法医物证学各章知识整理.docx
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法医物证学各章知识整理
第二章法医物证分析的遗传学基础
法医物证学：
是以法医物证为研究对象，以提供科学证据为目的，研究应用生命科学技术解决案件中与人体有关的生物检材鉴定的一门学科。
法医物证的特点：
①法医物证的稳定性受环境条件的影响；②法医物证属于“科学证据”。
法医物证学→生物检材→遗传标记→个人识别
遗传（heredity）：
生物繁衍过程中，子代与亲代相似的现象。
变异（variation）：
生物繁衍过程中，子代与亲代有所不同的现象。
遗传标记（geneticmarker，GM）：
个体的单位遗传性状作为标志用于法医物证分析时，这种遗传性状就称为遗传标记。
遗传标记显然具有以下特点：
?
特定性---遗传多态性?
稳定性---终身不变、对环境的耐受性?
反映性---可检测性
遗传性状：
生物体表现出来的形态特征和生理生化特性称为性状。
如果性状的产生是由遗传因素决定的，称为遗传性状。
单位遗传性状是指可检测的、由遗传决定的、并能够以一定的规律从亲代传给下一代的形态学、生理学及分子生物学特征。
基因：
能够表达特定功能的产物，并决定生物特定性状的一段DNA序列。
基因座（locus）：
基因在染色体上的一个特定位置
等位基因:
同一个基因座上的基因可以有不同类型，它们之间存在一级结构的差异，这种有差异的基因称为等位基因
复等位基因：
对群体而言，一个基因座上具有3个或3个以上的等位基因，称为复等位基因，如ABO血型、TH01
基因型：
个体一个或多个基因座的等位基因的组合，是生物体可见性状的实际基因组成。
基因座上的等位基因都是成对存在的。
纯合子：
成对的等位基因相同。
杂合子：
成对的等位基因不同。
表型：
是指生物体某特定基因所表现出的性状。
法医学含义：
1、表型是基因型决定的2、表型是个体基因型检测的结果。
3、型检测的结果可以对未知基因型进行推断。
4、DNA水平的检测结果也是表型。
5、表型可能和真实的基因组成之间存在偏差
孟德尔分离律：
指在生殖细胞通过减数分裂形成配子时，成对的等位基因彼此分离，并独立地分配到不同配子中
自由组合律：
在配子形成时，不同基因座上的非等位基因随机地自由组合，形成子代基因型
先决条件：
各基因座间没有遗传连锁关系。
要求：
选择符合自由组合律的遗传标记
位于不同染色体上
在同一染色体上相距较远的位置
通过群体调查证实没有遗传连锁关系（基因座独立性检验）
母系遗传（线粒体DNA）：
（1）遗传物质位于细胞质中，不受核移植的影响
（2）无有丝分裂和减数分裂的周期变化（3）子代只表达母方的特征
应用：
母系进化研究，缺乏父亲的亲子鉴定，其他
男性伴性遗传（Y染色体DNA）：
（1）Y染色体非重组部分的DNA序列
（2）连锁遗传（以单倍体形式遗传）（3）只遗传给男性子代
应用：
父系进化研究，缺乏母亲的亲子鉴定，性犯罪
连锁（linkage）：
每个染色体上必然集合着许多基因，基因的这种集合叫连锁。
完全连锁（completelinkage）：
同一条染色体上的两个非等位基因，在遗传过程中完全不分离的遗传现象
群体：
包含同一物种所有的个体。
Hardy-Weinberg群体：
在一定地域内一群随机婚配，能实现基因世代传递并保持稳定的许多个体的集群。
genePool（基因库）：
一个群体内所包含的全部基因的总和
遗传多态性（geneticpolymorphism）：
对一个群体而言，控制遗传标记的基因座上存在有2个或2个以上等位基因，并且等位基因的频率大于0.01。
基因频率：
群体中某等位基因数目占该基因座上所有等位基因总数的百分比。
基因型频率：
群体中某基因座上的基因型在全部基因型中所占百分比
表型频率：
就某一性状而言，某一表型在群体中所占百分比
Hardy-Weinberg平衡定律：
①群体无限大；②随机婚配；③没有突变；
④没有大规模的迁移和没有选择因素的影响。
结论是群体中的基因频率和基因型频率在逐代传递中保持不变。
Hardy-Weinberg平衡定律的意义：
1.反映基因频率和基因型频率的关系2.群体样本的检验。
连锁平衡（linkageequilibrium，LE）：
位于不同染色体的基因座，或者位于同一染色体相距较远的基因座之间常常是按照随机原则进行组合的，呈不连锁遗传。
这种基因座之间没有相关性的状态称为连锁平衡
连锁不平衡：
在遗传过程中，如果不同基因座上的等位基因没有按照孟德尔自由组合定律的随机原则组合时，这些基因座的遗传则处于一种连锁不平衡状态。
杂合度（heterozygosity）：
群体中某遗传标记所有基因型中杂合子所占的比例。
个人识别率（probabilityofdiscriminationpower,DP）：
在群体中随机抽取两个体，两者的遗传标记表型不相同的概率。
非父排除概率（excludingprobabilityofpaternity,PE）：
指孩子的非亲生父亲的男子，能够被某个遗传标记系统排除的概率。
第3章DNA多态性的分子基础
DNA的分子结构：
一级结构是指DNA分子中核苷酸的排列顺序（3’,5’-磷酸二酯键，方向：
5’端→3’端）；二级结构是指两条DNA单链形成的双股螺旋结构；三级结构则是指双链DNA进一步扭曲盘旋形成的超级螺旋结构。
寡核苷酸：
是二至几十个核苷酸残基以磷酸二酯键连接而成的线性核苷酸片段。
寡核苷酸可由仪器自动合成，可作为DNA合成的引物（primer）、基因探针（probe）等，在分子生物学研究中具有广泛用途。
探针[probe]：
标记有示踪物的寡核苷酸片段。
通过与靶DNA特异性结合（杂交），检测靶DNA分子。
引物[primer]：
与模板DNA结合，引发DNA的合成反应中合成链的延伸反应。
DNA分子的理化性质：
（一）核酸的高分子性质：
?
粘性?
酸碱性?
紫外吸收
（二）DNA的变性和复性：
?
变性?
复性?
降解④杂交
DNA变性[denaturation]:
在一定条件下，碱基间氢键被打开，互补DNA双链变为两条单链的过程（变性因素：
加热、溶液碱性、有机溶剂）
增色效应:
在热变性的过程中，随变性温度升高，DNA的紫外吸收增强，A260值升高
融链温度（meltingtemperature，Tm）:
融链曲线的中点所示温度。
是一半DNA发生变性时的温度。
Tm的高低反映了DNA分子的热稳定性程度的高低（C+G含量越高Tm越高，高离子强度可以增加溶液中DNA分子的稳定性）。
降解：
DNA分子的共价键断裂，形成多个分子量更小的片段的过程（法医学意义：
高度降解的DNA片段，有可能使待测遗传标记发生破坏，而失去检测的价值）。
DNA复性：
变性因素撤除后，原变性的两条互补单DNA链通过碱基配对重新结合为双链DNA的过程
退火：
加热后变性的DNA在温度降低过程中的复性。
复性的影响因素：
1、复性温度：
①高：
不易形成氢键，不易发生错配，特异性高。
②低：
氢键容易形成，易发生错配，特异性差。
参考温度：
Tm值下25℃
2、离子强度：
离子可以中和单链DNA分子中所带的负电荷，促进单链DNA分子之间的聚合
①高：
错配率高、特异性差②低：
错配率低、特异性高
3、①DNA分子大小②DNA分子序列复杂程度③DNA分子浓度
杂交：
在复性条件下，来源不同、但具有同源性的DNA单链按碱基配对原则形成双链DNA分子的过程。
杂交条件的选择：
杂交条件温度离子强度杂交效果
高强度高低错配率低，特异性高
低强度低高错配率高，特异性差
基因组（genome）：
细胞中所有DNA的总称。
突变：
遗传物质发生可遗传的变异。
端粒（telomere）：
线性形式基因组DNA的末端都有一种特殊的结构，是一段DNA和蛋白质形成的复合结构，叫做端粒。
基因突变的分类：
生物体的基因组DNA并不稳定，经常会出现各种各样的可遗传的改变，在子代留下变异的遗传信息。
在DNA分子水平，DNA损伤的后果之一就是突变（mutation）。
主要分为编码区碱基突变和非编码区突变两种。
①编码区碱基突变：
碱基替代在基因组中是最常见的突变形式，分转换（transition）和颠换（transversion）两种。
②非编码区突变：
非编码区DNA没有表达产物，DNA复制中也能够出现碱基的错配、插入和缺失，但是对细胞正常生理过程不构成实质性影响。
无论在编码区或非编码区，突变的后果从没有效应到有害效应和有利效应，各种情况都会出现。
碱基替换：
碱基转换、碱基颠倒
碱基序列改变
基因突变碱基排列改变：
倒位、易位
碱基数目改变：
插入、缺失、重复
同义突变（samesensemutation）：
是指DNA组成变了，但密码子没有改变，或密码子虽然不同，但编码产生同一种氨基酸，这种突变又称中性突变。
错义突变（missencemutation）：
是指DNA组成改变使编码一种氨基酸的密码子改变成编码另一种氨基酸的密码子。
无义突变（nonsensemutation）：
是指某一碱基的替换使氨基酸密码子变为终止密码，可过早地终止转录，形成无活性的肽链。
移码突变（frameshiftmutation）：
DNA链上插入或缺失一个或n个核苷酸，使下游密码子阅读框发生变化，导致在插入或缺失部位以后的编码发生相应改变。
终止密码突变：
是DNA分子中的某一终止密码突变为编码氨基酸的密码子，从而使多肽链的合成至此仍继续下去，直至下一个终止密码为止，形成超长的异常多肽链。
沉默突变（silentmutation）：
仅改变表达产物的单个氨基酸，对蛋白质的生理功能没有影响的点突变，是形成蛋白质多态性的主要原因。
DNA多态性：
基因组中，由不同碱基构成的等位基因所形成的多态性叫做DNA多态性
DNA长度多态性：
同一基因座上各等位基因之间的DNA片段长度差异构成的多态性
可变数目串联重复序列VNTR：
通常把小卫星DNA中的可变数目串联重复序列称为VNTR
短串联重复序列STR:
把微卫星的可变数目串联重复序列称为短串联重复序列STR。
是目前在法医物证学中应用最广泛的长度多态性遗传标记。
它的重复单位短，仅1-6bp，其长度多态性来源于重复单位串联重复次数的个体差异。
4bp重复的STR基因座最常用。
筛选STR基因座的条件：
①等位基因长度在300bp以下；②重复单位为四核苷酸，不含有插入的非重复单位碱基；③等位基因数8～12个；④基因座杂合度0.8以上，个体识别能力大于0.9；⑤基因频率分别比较平均，没有特别高的或特别低的频率的等位基因；⑥PCR扩增温度，突变率低。
单核苷酸多态性（SNPs）：
在人类基因组范围内，如果任何单碱基突变使特定核苷酸位置上出现两种碱基其中最少的一种在群体中的频率不少于1％，就形成单核苷酸多态性。
第四章DNA长度多态性
限制性片段长度多态性分析（RFLP）：
RFLP分析是一种传统的分子生物学检测技术，广泛应用于突变分析、基因诊断、基因定位等各个方面。
法医物证鉴定应用RFLP技术主要是对人类基因组中的VNTR基因座进行分型，其技术核心是DNA分子杂交，决定RFLP分析图谱个体特异性的因素是限制性核酸内切酶的特异性和探针的特异性。
检测所用的探针多是由人类基因组DNA中筛选出的小卫星序列，选择特异性不同的探针，在不同的杂交条件下，可以只检出单个VNTR基因座，也可同时检出多个VNTR基因座，前者称为DNA纹印，后者称之为DNA指纹，检测所用的相应探针分别被称为单基因探针（single-locusprobe）和多基因探针（multi-locusprobe）。
基本技术：
①DNA提取、纯化和定量②限制性核酸内切酶酶切③电泳分离④印迹转移⑤探针选择—单基因座探针（DNA纹印），多基因座探（DNA指纹）⑥探针标记⑦分子杂交⑧谱带显示
限制性酶选择要求：
①识别序列位于VNTR两侧，尽量靠近VNTR；②酶活性、特异性稳定，反应条件容易控制；③不受基因组DNA是否甲基化的影响。
聚合酶链式反应（PCR）：
类似半保留复制，在体外以基因组DNA为模板，以一对寡核苷酸为引物，dNTP为原料，在TaqDNA聚合酶的催化下，经过变性、退火和引物延伸三步循环使目标片段得到复制百万倍。
PCR反应体系：
①模板DNA，②寡核苷酸引物，③dNTP，④反应缓冲液，⑤TaqDNA聚合酶。
循环参数：
温度、时间
PCR技术特点：
①灵敏度高②特异性高③适用于降解DNA检材④种属特异性好⑤操作简单，时间短⑥仪器自动完成⑦污染⑧样本要求⑨影响因素多
复合扩增：
经过筛选的STR基因座，扩增条件基本相同，可以在同一个PCR体系中扩增多个靶基因座，叫作复合扩增。
应用于法医的STR应满足条件：
①PCR扩增产物长度在300bp以下；②宜选择四核苷酸STR基因组；③选多个STR基因座应不在同一条染色体上；④每个STR基因座等位基因数8-10个左右；⑤基因频率分布均匀，没有高或低频基因出现；⑥杂合度高，最好大于0.80；⑦低突变率<0.2%。
不同DNA长度分析技术比较：
不同DNA长度分析技术综合评价：
STR分型用于法医物证鉴定的主要优点：
1、高灵敏度：
适用于微量降解检材。
2、高鉴别能力：
节约检材、试剂和提高效率。
3、标准化分型：
实现数字化结果，利于实验室间数据交换，建立数据库。
miniSTR：
通过重新设计引物，使其结合在更靠近核心重复区的侧翼序列，从而降低扩增产物的大小，进一步提高灵敏度和分型成功率，这种技术称为短片段STR分型或miniSTR分型。
miniSTR的优势：
?
①STR基因座的扩增片段较短，灵敏度更高，尤其适用于极微量或严重降解生物检材的DNA分型；?
②等位基因片段长度范围较窄，不易发生因小等位基因的优势扩增而造成的等位基因丢失现象；?
③可对多个STR基因座进行复合扩增，从而节约检材、降低成本，提高单次检测的信息量
miniSTR分型的局限性：
1、因扩增片段长度的限制，构建复合扩增体系时只能同时扩增较少的基因座（通常每种颜色的荧光标记的基因座不超过2个）。
要想达到与传统的商品化试剂盒接近的个人识别能力，必须增加复合扩增的次数。
2、miniSTR引物与传统的引物结合区之间若存在碱基的插入和缺失，易导致miniSTR与传统STR分型结果的不一致。
3.若某些STR基因座核心重复区上游或下游侧翼序列存在嘌呤或嘧啶碱基堆积现象，则不利于miniSTR引物设计。
4、当PCR扩增产物过小时，未消耗引物上的染料分子或称“染料污斑”（dyeblobs）可使产物峰变宽、信号变弱。
这种影响在检测降解生物样本时更为明显。
Y-STR有何法医学应用特点：
1、Y染色体为男性特有
2、Y-STR呈父系遗传特征
3、单倍体遗传：
在减数分裂过程中，Y-特异性区不发生重组，所有Y-STR基因座均呈连锁遗传，等位基因频率不能以相乘方法计算
4、GD=PE
5、结果不具有唯一性，不能认定。
其法医学应用价值在于排除
Y-STR分型中需要注意的问题：
①因为X和Y染色体部分序列具有高度相似性，有些Y-STR分型时在X染色体上也能检出扩增产物男性个体可见额外的产物峰，女性个体也可有分型结果。
②部分Y-STR基因座，有时可检出二个或三个等位基因，易被误认为不同男性的混合样本。
第五章STR自动分型
STR自动分型技术的主要步骤：
1、DNA自动化提取2、PCR多色荧光标记STR复合扩增3、PCR产物电泳前处理4、自动毛细管电泳结合激光诱导的荧光检测5、自动数据采集并分型
off-ladder：
在STR分型图谱中，常会遇到部分样本的少量片段峰未被程序化数字命名，在分型图谱中被标识为off-ladder。
漂移作用和新等位基因都可标识为off-ladder
低拷贝DNA（lowcopynumber，LCN）：
是指基因组含量小于100pg的样本。
第六章DNA序列多态性
PCR循环测序的基本原理：
PCR技术能够快速、特异性地扩增靶DNA，应用PCR技术测定DNA序列分为两个步骤：
先利用PCR扩增靶序列片段，制备测序模板，然后再利用PCR直接测定序列。
PCR测序采用了热循环高效合成DNA的特性并结合双脱氧核苷酸终止法，使引物链终止的延伸产物数量在热循环过程中得到增加，因此称为循环测序。
每个测序循环包括：
①PCR扩增制备的模板DNA变性成单链形式；②标记引物与其中的一条链上的互补序列退火；③退火后的引物在耐热DNA聚合酶催化下发生链延伸终止反应。
本次循环产生的模板链与延伸终止链形成的双链的产物，在下一轮测序循环中，再次被变性，释放出模板链，作为又一轮引发反应的模板，同时积累下一轮循环产生的链终止产物。
上述循环步骤重复20~40次，使链终止产物以线性方式获得扩增。
DNA自动测序技术：
DNA自动测序技术是以4种荧光染料基团分别作为4种ddNTP终止链的标记物，于20世纪80年代末期建立的一种高效、快速、自动化的序列测定技术。
4种荧光染料分别作为测序反应中4种ddNTP终止链的标记物，即4种被双脱氧核苷酸终止的DNA片段分别带上4种不同的颜色。
这些DNA片段的混合物同时加在一个样品槽中电泳展开，相互间仅差1个碱基的DNA片段形成一条具有4种颜色的阶梯分布图像。
阶梯中的每-DNA片段由标记在该片段上的特征性荧光基团发出的荧光所指示。
荧光染料基团作为标记物的基本要求是经过激光诱发的吸收光谱波长在可见光波长范围内，不影响延伸反应，不影响标记后DNA片段的电泳性质。
其次要求4种荧光的吸收和激发光波长要有足够的差异，便于检测。
荧光染料的掺入的方式有两种：
一种是将荧光染料预先标记在测序反应通用引物的5’端。
4种荧光标记形成4种标记引物，测序反应分4个反应管进行，特定的荧光染料与相应的ddNTP是对应关系，例如荧光示踪染料JOE标记的通用引物总是与ddATP加在同一个反应管内，因此由ddATP终止的所有延伸链都带有JOE。
这种方式被称为Dye-Primers。
另一种是将荧光染料基团连在ddNTP上，4种荧光染料分别与4种ddNTP底物连接，反应产生的4组DNA片段分别由特定ddNTP所终止，并且标记有4种不同的荧光发色基团，A、C、G和T分别携带有绿、红、蓝、黄4种荧光。
这种方式被称为Dye-Terminators。
两种方式各有特点，不过前者要求A，G，C，T分4个反应进行，而后者的4组反应可以在同一管中完成。
上述两种方法都能确定4种荧光与4种ddNTP所终止的DNA片段之间的对应关系，这是后来从电泳中检测标记物信号以及最终读序的基础。
自动测序仪器无论是变性PAG平板凝胶电泳还是毛细管电泳，都配置有激光束激发系统和荧光信号收集检测系统。
当DNA片段电泳通过检测窗口时，在激光束的激发下，片段的电泳时间和被激发荧光的波长、强度等信号都被记录，由计算机自动作数据处理，最后在屏幕上显示每一样品的各终止片段电泳分离的模拟图像。
不同颜色的峰标示各自标记的碱基及其排列顺序（如图所示）：
MVP（minisatellitevariantrepeat）序列：
称为具有变异核心序列的小卫星DNA，是一类既有长度多态性又有序列差异的DNA重复序列。
线粒体DNA的特点：
①人类线粒体的基因排列得非常紧凑，除与mtDNA复制及转录有关的一小段区域外，无内含子序列。
②mtDNA为高效利用DNA有5个阅读框架，缺少终止密码子，仅以U或UA结尾。
③mtDNA的突变率高于核中DNA，并且缺乏修复能力。
④mtDNA为母系遗传。
⑤部分mtDNA的密码子不同于核内DNA的密码子。
血型（bloodgroup）：
是人类血液由遗传控制的个体性状之一，是血液的遗传标记（geneticmarker）。
红细胞血型是指红细胞表面抗原由遗传决定的个体差异。
化学结构
抗原分布
红细胞膜上
分泌液中
血浆中
糖脂质
HAB、PI
——
Lea、Leb
莫内蛋白
Rh、Kell
——
——
糖蛋白（寡糖+多肽）
MN、HLA
HAB、Lea、Leb
——
蛋白质
——
——
Gm、Km
ABO血型（重点）：
ABO血型系统是最早发现，最重要的血型系统。
人类学与遗传学研究、器官移植，以及法医学实践中的个人识别与亲子鉴定均需应用这个系统。
.
一、ABO血型.4种普通血型的划分及存在相应的抗体.
1.红细胞ABO血型系统的分型。
ABO血型系统分四种型：
即O型、A型、B型与AB型。
.
2.四种血型个体血清中存在的相应抗体：
血清中有天然抗体，B型血清中有抗A抗体；A型血清中有抗B抗体；O型血清中有抗A、抗B及抗A，B等抗体；AB型血清中没有抗体ABO血型抗体恒定地存在于正常人的血清中，可以预测其存在，故称为规则抗体。
.
3.正常的A、B、AB、O型的检测。
利用抗A与抗B血清，以及A与B型红细胞，可以测定未知血液的ABO血型。
.
二、ABO血型抗体.
正常情况下，凡红细胞没有某一种或某两种ABO抗原，又无明显的外来A或B抗原的刺激，其血清中含有与红细胞上缺失抗原相对应的天然抗A、抗A1或抗B抗体。
.
（一）抗A、抗B抗体的生成.
新生儿血中的IgG抗A与抗B抗体多来自母体，故一般不对新生儿进行血型测定。
3～6个月以内的婴儿，多数尚未产生抗A与抗B抗体；6个月以后，抗体逐渐产生；5～10岁抗体效价达最高峰；随着年龄的增长，抗体效价逐渐降低，老年人抗体水平明显地低于年轻的成年人。
.
（二）抗A、抗B抗体的特性.
1、抗A与抗B抗体最显着的血清效应是凝集反应，在适当的条件下也可以发生溶血反应；.
2、ABO血型测定都在室温中（22～25℃）进行，偶尔在4℃下进行；.
3、抗A和抗B抗体可以是天然的，也可以是免疫抗体；.
4、B型与A型血液中的天然抗A与抗B抗体大多数是IgM；.
5、天然IgM与IgG抗A与抗B抗体均能在盐水介质中使红细胞发生凝集反应，在室温中具有抗体活性。
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（三）抗H抗体.
由于O、A、B或AB型红细胞结构上含有H成分，故其血清中很少有抗H抗体。
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三、ABO血型的遗传.
（一）各种不同表型的双亲所生子女的血型。
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（二）ABO血型按孟德尔规律遗传.
ABO血型系统按孟德尔定律遗传，人类染色体上的一个座位为.A、B、O.三个等位基因之一所占，每一个体有一对染色体，一条来自父亲，另一条来自母亲，红细胞ABO型的表达由基因决定。
ABO血型有4种普通型，由复等位基因.A、B及O.所控制，有6种基因型，决定4种表现型。
四种表现型、六种基因型，一个基因座位，三个等位基因。
.
何谓ABO血型的正反定型？
①正定性试验：
根据RBC与特异性抗体的反应来分型，即用抗A抗体判定A抗原，用抗B抗体判定B抗原。
②反定型试验：
依据血清中的凝集素与标准型RBC膜上的凝集原反应的性质，即用标准的A型RBC判定抗A抗体，用标准的B型RBC判定抗B抗体，同时也应用抗H抗体判定H抗原。
试述ABO血型的DNA分型方法
1PCR-SSP序列特异性引物PCR技术：
特异性强、重复性好；②PCR-RFLP。
Rh血型：
凡是人体血液红细胞上有Rh凝集原者，为Rh阳性。
反之为阴性。
这样就使已发现的红细胞A、B、O及AB四种主要血型的人，又都分别一分为二地被划分为Rh阳性和阴性两种。
在中国，Rh阴性血型只占千分之三到四。
RH阴性A型、B型、O型、AB型的比例是3：
3：
3：
1。
Rh血型鉴定：
RhD抗原分布：
Rh血型鉴定一般指Rh系统中D抗原的检测，根据病人红细胞是否带有D抗原分为Rh阳性和Rh阴性。
Rh血型鉴定正常值：
①Rh+，称作“Rh阳性”、“Rh显性”，表示人类红细胞
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