分子与基因工程生物技术复习题重点Word文件下载.docx
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在trp
mRNA
5'
端trpE基因的起始密码前有一个长162bp的mRNA片段被称为前导区,研究发现,当mRNA合成起始以后,除非培养基中完全没有色氨酸,转录总是在这个区域终止,产生一个仅有140个核苷酸的RNA分子,终止trp基因转录.因为转录终止发生在这一区域,并且这种终止是被调节的,这个区域就被称为弱化子.
Trp操纵子转录终止的调控是通过弱化作用实现的。
当培养基中色氨酸的浓度很低时,负载有色氨酸的tRNATrp也就少,这样翻译通过两个相邻色氨酸密码子的速度就会很慢,当4区被转录完成时,核糖体才进行到1区（或停留在两个相邻的trp密码子处）,这时的前导区结构是2-3配对,不形成3-4配对的终止结构,所以转录可继续进行,直到将trp操纵子中的结构基因全部转录
7、Southernblotting和Northernblotting的实验原理、目的及主要实验步骤。
S：
目的：
是研究DNA图谱的基本技术，在遗传病诊断、DNA图谱分析及PCR产物分析等方面有重要价值。
原理：
根据毛细管作用的原理，使在电泳凝胶中分离的DNA片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过同标记的单练DNA或RNA探针的杂交作用检测这些被转移的DNA片段。
步骤：
待测核酸样品的制备→待测DNA样品的电泳分离→凝胶中核酸的（碱）变性→southern印迹→southern杂交→杂交结果检测
N：
主要用于分析检测特异性RNA。
Northern杂交是利用DNA可以与RNA进行分子杂交来检测特异性RNA的技术，首先将RNA混合物按它们的大小和分子量通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，分离出来的RNA转至尼龙膜或硝酸纤维素膜上，再与放射性标记的探针杂交，通过杂交结果可以对表达量进行定性或定量。
RNA混合物进行琼脂糖凝胶电泳→分离得到的RNA转膜→与放射性标记的探针杂交→结果分析。
8、“生物进化过程中，最早出现的生物大分子是RNA，而不是DNA和蛋白质，即在进化某个阶段有一个RNA世界”这一观点已被普遍接受，谈谈对这一观点的认识。
最早出现的简单生命体中的生物大分子，应是既具有信息载体功能又具有酶的催化功能，因此，最早的生物大分子。
进化之初是"
RNA的世界"
，RNA可以一身二任，既能保存信息，又能提供酶活性，因此仅有RNA也足以把早期的进化引向新的阶段。
9、为实现外源基因在原核生物中高效表达，应考虑哪些因素？
启动子（启动子要有可控性，用启动能力强的启动子）
终止子（用终止作用强的终止子）
核糖体结合位点（用含有与启动子来源相同的核糖体序列结合位点）
密码子（解决密码子的偏爱性）
质粒拷贝数（重组质粒的扩增要可控）
10.描述DNA滚环复制过程及其特征。
环状DNA可以采取上述典型的DNA复制方式进行复制，即从复制起点开始，双向同时进行，形成θ样中间物，故又称"
θ"
型复制，最后两个复制方向相遇而终止复制。
但有些环状DNA采用另个一种方式，即滚环复制。
例如许多病毒DNA的复制、F因子在接合（conufgation）转移时其DNA的复制，以及许多基因扩增时都采用这种方式。
在以这种机制进行的复制中，亲代双链DNA的一条链在DNA复制起点处被切开，其5'
端游离出来。
这样，DNA聚合酶Ⅲ便可以将脱氧核糖核苷酸聚合在3'
-OH端。
当复制向前进行时，亲代DNA上被切断的5'
端继续游离下来，并且很快被单链结合蛋白所结合。
因为5'
端从环上向下解链的同时伴有环状双链DNA环绕其轴不断的旋转，而且以3'
-OH端为引物的DNA生长链则不断地以另一条环状DNA链为模板向前延伸，因而称为滚环复制。
由于只有一条DNA链是完整的，因而在DNA解链时不会产生拓扑学上的问题，即未解链的双螺旋区不会产生超螺旋。
当5'
-端从环上解下来后不久，即与单链结合蛋白结合，以后可移动的引发体便在其上形成，以引发RNA引物的合成，然后由DNA聚合酶Ⅲ催化合成冈崎片段。
这个过程与前述的DNA滞后链的合成一样。
最后由DNA聚合酶Ⅰ切除RNA引物，并填充间隙构成完整的DNA链。
端所以能从环上不断解链，主要是由于DNA聚合酶Ⅲ及引发体构成的复制体中的螺旋酶不停的向前移动所致。
在这种复制方式中，DNA的延伸可以一直进行下去，产生的DNA链可以是亲代DNA单位长度的许多倍。
这么长的DNA链是如何转变为单位长度的DNA分子的，目前尚不清楚。
可能是由特异的内切酶切开产生单位长度的子代DNA。
这些DNA可自身环绕，或保持线性分子状态
特点
（1）以亲本链（+链）为模板合成互补的环状负链，形成闭合环状的复制形RF1；
（2）以成环滚环复制产生多个子代RF；
（3）以RF的负链为模板进行滚环复制产生多拷贝正链单环。
11．一个基因如何产生两种不同类型的
mRNA分子？
一个基因可以有两种方式产生一种以上的mRNA.第一种是：
一个转录初级产物含有一个以上的多聚腺苷化位点，就能产生一种以上的具有不同3’末端mRNA。
第二种是：
如果一个初级产物含有几个外显子，发生不同的剪接就会产生多种mRNA.。
12．在一个克隆基因的分析中发现：
一个含有转录位点上游3.8kb
DNA的克隆，其
mRNA直接转录活性比仅含有3.1kb上游
DNA克隆的转录活性大50倍。
这表明了什么？
在转录位点上游3.8—3.1kb之间有一个增强子。
13.列举原核生物同真核生物转录的差异。
真核生物中编码蛋白质的基因通常是间断的、不连续的,由于转录时内含子和外显子是一起转录的,因而转录产生的信使RNA必须经过加工,将内含子转录部分剪切掉,将外显子转录部分拼接起来,才能成为有功能的成熟的信使RNA.而原核生物的基因由于不含有外显子和内含子,因此,转录产生的信使RNA不需要剪切、拼接等加工过程.
原核生物基因的转录和翻译通常是在同一时间同一地点进行的,即在转录未完成之前翻译便开始进行.如大肠杆菌乳糖分解代谢过程中,三个结构基因的转录和翻译就是同时在细胞质中进行的.真核生物由于有细胞核,核膜将核质与细胞质分隔开来,因此,转录是在细胞核中进行的,翻译则是在细胞质中进行的.可见,真核生物基因的转录和翻译具有时间和空间上的分隔.上述真核生物基因转录后的剪切、拼接和转移等过程,都需要有调控序列的调控,这种调控作用是原核生物所没有的.
14．简述乳糖操纵子的结构和功能。
①乳糖操纵子的组成：
大肠杆菌乳糖操纵子含Z、Y、A三个结构基因,分别编码半乳糖苷酶、透酶和半乳糖苷乙酰转移酶,此外还有一个操纵序列O,一个启动子P和一个调节基因I.
②阻遏蛋白的负性调节：
没有乳糖存在时,I基因编码的阻遏蛋白结合于操纵序列O处,乳糖操纵子处于阻遏状态,不能合成分解乳糖的三种酶；
有乳糖存在时,乳糖作为诱导物诱导阻遏蛋白变构,不能结合于操纵序列,乳糖操纵子被诱导开放合成分解乳糖的三种酶.所以,乳糖操纵子的这种调控机制为可诱导的负调控.
③CAP的正性调节：
在启动子上游有CAP结合位点,当大肠杆菌从以葡萄糖为碳源的环境转变为以乳糖为碳源的环境时,cAMP浓度升高,与CAP结合,使CAP发生变构,CAP结合于乳糖操纵子启动序列附近的CAP结合位点,激活RNA聚合酶活性,促进结构基因转录,调节蛋白结合于操④纵子后促进结构基因的转录,对乳糖操纵子实行正调控,加速合成分解乳糖的三种酶.协调调节：
乳糖操纵子中的I基因编码的阻遏蛋白的负调控与CAP的正调控两种机制,互相协调、互相制约.
15.简述遗传密码的兼并性和摆动假设。
遗传密码普遍存在与生物界中，由一种以上的密码子编码同一个氨基酸的现象称为遗传密码的兼并性。
遗传密码的摆动性，密码子与反密码子配对，有时会出现不遵从碱基配对规律的情况，称为遗传密码的摆动现象。
这一现象更常见于密码子的第三位碱基对反密码子的第一位碱基，二者虽不严格互补，也能相互辨认。
tRNA分子组成的特点是有较多稀有碱基，其中次黄嘌呤（inosine,I）常出现于反密码子第一位，也是最常见的摆动现象。
16.何谓真核生物断裂基因？
说明其结构并论述其转录表达的过程及调控。
真核生物的断裂基因由若干个编码区和非编码区互相间隔开但又连续镶嵌而成。
能编码蛋白质的基因称为外显子，不能编码蛋白质的基因称为内含子。
转录表达的过程：
第一步合成原始转录产物（过程包括转录的启动、延伸和终止）；
第二步转录产物的后加工，使无生物活性的原始转录产物转变成有生物功能的成熟RNA。
第三布核糖体结合到mRNA上，由tRNA携带氨基酸合成多肽链
调控：
转录水平调控：
顺式作用元件与反式作用因子相结合进行调控
转录后调控：
5端加帽子，3端加PolyA尾。
mRNA的选择剪接。
RNA干扰现象
翻译水平调控：
5端帽子结构的甲基化，翻译起始因子的调控
17.试述DNA克隆的基本流程，并列举两种阳性克隆筛选的方法。
过程：
一个完整的DNA克隆过程应包括：
目的基因的获取，基因载体的选择与构建，目的基因与载体的拼接，重组DNA分子导入受体细胞，筛选并无性繁殖含重组分子的受体细胞（转化子）。
筛选方法：
1蓝白斑筛选
野生型大肠杆菌（E.Coli）产生的β-半乳糖苷酶可以将无色化合物X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）切割成半乳糖和深蓝色的物质5-溴-4-靛蓝，使菌落呈现蓝色。
重组后的大肠杆菌不能产生β-半乳糖苷酶，因此不会产生5-溴-4-靛蓝，菌落成白色。
2抗药性筛选:
将抗药性基因与目的基因一同接入到载体中，然后转入受体细胞。
在培养基中加入相应的药性物质，能生长的菌株就是含有目的基因的菌落，不含目的基因的菌株不能生长。
18.简述位点特异性重组的机理
位点特异性重组（site-specificrecombination）是遗传重组的一类。
这类重组依赖于小范围同源序列的联会，重组也只发生在同源的短序列的范围之内，需要位点特异性的蛋白质分子参与催化，重组的蛋白不是rec系统而是int等，如噬菌体l的定点插入。
重组时发生精确的切割、连接反应，DNA不失去、不合成。
两个DNA分子并不进行对等的交换，有时是一个DNA分子整合到另一个DNA分子上（插入重组）。
19.简述乳糖操纵子中各种结构元件及其所起的作用。
调节基因，产生阻遏蛋白
启动子，使RNA聚合酶结合到DNA链上并且完成起始反应
操纵基因，控制一个邻近基因或基因群的表达
结构基因y，z，a。
分别编码产生β-半乳糖苷酶，半乳糖苷透过酶，半乳糖甘转乙酰酶
20.简述鸟枪法测序的基本原理和过程。
将目的DNA随机地处理成大小不同的片段，再将这些片段的序列连接起来。
（1）.使用限制性内切酶将带有目的基因的DNA链切成若干小段。
（2）.再使用DNA连接酶将其整合到载体的基因中,并使其表达。
（3）.如果在某个细胞中得到了目的产物,就说明整合到该细胞中的DNA片段就是所需要的DNA片段。
21.作为载体应该具备哪些基本条件？
作为运载体必须具有三个条件：
①在宿主细胞中能保存下来并能大量复制；
②有多个限制酶切点，而且每种酶的切点最好只有一个，如大肠杆菌pBR322就有多种限制酶的单一识别位点，可适于多种限制酶切割的DNA插入；
③有一定的标记基因，便于进行筛选。
22.简述哺乳动物外源基因转入受体细胞的方法。
磷酸钙共沉淀法，电击转化法，脂质体介导法，显微注射法，血影细胞介导法
23.试论述现阶段生产人胰岛素的方法
答：
基因工程法制人的胰岛素
1A链和B链分别表达法
2A连和B链同时表达法
3人胰岛素原表达法
4分泌型重组人胰岛素表达法
5以酵母为受体分泌表达人胰岛素，胰岛素基因前端可加一个信号肽编码序列，这个信号肽引导合成的胰岛素分泌到周围的培养基中，简化了纯化过程，最后通过酶学反应使之变成人胰岛素。
（P375基因工程+讲义）
24.试述细菌适应于外界营养环境的分子调控机制？
1如乳糖操纵子的CＡＭＰ＿ＣＲＰ的正调节，当环境中葡萄糖存在时，细菌直接利用葡萄糖，细菌的ｃＡＭＰ水平低，且CAP以二聚体形式存在；
当环境中葡萄糖缺乏时，CAMP升高结合CAP，其CAP－CAMP复合物乳糖启动子上游，诱导DNA90度弯曲，增强RNA聚合酶结合启动子的能力，使转录增强５０倍从而分泌酶加速乳糖分解为葡萄糖，供细胞进行利用。
2如色氨酸操纵子的阻遏系统，若外界色氨酸量充足，则它与游离的辅阻遏蛋白相结合，并使之与操纵区的DNA紧密结合，使色氨酸表达受阻；
若外界的色氨酸供应不足时，则辅阻遏物失去色氨酸并从操纵区解离，色氨酸操纵子去阻遏，开始表达色氨酸。
（P264）
25.试说明基因组DNA产生重复序列的可能机制。
1复制滑动扩增2滚环扩增3不等交换4碱基置换突变等
26.简述原核生物的RNA聚合酶各亚基的功能。
σ亚基与RNA聚合酶的四聚体核心（α2ββ'
）的形成有关;
β亚基含有核苷三磷酸的结合位点;
β'
亚基含有与DNA模板的结合位点;
而Sigma因子只与RNA转录的起始有关，与链的延伸没有关系，一旦转录开始，σ因子就被释放，而链的延伸则由四聚体核心酶（coreenzyme）催化。
27.简述色氨酸衰减子结构及其调控方式。
阻遏作用trp操纵子转录起始的调控是通过阻遏蛋白实现的。
产生阻遏蛋白结合于trp操纵基因特异序列，阻止转录起始，但阻遏蛋白的DNA结合活性受trp调控，再有高浓度trp存在时，阻遏蛋白色氨酸复合物与色氨酸操纵子紧密结合，可以阻止转录。
当trp水平低时，阻遏蛋白以一种非活性形式存在，不能结合DNA。
在这样的条件下，trp操纵子被RNA聚合酶转录。
trp生物合成途径被激活。
……弱化作用：
trp操纵子转录终止的调控是通过弱化作用实现的，大肠杆菌trp操纵子前导区的碱基序列包括4个片段，能以两种不同的方式进行碱基配对，当trp浓度很低时，翻译通过两个相邻色氨酸密码子的速度很慢，这时的前导区结构是2-3配对，不行成3-4配对的终止结构，所以转录可继续进行。
当trp浓度很高时，核糖体可顺利通过两个相邻的色氨酸密码子再4区被转录之前，核糖体就到达2区，这样使2-3不能配对，3-4区可以配对，行成终止结构，转录停止
28.简述影响翻译水平高低的因素有哪些？
1、SD序列（核糖体结合位点）被封闭
2、小RNA作用于目标mRNA,使其降解或不能翻译
3、缺少某种氨基酸时,tRNA空载
4、密码子偏爱性
29.简述原核生物反式作用因子的结构域特征。
第六章ppt
反式作用因子含有两种不同的结构域
a.dna结合结构域1螺旋-反转-螺旋2锌指3基域（通常以二聚体结合于dna上0、）
b.转录激活结构域（功能域）1酸性激活域2谷酰胺丰富域3脯氨酸丰富域
阻遏域：
专一性的直接阻遏的结构域
30.简述Ⅱ型限制性内切酶的命名方式及特征。
ppt11章
属名+种名+株名
Ⅱ型限制性核酸内切酶的特点是：
一般能识别和切割4~8个碱基对的核苷酸序列；
大多数识别序列具有回文结构；
没有甲基化修饰酶功能。
Ⅱ型限制性核酸内切酶的切割方式有三种：
切割产生5'
突出的粘性末端；
切割产生3'
切割产生平头末端
31.试述利用原核表达载体进行外源基因表达的基本思路及方法步骤。
（XX百科）
获得目的基因，
（1）通过PCR方法：
以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。
（2）通过RT-PCR方法：
提取总RNA，以mRNA为模板，逆转录形成cDNA第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。
构建重组表达载体
（1）载体酶切：
将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。
（2）PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体
获得含重组表达质粒的表达菌种
（1）将连接产物转化大肠杆菌DH5α，根据重组载体的标志（抗Amp或蓝白斑）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。
（2）测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确,进入下步操作。
否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。
（3）以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞。
32.试述真核生物基因表达调控的多层次性。
ppt第七章
染色体水平的调控组蛋白对基因活性的影响，组蛋白的乙酰化-去乙酰化，非组蛋白的调节，核基质的调控作用，基因丢失，基因扩增，基因重排
dna水平dna甲基化
转录水平rna聚合酶的活性，顺式作用元件，反式作用因子
转录后水平5’短加帽和polyA尾的调控意义，mrna的选择剪接，mrna运输的控制，rna干涉
翻译水平5'
端UTR结构与翻译起始的调节，5’帽子结构的甲基化，翻译起始因子的调控
蛋白质加工和降解水平新生肽链的水解，肽链中氨基酸的共价修饰，通过信号肽分拣、运输、定位
33.说明启动子突变会导致基因表达发生变化的可能情况？
启动子突变可能会提高、降低或不影响基因的表达量。
1启动子突变提高基因的表达量。
例子就是TERTpromoter突变与人类癌症的关系。
TERT启动子的突变在多种癌症中都广泛存在，超过一半的膀胱癌患者都携带这种突变。
在对黑色素瘤的研究过程中发现TERT启动子的突变可以使TERT基因的转录水平提高2-4倍。
2启动子突变降低基因的表达量。
例子就是在一项对HD（亨廷顿氏病Huntington'
sDisease）基因的启动子研究中,当把HD基因转录起始位点上游−126到−141这一段DNA删除后，HD基因的表达量显著下降。
3.启动子突变不影响基因的表达量。
启动子里的突变是很多的，而且不同个体间的差异是很大的，从没有突变到3000+突变都有。
但是大部分个体间的基因表达谱差异却不是很大，所以应该说大部分启动子内部的突变对基因表达的影响是微乎其微的。
34.简述基因工程的应用。
1．生物反应器通过基因工程可以大量生产所需要的生活活性物质，这个反应器的工厂可以是微生物，可以是动物细胞或转基因动物，也可以是转基因植物。
2、遗传改良植物方面可以培育出抗虫、抗病、增进品质的作物新品种；
动物方面可以提高其生长、生殖或抗逆性等性能；
微生物方面可以获得增强性能的生物杀虫剂、抗病剂、新型抗生素、土壤改良剂和环境净化剂等。
3、基因治疗将健康基因移植到相关组织或细胞可使遗传患者的症状减缓甚至消失。
35.简述DNA损伤后的修复类型有哪些？
1、错配修复一旦在DNA复制过程中发生错配，细胞能通过准确的错配修复系统识别新合成链中的错配并加以校正，DNA分子链中的错配几乎完全能被修复。
2、切除修复切除修复分为碱基切除修复和核苷酸切除修复两类，切除修复功能广泛存在于原核生物和真核生物中，也是人类的主要修复方式,啮齿动物（如仓鼠、小鼠）先天缺乏切除修复的功能。
3、重组修复机体细胞对在复制起始时尚未修复的DNA损伤部位可以先复制在修复，即先跳过该损伤部位，在新合成的链中留下一个对应于损伤序列的缺口，该缺口由DNA重组来修复：
先从同源DNA母链上将相应核苷酸序列片段移至链缺口处，然后再用新合成的序列补上母链空缺。
4、DNA的直接修复是把损伤的碱基回复到原来状态的一种修复，不需要切除碱基或核苷酸。
5、SOS反应细胞DNA受到损伤或复制系统受到抑制的紧急情况下，细胞为求生存而产生的一种应急措施。
SOS反应包括诱导DNA损伤修复、诱变效应、细胞分裂的抑制及溶原性细菌释放噬菌体等，细胞癌变也与SOS反应有关。
36.阐述蓝白斑筛选的原理及其应用。
现在使用的许多载体都带有一个大肠杆菌的DNA的短区段，其中有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。
在这个编码区中插入一个多克隆位点（MCS），它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞。
因此，宿主和质粒编码的片段虽都没有活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。
这样lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。
然而，当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致无α-互补能力的氨基酸端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。
这种重组子的筛选，又称为蓝白斑筛选。
应用于基因工程中重组子的筛选。
37.列举基因工程中常用的工具酶有哪些？
限制性核酸内切酶：
识别双链DNA分子中的特定序列，并切割DNA双链主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来DNA的入侵细菌的限制与修饰作用；
DNA连接酶：
修复双链DNA上缺口处的磷酸二酯键；
修复与RNA链结合的DNA链上缺口处的磷酸二酯键；
连接多个平头双链DNA分子；
DNA聚合酶
核酸酶
核酸修饰酶
38.简述用于高等哺乳动物细胞基因转移的方法。
哺乳动物细胞的物理转化法：
利用物理方法转化高等哺乳动物细胞的主要优点是外源基因表达盒中不含任何病毒基因序列，这对外源基因表达产物的分离纯化减轻了负担。
（磷酸钙共沉淀法；
电击转化法；
脂质体介导法；
显微注射法；
血影细胞介导法）
哺乳动物细胞的病毒转染法:
以病毒DNA为载体可以将外源基因直接转染或与野生型病毒颗粒共转染特定的受体细胞。
39.论述原核生物基因表达调控的机制。
遗传信息有序地传递到蛋白质或功能RNA分子的过程就称为基因表达。
对该过程的调节就称为基因表达调控。
操纵子调控：
（1）乳糖操纵子含Z、Y及A三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶，透酶，半乳糖甘转乙酰转移酶，此外还有一个操纵子0、一个启动序列P及一个调节基因I，在P序列上游还有一个-CAP结合位点，由P序列，0序列，CAP结合位点共同构成乳糖操纵子的调控区，三个编码基因由同一个调控区调节。
乳糖操纵子调节机制可分为三个方面：
（a）阻遏
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