园艺作物生物技术原理Word下载.docx
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1986年，首批转基因植物进入田间试验；
1993年，转基因番茄在美国面世。
植物组织细胞培养（planttissueandcellculture）：
植物快繁与脱毒
单倍体培养技术
胚培养（胚拯救技术）
原生质体培养与细胞融合
体细胞无性系变异
转基因作物（geneticallymodifiedcrops，GMC）与基因转化：
目的基因的克隆
中间载体与植物转化载体的构建
植物遗传转化
转基因植物的鉴定
转基因植物功能分析
第一章
原生质体（protoplast）指采用机械或酶解法去掉了细胞壁的裸露的且具有活力的细胞。
原生质体研究的发展
Klercker,1892,机械法，Funariahygrometrica。
1960年，Cocking，纤维素酶处理番茄幼根，成功。
1968年，原生质体培养取得较大发展，Takebe,两步法;
Power,一步法。
1971年Takebe培养叶肉原生质体，成功地再生了植株。
1985年,禾谷类作物的原生质体培养有较大的突破，先是水稻，之后玉米、小麦等相继取得突破。
1986年，单个原生质体培养获得成功，为在单细胞水平上研究单个原生质体的生理特性、相互作用以及在单细胞水平进行遗传操作提供了条件。
原生质体的应用：
种质资源保存
原生质体融合
筛选突变体
遗传转化
基础研究
原生质体分离、纯化
1.外植体来源
用于原生质体分离的植物外植体有叶片、叶柄、茎尖、根、子叶、茎段、胚、愈伤组织、悬浮培养物、原球茎、原丝体、花瓣和叶表皮等。
2.取材
可以取自田间、温室或光照培养箱中生长的植株，但以试管苗为最佳。
不同部位培养难易程度不同
愈伤组织和悬浮细胞应取在细胞生长对数期的细胞。
有突变
3.酶液组成和浓度
纤维素酶-降解细胞壁
半纤维素酶
果胶酶（离析酶）-降解细胞间联系
蜗牛酶
氯化钙或葡聚糖硫酸钾：
提高细胞膜的稳定性和原生质体的活力。
2-（N-氮吗啉）-乙基磺酸（MES）：
稳定酶液的pH。
一般在5.6-5.8。
渗透压调节剂如糖或醇
4.原生质体收集、纯化与活力检测
收集：
低速离心
纯化：
原生质体的纯化首先通过不锈钢网过滤，通常是双层钢网。
孔径分别为400目和200目。
活力检测:
染色法或FDA
加CPW培养基清洗。
上浮法纯化：
将原生质体与蔗糖（23-25%）混合。
下沉法是先将原生质体与13%的甘露醇混合，然后回到23-25%的蔗糖溶液基部，形成一个界面。
离心，吸出原生质体带，稀释到104-105个/ml备用。
影响原生质体分离的因素：
基因型和外植体
酶液及酶解方法：
酶液成分，酶液浓度，酶液pH。
【注意浓度和时间的关系】
【添加一些物质如PVP，Ca2+
培养基及培养方式：
无机盐，碳源和渗透压，有机附加物和激素，条件培养基，培养基的pH
原生质体培养方法：
1.液体浅层培养
是目前较常用的一种培养方法。
优点：
操作简单，容易添加新鲜培养基。
不足：
原生质体易发生粘连，污染。
容易发生自毒作用。
2.固体培养
也称琼脂糖平板法（低熔点琼脂糖）。
可定点跟踪和观察原生质体，有毒物质不易扩散。
若使用普通琼脂糖，易使原生质体受到高温伤害。
3.固液双层培养法
在此基础上发展起来饲喂层培养和看护培养等。
这两种方法适用于低密度原生质体培养、原生质体培养难再生的植物。
可提高原生质体培养的植板率。
植板率：
形成愈伤组织的原生质体数量占所培养原生质体数量的百分比。
原生质体培养及植株再生：
1.细胞壁再生所需时间：
几小时到12-13天。
细胞壁的再生是发生细胞分裂的先决条件。
2.原生质体培养中的粘连现象
发生粘连现象对于原生质体培养有正面作用也有抑制作用。
发生粘连的原因在于原生质体表面的负电性。
弱则易粘连，强则不易粘连。
可通过加入ABA或Ca2+来调节。
3.细胞团形成和植株再生
再生细胞壁后开始第一次分裂，依物种不同，第一次启动所需的时间不同。
及时转移愈伤组织。
经历器官发生途径或胚胎发生途径再生成植株。
4.影响原生质体培养及植株再生的因素
原生质体来源
基因型
培养基和内源激素
培养条件和培养方法
渗透压调节剂
微电流处理
原生质体融合：
原生质体融合即细胞融合，也叫体细胞杂交，是指不同种类的原生质体不经过有性，在一定条件下融合创造杂种的过程。
在写法上常写作：
a（+）b
原生质体融合的发展：
1970年，Power开始此方面的研究，1972年，美国人Carlson获得成功。
1978年，Melchers获得了马铃薯和番茄的体细胞杂种。
原生质体融合的发展可以总结为以下几个方面：
第一，原生质体融合由以模式植物为主转移到以经济作物和重要粮食作物为主。
第二，融合方式由先前的对称融合为主逐渐变为对称、非对称融合同时发展。
第三，融合技术不断改进。
第四，融合由追求新、异转变为近年朝着育种优异种质创造方向发展。
第五，开展融合的材料涉及到越来越多的作物。
原生质体融合方法：
1.自发融合
2.诱发融合
（1）硝酸钠法
（2）高pH高钙、和电融合法，微融合法。
（3）PEG法
（4）电融合法：
微电极法和双向电泳法
（5）微融合法
原生质体融合方式：
1.对称融合
也称标准化融合，是亲本原生质体在融合前未进行任何处理的一种融合方式。
典型特点是综合了父母双亲的全部性状。
番茄薯
2.非对称融合
在融合前，对一方原生质体进行射线照射处理，以钝化其细胞核，另一方原生质体不处理或经化学试剂处理，前者叫供体，后者为受体，所以也称供-受体融合。
3.配子-体细胞融合
主要目的是获得三倍体，以便获得无籽的新种质材料。
4.亚原生质体-原生质体融合
亚原生质体主要有小原生质体、胞质体和微小原生质体三种类型。
体细胞杂种的鉴定：
形态学鉴定是最基本的鉴定方法。
亲缘关系较近时，融合再生植株的形态介于融合双亲之间或偏向一方亲本。
远缘体细胞杂种，较为复杂，有亲本形、居中形、变异形等。
为初步鉴定结果
细胞学鉴定主要是观察染色体的核型、染色体形态差异和进行染色体计数。
常用流式细胞仪进行分析
（1）同工酶标记
要使用处于同一发育阶段的植物组织
（2）分子标记
体细胞杂种核质遗传：
（一）体细胞杂种核遗传
1．对称融合中核遗传
双亲的核能够同步分裂，并导致融合
双亲的核能同步分裂并且发生融合，
但融合后出现了染色体的丢失
双亲的核不能融合，中间产生新膜形成细胞
两个亲本的核不能融合，形成多核体
亲本的核不能融合，并且其中一方的核被排除，
得到的植株为胞质杂种或异质杂种
非对称融合中核遗传
2.非对称融合中核遗传：
染色体丢失：
辐射剂量，原生质体细胞周期，亲缘关系远近。
（二）体细胞杂种细胞质遗传
1.体细胞杂种中叶绿体的遗传
单亲遗传
共 存
重 组
2线粒体遗传行为
单亲分离
重组和重排
丢 失
原生质体融合与植物遗传改良：
克服生殖障碍，创造新种质
转移有利性状，改善作物品质
转移部分染色体，获得非对称杂种
转移细胞质基因组，得到胞质杂种
第二章
基因：
是一段核苷酸（DNA或RNA）序列，它蕴含有一定的生物信息，或能指导合成一种功能性肽链或RNA分子，它是遗传物质最小的功能单位。
核酸的结构与性质
（一）DNA的结构与性质
1．DNA的结构：
DNA被称为聚核苷酸。
每个核苷酸含有一个糖基、一个含N的环状碱基（base）和一个磷酸基团。
DNA所含的单糖是2’-脱氧核糖。
每个核苷酸含腺嘌呤（A）、鸟嘌呤（G）、胞嘧啶（C）或胸腺嘧啶（T）四种碱基中的一种自然界DNA分子通常以双螺旋形式存在。
形成右手双螺旋。
带有负电的戊糖-磷酸骨架在分子的外侧，碱基则平面堆积于螺旋结构的内部。
双链间对应的碱基靠氢键相互作用形成碱基对。
两条链以5’-3’方向，反向平行排列，两条链互为互补链。
碱基间以氢键形成嘌呤-嘧啶配对，G和C配对（3个氢键），A和T配对（2个氢键）。
2．DNA的复制
DNA复制是细胞拷贝其DNA的过程，从而使细胞中的遗传信息在细胞分裂之后传给子细胞。
在复制过程中，DNA聚合酶作用于单链DNA，并合成一条与原来的单链互补的新链。
DNA合成通常以5’-3’方向发生。
复制是半保留式的。
DNA复制机制在很多生物中都是相似的，差别仅存在于参与复制的酶及蛋白。
在原核生物中，DNA聚合酶I及Ⅲ两种酶负责DNA的合成。
在真核生物中，DNA由五种聚合酶参与复制。
3．DNA损伤与修复
DNA损伤是指因受到攻击而造成其化学结构或物理结构发生不正常的改变。
造成DNA损伤的原因：
①由于DNA分子内在性质或与DNA损伤性化学试剂相互作用产生的自发损害.②由诱变剂（mutagens）如辐射、化学诱变物质等产生的诱发损害。
DNA损伤的影响包括两方面：
①单个碱基突变；
②移码突变。
DNA损伤修复可分为三大类：
①直接恢复性修复机制
②损伤切除和利用互补序列来修复
③可诱导的损伤耐受。
4．DNA的变性、复性、杂交
当DNA被加热时或在某些试剂的作用下，配对的碱基之间氢键和相邻碱基之间的堆集力就会受到破坏，逐步由双螺旋变为近似于无规则的线团构型即变性DNA。
由天然状态到变性状态的过程称变性，又称熔解。
变性DNA在一定条件下又可以恢复天然DNA的结构，这个过程称复性，也称重退火。
（二）RNA的结构和性质
在RNA中，核糖取代了DNA的2’-脱氧核糖。
同样能够与腺嘌呤配对的尿嘧啶（uracil，简写为U）取代了胸腺嘧啶（T）。
RNA通常以单链多聚核苷酸的形式存在，不形成双螺旋。
同一条RNA链上的互补部分也会产生碱基配对，形成短的双链区。
细胞中含有3种RNA，它们是tRNA（转移RNA）、rRNA（核糖体RNA）和mRNA（信使RNA）。
1．tRNA的结构、作用、合成和加工
tRNA分子由于74至95个核苷酸碱基对互补形成了tRNA特有的三叶草结构。
在真核生物中，tRNA在RNA聚合酶Ⅲ的作用下由tRNA基因转录而成。
tRNA基因以多拷贝形式存在，编码多个tRNA。
tRNA首先被合成前体RNA，之后被加工为成熟的tRNA。
几个tRNA基因可以被一起转录成一个前tRNA，之后再由核糖核酸酶在单个tRNA的5’和3’端之间切断。
2．核糖体和rRNA
核糖体是由rRNA结合蛋白质组成的大分子结构，它们存在于细胞质中，与mRNA结合并将其翻译为蛋白质。
核糖体通常用S值（沉降系数）来衡量其大小。
真核生物rRNA从一种基因转录而来，该基因为多拷贝，成簇存在，各拷贝之间由短的非转录区域隔开。
一个rRNA前体合成后加工成成熟的28S，18S，5.8SrRNA
3.mRNA的合成和加工
由蛋白质编码基因转录而来
真核生物基因的编码信息是不连续的，即一系列的外显子被非编码的内含子分隔。
mRNA通过外显子和内含子的转录以前mRNA（pre—mRNA）的形式合成。
在作为蛋白质合成的模板之前，mRNA前体进行一系列的修饰（包括mRNA剪接、加帽和聚腺苷酸化等）以产生成熟的mRNA。
不编码的内含子序列被切掉，使得编码序列连续并使mRNA成为蛋白质合成的正确模板，这个过程称mRNA的剪接。
真核生物mRNA的5’端被帽子结构修饰，加帽过程即加上已修饰的7一甲基鸟苷三磷酸。
帽子保护mRNA的5’端在细胞质内不会被外切酶破坏，也是核糖体识别mRNA分子起始端的信号。
许多真核生物的mRNA前体在3’末端被附加的约250个腺苷酸的序列即多聚腺苷酸尾poly（A）所修饰，这种修饰称做多聚腺苷酸化。
mRNA前体在多聚腺苷酸信号序列（5’AAUAAA3’）下游大约20个碱基处被切开，在多聚腺苷酸酶作用下，加上一段腺苷酸残基。
多聚腺苷酸化被认为可保护3’末端不被外切酶降解。
mRNA不像rRNA和tRNA那样在细胞中稳定存在，其相对寿命较短。
三、真核生物的基因组
一般将生物个体或细胞内信息不重复的遗传物质总和称为该物种的基因组（genome）。
除了染色体DNA，染色体外DNA（包括细菌的质粒DNA，真核生物的线粒体DNA和叶绿体DNA等）也是生物基因组的组成部分。
真核生物的基因组远大于原核生物，而且复杂得多，整个基因组分布在多条染色体中。
真核生物的染色体在细胞周期的大部分时间内以染色质（chromatin）的形式存在。
真核生物基因组有以下结构特点
1.真核生物具有真正的核结构和一定数目的染色体。
2.真核生物基因组远大于原核生物，具有多个复制起点。
3.大部分基因具有内含子。
4.非编码序列的量多于编码序列。
5.存在大量重复DNA序列。
6.真核生物中未发现原核生物的操纵子结构。
第二节真核基因的结构与类型
一、基因转录有关的结构
（一）启动子
并不是生物体内所有的基因都能表达，基因的表达是由一段位于编码序列上游DNA调控的，这段序列称为启动子（promoter）。
启动子是基因转录起始所必需的一段DNA序列，一般位于结构基因的上游，是DNA分子上与RNA聚合酶特异结合而使转录起始的部位，启动子本身不被转录。
1．启动子成分
①帽子位点（capsite），即转录起始点，其碱基大多为A，两侧各有若干个嘧啶核苷酸，常为CTCATCA。
②TATA盒，（TATAbox）,是位于转录起点上游的段保守序列。
它的顺序为TATA（A/T）A（A/T）A。
绝大多数的真核基因都有TATA盒。
③CAAT盒，在某些真核基因中存在，其一致序列为GC（T/C）CAATCT。
④GC盒，有一些RNA聚合酶Ⅱ转录的基因在远离起点的更上游处有一段CCGCCC序列，称为GCbox，它与转录的调节有关。
2．启动子的分类
按作用方式及功能不同，可将启动子分成组成型、诱导型和组织特异型等三种类型。
组成型启动子的特点：
表达具有持续性
蛋白表达量相对恒定
不表现时空特异性
不受外界因素诱导
常用CaMV35S
组织特异性启动子又称为器官特异性启动子，在该类启动子的调控下，基因的表达往往只发生在某些特定的器官或组织部位，并往往表现出发育调节的特性。
诱导型启动子是指在特定的物理或化学信号的刺激下，该类启动子可以大幅度地提高基因转录水平，因此，又称诱导型调节序列或诱导型增强子。
诱导型启动子的特点：
启动子的活化受到物理的或化学的信号诱导
具有增强子、沉默子或类似功能的序列结构
感受特异性诱导的序列有明显的专一性
一部分该类型启动子同时具有组织特异性
表达的特点
该类启动子常以诱导信号命名
（2）内含子和外显子
转录过程中首先形成前体RNA（pre-RNA），经进一步剪辑形成mRNA.二者对比在成熟RNA中仍存在的部分叫外显子，剪辑掉的部分叫内含子。
1、内含子的种类
第1类[第1族内含子（groupⅠintrons）]：
主要见于细胞器（如线粒体）、细菌及某些低等真核细胞。
第2类[第2族内含子（groupⅡintrons）]:
主要见于细胞器（如线粒体）、细菌。
二者极为重要的共同点：
能自我剪切。
第3类内含子：
即绝大多数真核细胞前mRNA中的内含子。
2、内含子的一般特点
a.不同基因内含子个数不同，大小不等
b.同一家族内部内含子位置和个数相对固定
c.遗传上变异性更大
d.存在GU/AG边界
3、作用：
提高生物的耐受性
增加基因的编码能力
有助于功能mRNA从细胞核进入细胞质
便于可变剪辑发生。
（3）终止子
转录终止子（terminator）是基因编码区下游的可被RNA聚合酶识别和停止合成RNA的一段DNA序列。
这些序列经常含有一些自身互补区，能在RNA产物上形成茎环或发夹二级结构。
这些结构使聚合酶停顿并随即终止转录。
（4）增强子
许多真核生物启动子的转录可被远离转录起始位点数千个碱基的调控元件所增强，这一调控元件称为增强子。
增强子的结构特征是100～200bp长，含有多个对增强子总体活性起作用的序列元件
增强子作用特点
赋予其相连基因从正确的起始位点的强转录活性
位于其连接点的基因的上游或下游任一
方向上均可激活转录
无论是上游还是下游，可在远离起始位点
kb以上发挥作用
优先激活两个串联的启动子中距离最近的一个
（五）沉默子
在基因内能抑制基因表达的DNA序列称沉默子。
与增强子相似，它也属于顺式作用元件中的调控元件，其作用不受位置和指向的影响，也表现出组织细胞特异性，在真核生物中普遍存在。
与增强子主要区别是它是负调控元件。
2、基因的不同区域及其作用
基因可分为5’上游区、5’非翻译区、编码区和3’非翻译区。
5’上游区包括启动子及其上与基因表达调控有关的许多元件。
5’非翻译区：
基因的转录起始位点到翻译起始密码子之间的一段序列称为5’非翻译区。
编码区：
是指从翻译起始到终止密码之间的一段区域，或者说是指这一区域中的所有外显子部分。
3’非翻译区：
是指转录本中终止密码子后面的一段序列。
3、基因的命名
（1）每个基因座位用三个小写斜体英文字母表示，这三个字母来自说明基因特性单词的前三个字母。
（2）表型相同基因不同的突变型，用三个字母后面加一个大写字母表示。
（3）同一基因的不同突变位点用基因符号后面所加的阿拉伯数字表示。
（4）基因的蛋白质产物和表型用该基因的大写正体表示。
一、基因克隆策略
DNA分子的片段化-DNA组装入载体-重组DNA导入寄主细胞-重组体分子的筛选
2、基因克隆所需要的酶
（1）II型限制性内切核酸酶
II型：
单一成分EcoRI;
HindIII;
XbaI等
作用时需要ATP，Mg2+
作用位点特异
基本特性
在DNA分子双链的特异性识别序列部位，通常为4－8个核苷酸，切割DNA分子产生链的断裂；
2个单链断裂部位在DNA分子上的分布，大多不是彼此直接相对的；
断裂的结果形成的DNA片段，也往往具有互补的单链延伸末端。
黏性末端，是指DNA分子在限制酶的作用下形成的具有互补碱基的单链延伸末端结构，它们能够通过互补碱基间的配对而重新环化起来。
（2）DNA连接酶
催化的反应：
一条DNA链的3’末端具有一个游离的羟基（-OH），在另一条DNA链的5’末端具有一个磷酸基团（-P），催化形成磷酸二酯键。
DNA连接酶作用特点
被连接的DNA链必须是双螺旋DNA分子的一部分
催化反应需能源存在
细菌中利用NAD＋
噬菌体和动物细胞中利用ATP为能源
DNA连接酶只能封闭骨架上的缺口（nick），而不能封闭骨架上的裂口（gap）。
分子生物学上常用两种连接酶
DNA连接酶（70KD）
T4DNA连接酶（60KD）
二者异同：
来源
催化的反应
能源
催化效率
载体（pGEM-T-EasyVactor）1ul
目的基因回收产物3ul
缓冲液5ul
T4DNAligase1ul
3、基因克隆载体
在基因工程操作中，我们必须借助于一种运载工具，这种运载工具可以承载外源DNA片段或基因，将其转入受体细胞，并在受体细胞内进行外源DNA片段的增殖，这种运载工具称为基因克隆载体。
载体的本质是DNA分子
（1）载体所需具备的基本条件
具多克隆位点。
可复制以增殖。
具有选择标记。
载体是安全的。
（二）基因克隆载体的类型
基因的克隆载体通常包括质粒载体、λ噬菌体载体，单链噬菌体载体，cos载体，酵母人工染色体载体（YAC），细菌人工染色体载体、（BAC）等。
λ噬菌体载体
λ噬菌体外部为一个蛋白质外壳，中心为线状双链DNA分子，长度约为48502bp，在λDNA分子的两端各有12个碱基的单链互补黏性末端
λ噬菌体DNA分子上的基因，除了两个正向
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