofdiseasehasbeengreatlyimprove.Thedevelopmentofgeneticengineering.andgreatlyimprovethequalityoftheproduceinsulin,broughttheGospeltomillionsofpeoplewithdiabetes.Theproductionnowmostusede.colifermentationextraction.createconsiderableeconomicbenefit.

Antistop:

insulin,dibetescre,geneticengineering,e.colifermentation.

胰岛素

胰岛素（insulin，INS）自1921年由加拿大Toranto大学的Banting发现后，使得糖尿病的治疗成为可能，这是人类历史上最伟大的医学发现之一，1923年开始临床使用，该研究也因此于1923年获得了诺贝尔奖，1965年我国完成世界上第一个人工合成蛋白质牛结晶胰岛素。

从牛、猪胰岛素到人胰岛素，取得了重大进步，到目前应用胰岛素类似物，给临床带来了更多的益处。

在其问世的最初50年里，临床普遍应用的胰岛素提取自猪和牛的胰腺。

20世纪70年代，人们出于对胰岛素纯度的关注，生产出了高纯度的，即单组分胰岛素；

而80年代初，普通人胰岛素又成为医药商品；

数年之后，即80年代末，人们又应用基因重组技术成功地生物合成了普通人胰岛素。

1.胰岛素及其分类

1.1胰岛素的分类

1.1.1按生产来源分

牛胰岛素：

牛胰岛素是自牛胰腺中提取而来，分子结构有三个氨基酸和人胰岛素不同，疗效稍差，容易发生过敏或胰岛素抵抗。

动物胰岛素的唯一优点是价格便宜，患者可轻松负担。

猪胰岛素：

自猪胰腺中提取而来，分子结构仅有一个氨基酸和人胰岛素不同，因此疗效比牛胰岛素稍好，副作用也比牛胰岛素少。

很多国产胰岛素都属猪胰岛素。

人胰岛素：

人胰岛素并非是从人的胰腺提取而来，而是通过基因工程生产的。

其优点是纯度高，副作用少，但是价格昂贵。

进口胰岛素都是人胰岛素，目前我过也具有用基因工程生产人胰岛素的能力，但其各方便的技术都有待完善。

1.1.2按胰岛素的作用时间分

超短效胰岛素：

起效时间为15分钟，作用高峰期在30～45分钟，持续时间约为2～4小时。

可餐前注射。

皮下注射可随即进餐。

Eg:

诺和锐，优泌乐.

短效胰岛素：

起效时间为20～30分钟，作用高峰期为2～4小时，持续时间为6～8小时。

皮下注射可30分钟后进餐。

优泌乐R，优泌灵R.

中效胰岛素：

起效时间为1.5～4小时，作用高峰期为4～12小时，持续时间为14～20小时。

主要控制第二餐餐后血糖。

常用于胰岛素强化治疗方案中的睡前给药。

用以控制夜间和清晨的空腹血糖。

诺和灵N.

预混胰岛素：

即短效与中效预先混合的胰岛素制剂。

有两种制剂：

短效/中效30/70和50/50。

可满足临床对餐后血糖良好控制及减少注射次数的需要。

常用有诺和灵30R、优泌林30R,万邦林30R、甘舒霖30R

长效胰岛素：

皮下注射后3~4小时起作用，最大作用时间在10~20小时，持续时间24~36小时。

常用的有诺和平（地特胰岛素）长秀霖（甘精胰岛素）来得时（甘精胰岛素）。

1.2胰岛素的结构及性质

1.21结构：

胰岛素由A、B两个肽链组成。

人胰岛素A链有11种21个氨基酸，B链有15种30个氨基酸，共26种51个氨基酸组成。

其中A7（Cys）-B7（Cys）、A20（Cys）-B19（Cys）四个半胱氨酸中的巯基形成两个二硫键，使A、B两链连接起来。

此外A链中A6（Cys）与A11（Cys）之间也存在一个二硫键。

1.2.2性质：

【化学本质〗蛋白质

〖分子式〗C257H383N65O77S6

〖分子量〗5807.69

〖性状〗白色或类白色的结晶粉末

〖熔点〗233℃（分解）

〖比旋度〗-64°

±

8°

（C=2,0.003mol/LNaOH）

〖溶解性〗在水、乙醇、氯仿或乙醚中几乎不溶；

在矿酸（无机酸）或氢氧化碱溶液中易溶

〖酸碱性〗两性，等电点pI5.35-5.45

2.胰岛素的适用症

2.1需终身使用的患者

1型糖尿病；

2型糖尿病经饮食及口服降糖药治疗血糖未达标者；

有严重糖尿病并发症或有其他严重疾病者。

2.2需暂时使用的患者

空腹血糖受损（IFG），糖耐量低减（IGT）糖尿病早期患者；

患急症处于应激状态，血糖难以控制者（如肺炎、骨折、手术等）；

需短期使用血糖升高的药物者（如用肾上腺糖皮质激素）；

妊娠糖尿病经饮食治疗血糖未达标（空腹>

5.8mmol/L,餐后2h>

6.6mmol/L）。

3.胰岛素的生产工艺

3.1早期胰岛素的生产

早期市场上出售的胰岛素是从猪、牛及其他牲畜的胰腺中提取，从100千克原料中仅能生产3～4克，因而成本很高，并且用来治疗还有副作用。

3.2改革后的胰岛素生产工艺

自从基因工程技术研究成功后，可以利用基因工程的方法生产胰岛素。

首先要获取人胰岛素基因，通常是用人工合成的方法合成人胰岛素基因，之后选择大肠杆菌的质粒作为运载体来运载胰岛素基因。

质粒是一个环状的双链结构的DNA分子，它大多存在于细菌的细胞质中，是细菌染色体外的一种遗传物质，它能够在细菌细胞里复制自己，可以自由出入细菌细胞。

有了大肠杆菌质粒作为运载体之后，就选择能切割基因的切刀，这种切刀叫限制性内切酶。

必须要选择同一种限制性内切酶去切割人工合成的人胰岛素基因和质粒，使它们有同一个切点，这样就可以把人工合成的人胰岛素基因接到环状质粒的运载体上，组成重组体，把新组成的重组体再引入大肠杆菌。

这种大肠杆菌和原来的大肠杆菌不一样了，因带有人胰岛素基因，所以称为工程菌。

这种工程菌放进发酵罐里，它的代谢产物就产生出人胰岛素了。

现在市场上的基因工程胰岛素生产法有两种。

（1）美国礼来公司的大肠杆菌表达法；

（2）诺和诺德公司的酵母表达法。

3.3基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素的工艺

3.3.1.提取目的基因；

　获取目的基因是实施基因工程的第一步。

如植物的抗病（抗病毒抗细菌）基因，种子的贮藏蛋白的基因，以及人的胰岛素基因干扰素基因等，都是目的基因。

　　要从浩瀚的“基因海洋”中获得特定的目的基因，是十分不易的。

科学家们经过不懈地探索，想出了许多办法，其中主要有两条途径：

一条是从供体细胞的DNA中直接分离基因；

另一条是人工合成基因。

　　直接分离基因最常用的方法是“鸟枪法”，又叫“散弹射击法”。

鸟枪法的具体做法是：

用限制酶将供体细胞中的DNA切成许多片段，将这些片段分别载入运载体，然后通过运载体分别转入不同的受体细胞，让供体细胞提供的DNA（即外源DNA）的所有片段分别在各个受体细胞中大量复制（在遗传学中叫做扩增），从中找出含有目的基因的细胞，再用一定的方法把带有目的基因的DNA片段分离出来。

如许多抗虫抗病毒的基因都可以用上述方法获得。

　　用鸟枪法获得目的基因的优点是操作简便，缺点是工作量大，具有一定的盲目性。

又由于真核细胞的基因含有不表达的DNA片段，一般使用人工合成的方法。

　　目前人工合成基因的方法主要有两条。

一条途径是以目的基因转录成的信使RNA为模版，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需要的基因。

另一条途径是根据已知的蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的信使RNA序列，然后按照碱基互补配对的原则，推测出它的基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。

如人的血红蛋白基因胰岛素基因等就可以通过人工合成基因的方法获得。

3.3.2.目的基因与运载体结合；

基因表达载体的构建（即目的基因与运载体结合）是实施基因工程的第二步，也是基因工程的核心。

将目的基因与运载体结合的过程，实际上是不同来源的DNA重新组合的过程。

如果以质粒作为运载体，要用一定的限制酶切割质粒，使质粒出现一个缺口，露出黏性末端。

然后用同一种限制酶切断目的基因，使其产生相同的黏性末端（部分限制性内切酶可切割出平末端，拥有相同效果）。

将切下的目的基因的片段插入质粒的切口处，首先碱基互补配对结合，两个黏性末端吻合在一起，碱基之间形成氢键，再加入适量DNA连接酶，催化两条DNA链之间形成磷酸二酯键，从而将相邻的脱氧核糖核酸连接起来，形成一个重组DNA分子。

如人的胰岛素基因就是通过这种方法与大肠杆菌中的质粒DNA分子结合，形成重组DNA分子（也叫重组质粒）的。

3.3.3.将目的基因导入受体细胞；

　将目的基因导入受体细胞是实施基因工程的第三步。

目的基因的片段与运载体在生物体外连接形成重组DNA分子后，下一步是将重组DNA分子引入受体细胞中进行扩增。

　　基因工程中常用的受体细胞有大肠杆菌，枯草杆菌，土壤农杆菌，酵母菌和动植物细胞等。

用人工方法使体外重组的DNA分子转移到受体细胞，主要是借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。

例如，如果运载体是质粒，受体细胞是细菌，一般是将细菌用氯化钙处理，以增大细菌细胞壁的通透性，使含有目的基因的重组质粒进入受体细胞。

目的基因导入受体细胞后，就可以随着受体细胞的繁殖而复制，由于细菌的繁殖速度非常快，在很短的时间内就能够获得大量的目的基因。

3.3.4.目的基因的检测和表达；

目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测与鉴定才能知道。

这是基因工程的第四步工作。

　　以上步骤完成后，在全部的受体细胞中，真正能够摄入重组DNA分子的受体细胞是很少的。

因此，必须通过一定的手段对受体细胞中是否导入了目的基因进行检测。

检测的方法有很多种，例如，大肠杆菌的某种质粒具有青霉素抗性基因，当这种质粒与外源DNA组合在一起形成重组质粒，并被转入受体细胞后，就可以根据受体细胞是否具有青霉素抗性来判断受体细胞是否获得了目的基因。

重组DNA分子进入受体细胞后，受体细胞必须表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了表达过程。

3.3.5.投入生产。

4.胰岛素用药研发进展

4.1肺部给药

4.1.1Exubera胰岛素释药系统：

Exubera由胰岛素粉剂和专用吸入器组成，而胰岛素粉剂是将重组胰岛素和适宜辅料制备的溶液经喷雾干燥后得到的。

患者使用专用吸入器，将雾化的胰岛素经口腔吸入送达肺部。

4.1.2AERx胰岛素糖尿病治疗系统:

AERx胰岛素糖尿病治疗系统将人胰岛素液体气雾剂释至肺深部供全身性吸收。

该系统产生气雾剂细液滴（平均气动力学直径约为2～3μm）,自数以百计激光打的孔经一喷嘴喷出。

吸入的胰岛素起效非常快。

4.1.3AIR肺部释药系统:

AIR释药技术适于将药物释至肺部的干粉装置。

采用许多常用的辅料（如糖类，氨基酸和脂质）制成微粒，粒径为5～30μm，气动力学粒径为1～5μm。

AIR的大几何粒径和小气动力学粒径较其他普通肺部给药制剂具有许多优点：

在相同质量的情况下，大粒子所需分散力较小粒子小得多。

此“易分散性”具有许多潜在的益处。

AIR颗粒的载药量可小于1%或高达90%，导致每次喷出释药范围为几μg至几十g。

由于AIR粉末雾化不需乳糖载体颗粒和过量的粉末，故每次吸入的粉末可多达50mg，远远超过普通干粉吸入剂和定量吸入剂，AIR产品在临床研究中显示其良好的安全性和耐受性。

4.1.4K1-02-212重组胰岛素吸入剂:

正在开发的K1-02-212重组胰岛素吸入剂，用于治疗II型糖尿病。

它采用无辅料呼吸启动的定量吸入剂。

在一项对12名健康志愿者进行的随机研究中，胰岛素喷5次（44.5U）、10次（89U）或15次（133.5U）生物利用度分别为31%、24%和27%。

此胰岛素吸入剂起效快，使用者耐受性好。

4.1.5Aerodose胰岛素吸入剂：

Aerodose为单剂或多剂液体吸入剂，用于肺部释放一系列呼吸系统药物、蛋白质和肽类药物。

产品保持雾化药物在呼吸范围内逾80%，保证其在下呼吸道或肺深部沉积。

由于其气雾剂质优和容易使用，使呼吸系统药物可有效地替代目前的含抛射剂定量吸入剂。

释放大分子药物优于其他肺部释药新技术（如干粉吸入剂）：

降低单位剂量费用、提高剂量重现性和蛋白质稳定性。

病人在任何时间任何地点可舒适地服用胰岛素。

4.2口腔给药

4.2.1Oralin颊用喷雾剂：

Oralin采用GenerexBiotechnology公司的RapidMist释药技术制备的。

喷雾时快速将气体样物质喷入口腔，有味觉但病人可接受。

由于其作用快，Oralin不产生低血糖症。

然而，某些病人需要多次喷（多于6次）方能获得Oralin最佳剂量，此意味着病人可以餐前使用一半剂量，餐后使用另一半剂量。

4.2.2舒临胰岛素口腔喷雾剂：

湖北华工生化工程有限公司研究开发的“舒临胰岛素口腔喷雾剂”经国家食品药品监督管理局批准正在全国10大城市16家权威医院进行III期临床研究。

该公司在生产工艺研究上已进入了中试阶段，并积极为产业生产作好一切准备。

4.3口服给药

4.3.1HIM-2口服制剂：

正在开发治疗II型糖尿病的己基胰岛素单一聚合物（HIM-2）口服制剂，可重复胰腺自然产生的初始大量释出胰岛素：

餐前口服制剂膳后控制血糖和临睡前给药控制整晚和清晨空腹的血糖过多。

将来，I型糖尿病患者亦可采用胰岛素口服制剂与基本的胰岛素制剂结合完全控制膳后血糖浓度。

HIM-2含有助于胰岛素分子吸收和增强释放的聚乙二醇和脂质聚合物。

4.3.2Emisphere口服胰岛素：

Emisphere口服胰岛素维持II型糖尿病患者早期阶段的血糖控制。

此产品病人耐受性好，不会发生注射胰岛素引起的低血糖。

在13例病人研究中，受试者服用2片（300IU/160mg）或安慰剂（Emisphere无药释放系统200mg）1日4次，3餐前和临睡前10min服用，疗程为2周。

服用Emisphere口服胰岛素的病人显示关键试验参数得到改善。

此试验尚不能充分显示其统计上意义，需较大的样本来评价。

4.4鼻腔给药

胰岛素鼻腔给药制剂对志愿者的I期临床研究显示有疗效。

该公司正采用其CPE-215释药技术研发胰岛素喷雾制剂。

CPE-215释药技术增强药物透过皮肤、口腔、鼻腔、阴道和眼内粘膜的吸收。

此技术可应用于多种药物剂型和制剂产品，如乳膏、软膏、凝胶、溶液剂、洗剂、喷雾剂或贴片等。

已有文献记载CPE-215作为食品添加剂和芳香剂对人是安全的，作为药物释药增强剂在临床前研究中进一步证明其安全性。

在胰岛素研究中，志愿者接受胰岛素鼻腔喷雾多达4次，给药后10min内血中胰岛素浓度升高，血药达峰约在20min，约40min回落至给药前的浓度。

4.5透皮施药

4.5.1ViaDerm透皮释药系统：

正在开发透皮释药新方法的以色列生物技术公司。

该公司已成功地完成胰岛素透皮贴片的I期临床研究，正在对43例I型糖尿病患者进行IIa期临床研究。

该公司的透皮释药技术突破，其独特的优点是：

适用于不同性质的大小分子药物，可释放相对较大量的药物。

ViaDerm透皮释药系统显著降低胰岛素用药后的低血糖的发生率和严重度，必要时可中止给药（撕去贴片即可）。

4.5.2PassPortsystem透皮释药系统：

PassPortsystem透皮释药系统，呈现了设计皮肤贴片释放肽类、蛋白质类和小分子药物、基因和疫苗的先进技术。

该系统采用温和的脉冲能量来促进药物透皮释放。

它由含药的多层薄膜组成，使用时贴于皮肤上，再用可反复使用装有电池的手持激活器轻轻给与脉冲能量。

其特点是可增加药物的疗效、安全性和病人的顺应性；

可控制和剂量准确地释药；

无痛，使用方便；

消除使用和处置针头的缺点。

4.5.3微针释药：

美国佐治亚技术大学的科研人员正在开发可靶向皮肤特定层的微观注射释药方法。

此结合皮下注射器与透皮贴片优点的新颖双重释药方法，由数十至数百枚中空显微针（简称微针）组成的1～2cm2的透皮贴片，贴于皮肤可增加药物的渗透性。

100～1000μm长的微针列阵，刺穿皮肤最外层，使微量级药物进入体内。

微针比人头发直径还细，具有足以刺穿角质层的长度。

但其不刺激较深组织内的神经，故无疼痛。

将微针与电子控制的微泵连接可按释药程序快速释药，此微型泵包括可让病人或医务人员控制释药剂量的界面。

此种释药方法最主要的优点是微针和微型泵任何时间均置在体外。

而采用传统释药方法一旦药物进入体内就非常难控制，此种微针释药新技术在病人接受治疗时可定时释药和调节药物

剂量，尤其是调节胰岛素或镇痛药剂量大小特别有效。

胰岛素口服后会在胃肠道降解，肝脏的首过作用需要剂量大，安全性和难以达到稳定的有效血浓度限制其口服用药；

每天注射给药，疼痛给病人带来了痛苦；

普通透皮释药系统受阻于皮表的角质层。

列阵的微针有助于药物穿过皮肤外层进入真皮内的毛细血管。

轻压这些微针可无痛地刺入皮肤，并可多次刺入皮肤而不损坏。

微针使用10s后移去皮肤渗透性增加10000倍，1h渗透性增加25000倍。

　　1）微针与微型传感器和微型驱动器相结合可精密释药；

2）中空微针可抽吸供化验使用的微量体液，如血糖测定，随后提供微升容积的胰岛素或其他治疗药物。

4.5.4粉末喷射给药系统：

粉末喷射给药系统的释药原理与剂型特点是采用经皮释药的粉末喷射手持器具，利用氦气喷射将药物粉末瞬时加速至每秒750米，经皮肤细胞进入体内。

无针头粉末注射器可控制释药深度，且可将抗原物质直接释放至表皮内，这点传统的针头注射是难以办到的。

如在表皮与真皮结