蚯蚓纤溶酶项目可行性分析报告Word下载.docx

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蚯蚓在保护环境和解决污染方面的应用也不容低估。

目前各国正积极研究利用蚯蚓来处理城市生活垃圾以及造纸、酿酒、屠宰、制革、食品加工等产生的费液及残渣。

由于蚯蚓广泛应用于改良土壤、净化环境、兽用饲料、食品制药及日用化妆品等。

最近几年，人工养殖蚯蚓、开发利用蚯蚓的热潮正席卷全球。

2．蚯蚓纤溶酶的研究进展

2.1纤溶酶的分离纯化

蚯蚓提取物药用历史已达数千年，但由于科学技术的局限，人们并不清楚是什么有效成分在起作用。

日本H.Mihara于1982年首次报道了从蚯蚓（Lumbricusrubellus）中提取出一种具有纤溶活性的酶，命名为蚓激酶（Lumbrinonase）。

1991年，Mihara等再次报道其从L.rubellus中提取出一组具有强纤溶活性的蚓激酶成分，分子量为20～30kD，PI值为34,此酶具有热稳定性和在广泛的pH范围内保持活性，其对提取的蚓激酶纯化后获得生化性质不同的3个片段，此3个片段可进一步分离,片段I可分离为F-I-0，F-I-1和F-I-2，片段Ⅱ不能再分离，片段Ⅲ可分离为Ｆ-Ⅲ-1和Ｆ-Ⅲ-2。

1993年Mihara所在的实验室对其分离到的六种蚓激酶成分进行理化性质鉴定，对经过凝胶过滤层析提纯后的酶蛋白进行SDSPAGE电泳,测定六种酶分子的分子量分别为29662、29667、24664、24220、24196和23013（F-I-0，F-I-1，F-I-2，F-II，F-Ⅲ-1和F-Ⅲ-2）。

各个酶分子对应的PI值分别为3.40，3.60，4.20，4.00，4.30和4.85。

各个酶是一条单一的多肽链,全部酶蛋白都不含有糖成分。

在pH2～11和最高不超过60℃的条件下稳定。

对其底物特异性及酶活抑制的研究表明，此类酶为类碱性胰蛋白丝氨酸蛋白酶，其Ｎ端序列与类胰蛋白酶有局部相似性，从氨基酸测序、氨基酸组成分析和免疫原性分析结果来看，此六种酶是来自至少4个基因的同工酶。

随后国内外多个实验室也开展了蚓激酶的纯化研究，分离纯化技术日趋成熟。

目前常用的分离步骤是:

制备蚯蚓匀浆→盐析→凝胶层析→离子交换层析→ＨＰＬＣ或ＦＰＬＣ纯化。

通过以上步骤可获得较高纯度的多个组分的蚯蚓纤溶酶，目前临床应用的蚯蚓纤溶酶大多采用这种方法和改进方法分离纯化的。

1990年程牛亮等从双胸蚓（Lumbircidaebimastus）中分离出一种分子量为29KD的蚯蚓纤溶

酶，由一条肽链组成，具有强烈的溶解纤维蛋白的作用，对家兔实验性血凝块也有明显的溶

解作用。

1993年，韩国Ryu等用Mihara的方法从Lumbricusrubellus蚯蚓中提取出由六个成分组成的具有强纤溶活性的蚓激酶成分,此六种酶有不同的纤溶活性。

1997年邢宝东等从Eiseniafetida蚯蚓匀浆中分离得到EFE-D，从其N端氨基酸序列及其它生化特性可以看出该酶与Nakajima等（1993）的F-II同源，该酶具有热稳定性。

1998年克罗地亚的Hrzenjak等报道从Eiseniafetida蚓的匀浆中分离到一组含有糖脂蛋白的纤溶活性成分,并命名为Ｇ－90。

此混合物包含二种有纤溶活性和抗凝活性的丝氨酸蛋白酶（PI和PII），PI分子量为，PII分子量为，两者都具有较高的纤溶活性和抗凝活性，但PI高于PII，PI可以自动降解成PII，两者除可以直接溶解纤维蛋白外，还能激活纤溶酶原从而间接起到纤溶作用。

1998年赵晓瑜等利用亲和层析技术从Lumbricusrubellus蚯蚓中分离出至少九种纤溶酶组分，经分析，这些纤溶酶是一组非均一的糖蛋白，含糖量为5％，以中性己糖为主，这与Mihara等（1991）结果不一致。

1998年杨嘉树等从Eiseniafetida蚓体内分离纯化出一种可体外激活纤溶酶原从而间接降解纤维蛋白的蚓激酶（e-PA），该酶是由二个亚基通过疏水相互作用维系在一起的，用凝胶过滤层析法测得全酶的分子量为45KD；

用质谱法测得的大、小亚基的分子量分别为24556.7D和15546.6D，全酶具有很强的纤溶活性。

单独的大亚基只有较弱的纤溶活性,而单独的小亚基没有任何可见的纤溶活性，很可能小亚基是一个调节亚基，大亚基是催化亚基。

2003年Wang等从Eiseniafetida蚓中纯化得到七种纤溶酶组分EFE-a，EFE-b，EFE-c，，EFE-dEFE-e，EFE-f和EFE-g，分子量为23-30kD，而PI为3.4－4.0，从分子量、等电点、N端氨基酸序列以及纤溶活性等特性可以看出EFE-b，EFE-c和EFE-g与Lumbricusrubellus蚯蚓的F-III-1或F-III-2相对，EFE-a与F-II相对，如图1和2所示。

图1：

Nakajima等（1993）分离的六种EFE成分，a-f分别代表F-Ⅲ-1和F-Ⅲ-2F-II，F-I-2，F-I-1和F-I-0

图2Wang等（2003）分离的七种EFE成分，2－8分别代表EFE-a,b,c,d,e,f,g

2004年Cho等（a）也从Lumbricusrubellus蚯蚓中分离纯化出了六种纤溶酶组分F1-F6，酪蛋白水解活性F2>

F1>

F5>

F6>

F3>

F4，而纤维蛋白原水解活性则是F6>

F2>

F4，其中F1-F4受PMSF抑制，而F5-F6则受其它一些抑制剂抑制，而且F2-F4的N端氨基酸序列相同，而F5-F6也是相同的。

从以上资料可以看出蚯蚓纤溶酶较为复杂，由于蚯蚓种类的不同、纯化技术的各异，所获得的蚯蚓纤溶酶存在较大差异。

但它们又有一些共同特点，综合起来,蚯蚓纤溶酶是一组存在于蚯蚓体内的丝氨酸蛋白水解酶，包括6－7种组分，相对分子质量为20000～30000，pI在3～5之间，每种组分都具有纤溶活性或纤溶酶原激活活性，其中组分F-III-2和F-III-1酶学活性最高，而F-II次之，F-I-0，F-I-1和F-I-2活性最低，因此F-III-1，F-III-2和F-II的酶学特性、空间结构、基因克隆以及表达等方面研究得更透彻，而且F-III-1，F-III-2和F-II也是进行基因工程生产的重点。

2.2蚯蚓纤溶酶的生化特性

尽管不同的实验室从不同的蚯蚓种属中分离的纤溶酶有所不同，但是它们的生化特性却比较接近。

大多数纤溶酶都具有热稳定性，能在60℃以下保持酶活性，55℃时达到最高活性，但在80℃加热30分钟纤溶酶活性就完成丧失；

纤溶酶还能在pH2-12的较大范围内保持活性，而最佳纤溶反应的pH值范围较宽，多数在7～10之间；

氨基酸组成中酸性氨基酸含量较多,碱性氨基酸含量较低；

纤溶酶在室温条件下能长期保存，在一定溶液内室温保存5年以上，纤溶酶能保持80％的纤溶活性；

纤溶酶还不受丙酮、丙烷、甲苯和乙烷等有机溶剂以及一些去污剂的影响（Nakajima等，2003）。

三种丝氨酸蛋白酶抑制剂（ＰＭＳＦ、ＴＰＣＫ、ＴＬＣＫ）对多数纤溶酶有较大抑制作用。

由此可见，蚯蚓纤溶酶是一组非常稳定的丝氨酸蛋白酶。

2.3蚯蚓纤溶酶的酶学特性及作用机理

虽然从不同的种属分离得到的以及不同组分的纤溶酶具有不同的生化特性，但大多数的纤溶酶都能被一些共同的丝氨酸蛋白酶和胰蛋白酶抑制剂所抑制，结合其它特性，可以确认纤溶酶是一组存在于蚯蚓体内的丝氨酸蛋白水解酶，具有纤溶活性或纤溶酶原激活活性。

纤溶酶最主要的酶学特性是纤溶活性，不仅能直接水解纤维蛋白原和纤维蛋白，还能激活纤维蛋白溶酶原从而间接起到纤溶作用，这两点正是蚯蚓纤溶酶能起纤溶作用和抗凝血作用的酶学基础。

EFE能直接水解纤维蛋白原（fibrinogen）或纤维蛋白（fibrin），纤维蛋白原被纤溶酶水解时，Aα和Bβ链首先被剪切，随后γ链被慢慢降解，生成很多小分子片段，从而降低血液循环中纤维蛋白原浓度，减少血栓形成和阻止血液凝固；

而纤维蛋白被水解时，其Aα、Bβ和γ链都能轻易被降解成小于10kD的片段，使纤维蛋白单体不能互相识别而形成纤丝，从而直接将血栓或凝块降解（Zhao等，2003；

Nakajima等，2003）。

纤溶酶还能激活纤维蛋白溶酶原（plasminogen）产生纤维蛋白溶酶（plasmin）,作用类似于尿激酶（urokinase）和组织纤溶酶原激活物（tPA），可以将纤维蛋白溶酶原水解为6－7个片段，其中15-20％是具有催化活性的纤维蛋白溶酶，该酶可以水解纤维蛋白（Zhao等，2003）。

这些酶学特性正是蚯蚓纤溶酶达到纤溶作用的机理（图3）。

纤溶酶组分还具有自溶现象。

当EFEA在含10MmTris-HCl和0.1%SDS的缓冲液中60℃消化30min,30kD的EFEA降解为15kD和14kD的两个片段，N端序列分析显示EFEA可在自身的Arg144-Tyr145处进行剪切，从而发生自溶现象。

图3：

蚯蚓纤溶酶溶栓作用机理（以百奥蚓激酶为例）

纤溶酶的作用底物非常多，除了能水解纤维蛋白和纤维蛋白溶酶原外，还能水解弹性蛋白、血红蛋白、酪蛋白，胶原以及白蛋白，甚至具有酯酶活性，能水解很多酯类的酯骨架，从而可以用于降解一些难降解的蛋白和生物塑胶（Nakajima等，2003）。

纤溶酶的纤溶活性还能持续保持。

Ogino等（1999）组装了一个特殊的循环装置，将纤溶酶固定，让纤维蛋白液体与纤溶酶反应，每24小时更换一次纤维蛋白液，结果发现每次反应固定化的纤溶酶都能保持完全的纤溶活性，而且这种纤溶活性至少能持续一个月以上。

2.4蚯蚓纤溶酶的空间结构及活性位点

空间结构的阐明有利于弄清楚蛋白酶的作用机制，空间结构的研究也是蛋白质组学研究的一个重要领域。

经过我国科学家的努力，在世界上第一次揭示了蚯蚓纤溶酶的空间结构，进一步阐明了该酶的作用机制（Tang等，2002）。

为了研究蚯蚓纤溶酶的特异剪切位点，Nakajima等（1999）用F-III-2和F-II水解β－淀粉1－40和氧化胰岛素β链，发现F-III-2在六个位点剪切前者，在五个位点剪切后者；

而F-II则在六个位点水解前者，在10各位点消化后者，F-III-2可以剪切包括胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶特异位点在内的很多位点，而F-II则比F-III-2有更广普的特异作用位点。

Tang等（2000）以硫酸铵为沉淀剂，用Hanging-dropvapour-diffusion得到了能用于衍射分析的EFE-a（F-II）单晶，晶体属于斜方晶系，每个不对称的单位由三个分子组成,大小1.95Ǻ。

用MIR法测定了EFEa的晶体结构（Tang等，2002），结果显示，EFEa为糜蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，具有弹性蛋白酶的S1的基本特征，但S1特异性口袋的西面环的β折叠，被Val217之后的特定插入序列（ＳＳＧＬ）所拉长，它不但为远端的蛋白质残基提供额外的底物氢结合位点，还引起南面环的S1口袋的延长。

酶的S2亚位点一部分被Tyr99的大侧链所闭塞。

EFE-a的S1特异性口袋，适合于弹性蛋白酶特异性的小疏水残基P1，但是如果增强底物的结合性或降低S1的特异性，它也可以水解长的或大的侧链残基，因此EFE-a表现为较广泛的底物特异性。

Wang等（2004a）对EFE-a晶体结构进行改良后，发现EFE-a具有多底物结合位点，当一个位点能量不足时，其它位点进行补偿而使底物与酶顺利结合；

与其它丝氨酸相比，EFE-a的N端有两个loop发生了结构改变，使底物更容易与酶相互作用，从而使EFE-a不仅能作用于弹性蛋白特异底物，还能水解胰凝乳蛋白酶特异底物和胰蛋白酶特异底物。

目前纤溶活性更高的EFE-b（F-III-2或F-III-1）的晶体结构也正在进行当中（Wang等，2004b）。

2.5蚯蚓纤溶酶药效学研究

有关蚯蚓纤溶酶的药效学研究的国外文献不多，而国内有较充分的文献资料,表明蚓激酶具有多方面的药理作用。

2.5.1纤溶作用

蚯蚓纤溶酶各组分都具有纤溶活性，其中F-III-2，F-III-1和F-II最强。

蚯蚓纤溶酶纤溶作用的机制是：

不仅能直接水解纤维蛋白和纤维蛋白原，还能激活纤维蛋白溶酶原，后者间接水解纤维蛋白，从而起到溶解血栓和抑制血栓形成的作用。

姜东胜等（1994）对wistar大鼠采用Chandler法经典实验模型及Umetsu动脉─静脉分流法动物模型两种方法分别从体外和体内，观察到蚓激酶对血栓形成的抑制和溶解作用，测得血栓形成抑制率分别为34%和52%，与对照比较有显著差异。

杨树东等（1997）应用蚯蚓提取物Ｆ2组分兔耳静脉给药,以纤维蛋白平板溶解面积为活性单位,给药剂量为2.6×

105ｍｍ2/ｋｇ,结果发现给药后1ｈ优球蛋白溶解活性升高,2ｈ达峰值,5.5ｈ降到给药前水平;

给药后4～5ｈ血浆纤维蛋白原降低,24ｈ后检测发现肺静脉栓子减重40.54%,明显高于对照组（20.20%）。

2.5.2抗凝作用

在纤溶过程中伴有纤维蛋白原的降低及血纤维蛋白降解产物（FDP）的增加，纤维蛋白原的减少可阻止血栓继续形成，而FDP本身就具有抗凝作用，因此，抗凝作用是纤溶作用的一个重要伴随现象。

动物实验发现，蚓激酶静脉或口服给药，凝血时间（TT）、凝血酶原时间（PT）及部分凝血酶激活时间（KPTT）均延长，纠正实验提示有Ⅱ、Ⅷ因子的降低，提示蚓激酶也有降解凝血因子的作用（段平等，1997）。

2.5.3对脑缺血的保护作用

脑血管血栓形成是脑缺血的主要原因。

杨明等（1995）应用大鼠中动脉阻断法研究了蚓激酶对脑缺血的保护作用，结果发现蚓激酶术前60min灌胃能明显缩小大脑皮层的梗塞灶，剂量越大,效果越明显。

内皮素和ＴＸＢ2增加是判断脑组织缺血损伤程度的客观指标。

王彦生等（1997）应用沙土鼠脑缺血再灌注模型观察了腹腔注射蚓激酶对内皮素、ＴＸＢ2及脑水肿的影响，结果显示蚓激酶能明显降低脑缺血组织内皮素及ＴＸＢ2的含量，减少脑组织的含水量。

上述实验证实蚓激酶能抑制脑缺血后血栓形成，减轻脑组织损伤，提示蚓激酶可作为脑血管疾病的防治药物。

2.5.4血液流变学研究

高血粘度是血栓形成的主要原因之一。

张祖珣等（1992）观察了蚓激酶静脉给药4ｈ血液流变学指标的变化。

结果发现血小板聚集、全血及血浆粘度、红细胞刚性指数均显著降低,红细胞聚集指数变化不明显。

蚓激酶对血液流变的调节作用为高粘血症的临床治疗开拓了研究思路。

2.5.5抗肿瘤作用

目前认为，EFE抗肿瘤活性与增加免疫功能有关。

胡云龙等（2002）曾用EFE在小鼠肝癌Ｈ22和肉瘤Ｓ180模型进行药效学研究，结果EFE在100mg/kg可明显抑制肿瘤生长，并增强小鼠免疫功能。

李洪燕等（2004）研究表明EFE在200～1000mg/kg可明显抑制人胃腺癌BGC823及乳腺癌B37裸鼠移植瘤的生长，说明EFE抗肿瘤作用不是通过直接杀伤肿瘤细胞。

已知细胞外基质对肿瘤的生长很重要，EFE对裸鼠移植瘤的生长抑制作用可能与其纤溶酶活性有关。

2.6蚯蚓纤溶酶临床应用研究

蚓激酶在我国于1992年投入临床应用，为我国自主研制的溶栓新药。

目前已有多种蚓激酶制剂应用于临床，主要为各种胶囊制剂，如普恩复、百奥、博洛克、溶栓胶囊等，多用在心脑血管疾病方面，主要包括缺血性脑病、急性心肌梗死和冠心病等，都取得显著疗效。

以博洛克治疗脑梗塞患者为例。

庞式琪等（1992）采用双盲随机法观察了博洛克对453例脑梗塞患者的溶栓效果,其中治疗组303例,对照组150例。

治疗组给予博洛克600Ｕ/次,3次/ｄ,对照组给予等量淀粉,共用21ｄ,在用药的同时静脉滴注低分子右旋糖酐。

并于治疗前后进行神经功能缺损评分并观察血液流变学及纤溶、凝血指标的变化。

结果显示治疗组有效率为93.7%,显效率为73.6%,明显高于对照组的68.6%和28%。

临床检验结果表明治疗组优球蛋白溶解时间明显缩短,纤微蛋白含量减少,全血粘度、血浆粘度及血小板聚集功能显著降低,说明博洛克具有改善脑梗塞患者血液流变和增强纤溶活性的作用。

由于蚓激酶可改善血液流变学，降低血小板聚集率，所以在用在与血液流变学相关的一些疾病中，如美尼尔病、突发性耳聋、肺心病、糖尿病、小儿支气管哮喘、眼疾病以及肾病综合症等（郭怀芳等，2001）

研究表明蚯蚓纤溶酶还具有抗肿瘤作用，蚯蚓提取物对胃癌、肺癌及食管癌、咽喉癌、移植性肿瘤以及其他肿瘤有明显的抑制作用，认为蚯蚓中可能含有细胞增殖信息传递链组分或使其活化的活性成分，可以抑制肿瘤的的生长和提高细胞免疫功能。

除了直接抗肿瘤的作用，蚯蚓提取物对放疗、化疗和热疗有增效作用，可明显提高全量放疗的完全缓解率。

是一个良好的辐射增效剂和化学增效剂，减轻放射治疗的危害。

第四军医大学王克为教授等人从鲜蚯蚓中提取制备抗肿瘤新药———地龙胶囊（912），该药具有强烈的抑制肿瘤细胞生长的作用，是一个良好的辐射增效剂和化学增效剂。

临床研究表明，单独给予地龙胶囊（912）对食管癌有抑制作用，晚期食管癌的部分缓解率为43％，与化疗药物联合使用，肺癌的近期有效率为79.1％，对其他各种癌症亦有显著的治疗作用。

2.7蚯蚓纤溶酶口服有效的机理

Mihara等（1990）发现蚯蚓纤溶酶通过口服可以激活内在的溶栓作用。

Fan等在2001年提取了Lrubellus蚓中蚓激酶成分EFEIII-1，以新西兰兔为模型观察了该酶在体内的代谢情况。

研究发现，此酶能透过小肠上皮细胞进入血液,并在血液中保持其生物活性。

实验结果显示，10%～15%完整的EFEIII-1以特殊方法（incubationchambermethod）被肠上皮细胞吸收，用免疫组化法可检测到该酶在小肠上皮细胞中的存在。

对大鼠腹膜内注射此酶，可在血清或血浆内检测到10％完整的纤溶酶分子，5％的酶分子则具有原始免疫学活性，腹膜内注后约60min能检测到最大活力。

目前市场上的蚯蚓纤溶酶以口服制剂为主，如博洛克和普恩复等，临床应用研究表明蚯蚓纤溶酶口服制剂是一种非常有效和安全的溶栓药。

2.8蚯蚓纤溶酶基因克隆与表达

目前Genbank中注册的EFE基因有14个，遗憾的是它们全部为cDNA序列，EFE的全基因还没有克隆出来，这也为将来利用基因工程高效生产重组蚯蚓纤溶酶带来了难度。

这些基因分别来自Eisenia属和Lumbricus属的Eiseniafetida，Lumbricusrubellus和Lumbricusbimastus。

由于F-III-2，F-III-2或F-II的纤溶等活性最强，而且最有进行基因工程生产的前景，目前这些基因克隆及表达主要针对它们。

2.8.1蚯蚓纤溶酶基因克隆及原核表达

Sugimoto等（2001）从Lumbricusrubellus蚯蚓中克隆了F-III-1和F-III-2的cDNA序列，其中F-III-2和F-III-1cDNA含有1011和973bp，开放阅读框为738和741bp，编码245和246个氨基酸，其前7和8个氨基酸为信号肽，而后238个氨基酸为成熟肽，F-III-1和F-III-2的蛋白序列有215个氨基酸保守。

将F-III-2cDNA成熟肽部分克隆到甲醇酵母表达系统，得到了具有纤溶活性的重组纤溶酶（110CU（caseinunits）/mg），其纤溶活性高于蚯蚓粗提物（60CU/mg），但低于F-III-2纯品（200CU/mg）。

徐义辉等（2002）从我国特有的双胸蚓属（Lumbricusbimastus）蚯蚓体内提取到一种有纤维蛋白平板溶解活性的蛋白质，通过蛋白质测序和RT-PCR等技术克隆了该蛋白的cDNAPV242，全长为888bp，编码区为726bp，经分析该序列与Nakajima等（1993）的F-II同源。

并构建了pTrxFUS-PV242重组质粒，在大肠杆菌GI724中获得融合蛋白TrxFUS-PV242的可溶性表达，采用离子交换色谱法纯化表达蛋白，融合蛋白有纤维平板溶解活性。

陈飞等（2004）则从Lumbricusbimastus克隆到另一种纤溶酶基因，经分析该序列与Nakajima等（2001）的F-III-1和F-III-2同源，随后构建了pBV220/PV239重组质粒，在大肠杆菌DH5α中进行原核表达，再经亲和层析柱纯化复性，其产物经活性测定，确定不仅具有激酶作用，而且具有直接溶栓活性。

Cho等（2004）从韩国的Lumbricusrubellus蚯蚓中克隆得到一个纤溶酶基因F6，共852bp，成熟肽部分为720bp，编码239个氨基酸，其DNA和氨基酸序列都与Sugimoto等（2001）从L.rubellus蚯蚓中克隆到的F-III-1和陈飞等（2004）则从L.bimastus蚯蚓中克隆到PV239同源，但是也存在一些差异。

他们将F6的前成熟肽和成熟肽的CDNA克隆到原核表达载体pET，并在大肠杆菌中表达，得到的重组成熟肽约为29kD，前成熟肽则为31kD，而从蚯蚓抽提物中分离的F6为33kD，表明蚯蚓体内的F6含有某种修饰。

重组的成熟肽和前成熟肽具有相同的体内和体外纤溶活性。

DONG等（2004）利用Nakajima等（2001）的F-III-1序列设计的引物在Eiseniafetida蚯蚓中克隆得到EFE-3，构建了原核表达载体pET-EFE-3在大肠杆菌BL21（DE3）进行融合表达，表达的蛋白约为30kD，纤溶活性达2000UU（尿激酶活性单位）/mg。

2.8.2蚯蚓纤溶酶真核表达

DONG等（2004）同时还构建了真核表达载体pcDNA-EFE-3在COS-7细胞中进行表达，48小时表达量达到最高，72小时后表达消失，表达蛋白也约为30kD，纤溶活性约为2600UU/mg，高于在大肠杆菌中的表达产物，表明重组纤溶酶可以在真核细胞中表达。

Hu等（2004）通过利用已知的F-III-1序列克隆了蚯蚓纤溶酶cDNA序列（LK-w），同时化学合成了经密码子优化的蚯蚓纤溶酶序列（LK-m），并构建乳腺特异表达载体pIbCP-LK-w和pIbCP-LK-w，将构建的载体DNA注射山羊乳房，在羊奶中检测到了具有纤溶活性的重组蚯蚓纤溶酶的表达，其中LK-w的溶纤活性为225,000±

13,200tPAu/mg，而LK-m的溶纤活性为550,000±

21,600tPAu/mg，表明重组纤溶酶可以在哺乳动物乳腺中进行表达，而且经过密码子优化，重组纤溶酶的表达活性要高于原始cDNA载体。

Hu等还利用这些载体进行了真核细胞表达研究，结果在COS-7，CHO，BHK-21和MDCK等细胞均没有检测到重组蚯蚓纤溶酶的表达，但是原因还不清楚。

总之，重组纤溶酶在羊奶中的表达为其在哺乳动物乳腺中进行高效特异表达提供了可