试验核医学Word文档格式.docx
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P（可变量的非标记待测物）
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P-Q（非标记待测物-结合剂）
在特异性抗体Q的量一定时，标记抗原P*和非标记抗原P与Q结合的量取决于二者浓度比。
P*-Q结合量将随着P的增加而减少，表明P抑制了P*与Q的结合。
测定反应系统中P*-Q或游离P*的放射性活度，通过数据处理即可求出待测非标记抗原P的量。
图6-1竞争结合原理示意图
从图6-1中可看到简单的量的概念：
当反应系统中没有非标记抗原存在时，B/F为2.0，B/（B+F）为0.67；
随着非标记抗原的增加，B/F或B/（B+F）相应减少。
加入的非标记待测物与相应的B/F或B/（B+F）值的函数关系可用曲线表示出来，即为剂量反应曲线，见图6-2，通过剂量反应曲线可推算出待测物的剂量。
图6-2常用的两种剂量曲线示意图
二、放射免疫分析的基本试剂
（一）标准品
标准品是RIA定量测定的依据，因此，对标准品有如下要求：
①化学结构上的要求：
标准品应该与待测物具有相同的化学结构。
有时结构完全相同的标准品来源困难，可用结构类似且与特异性抗体亲和力亦类似的物质来替代。
②化学纯度上的要求：
用化学合成法制得的小分子化合物应是化学纯度很高的纯品，有些蛋白质或多肽类物质不易制得足够量的高纯度标准品，要求其所含杂质对竞争性结合反应无干扰。
③对含量标定值的要求：
标准品应有准确的含量。
小分子化合物可通过各自特有的化学或物理特性进行标定，蛋白质或多肽类物质可用精度较高的蛋白定量法进行标定。
④运输和保存的要求：
放射免疫分析的标准品大多为生物活性物质，易受环境变化的影响而变质，应注意有效期。
不同的标准品有不同的最佳保存条件，应在建立方法时通过实验确定。
（2）特异性结合抗体
1．对特异性结合抗体的要求
可应用于RIA的抗体必须具备以下基本条件：
①要与待测物有高亲和力（KA）。
因KA值越大，该方法的灵敏度和精确度越高，所以KA值至少要达108L/mol以上。
②要与待测物有尽可能高的特异性。
与待测物以外的物质，特别是样品中可能存在的待测物的类似物，其亲和力越低越好。
③要有较高的滴度。
滴度是指结合50%标记抗原时抗血清的稀释度。
高滴度抗体在使用时能作较高倍数的稀释。
④要能长期保存。
这有利于对方法的规范化。
2．抗血清
用做特异结合剂的抗体通常都由人工制备。
最常用的制备方法是用待测物作为抗原在动物体内诱导产生抗体。
免疫原和动物对免疫动物能否成功起决定作用，注射途径、佐剂的使用、注射剂量与时间等也对免疫成败起重要作用。
（1）免疫原能激发动物产生特定抗体，并与该抗体专一性结合的物质称为抗原。
抗原在动物体内引起免疫应答的性质称为免疫原性。
免疫原性的强弱取决于抗原分子量的大小及其异己性。
通常抗原分子量及其异己性越大则免疫原性越强。
动物体内诱导生成的抗血清质量与所用抗原的纯度有关，抗原一般应做适当的纯化处理，如盐析法、溶剂提取法、电泳法、凝胶过滤法、离子交换法及液相色谱法等，有时也可采用免疫纯化技术。
（2）人工免疫原小分子量物质缺乏免疫原性，但可人工将其连接到某个大分子上，即可表现出免疫原性。
连接时应注意保留小分子物质的特异化学结构，使诱发生成的抗体能与该小分子物质发生特异性结合反应。
人工免疫原的制备通常是将半抗原与载体蛋白通过化学反应加以连接。
常用的半抗原为小分子量的多肽、甾体类化合物、药物和其他小分子活性物质。
几乎任何蛋白质都可作为连接用的载体，但常用不同种系血浆中的蛋白，如牛血清白蛋白（BSA）。
此外还有卵清蛋白、多聚赖氨酸、聚谷酰氨酸及纤维蛋白原等。
半抗原与蛋白质的连接方法很多，具体的连接途径常是利用蛋白质中的-NH或-COOH，通过缩合反应或用一定的交联剂与半抗原分子中的功能基，如-OH、C=O、-COOH、-NH2等结合。
（3）动物的选择动物反应的强弱除取决于抗原外，还取决于动物的免疫应答能力及免疫接种方法。
一般实验室主要用家兔作为免疫动物，若抗血清用量不大，可用豚鼠来制备抗血清，若抗血清用量较大则可用羊。
各种动物对抗原反应性的个体差异很大，因此在免疫动物时应适当多免疫几只，以便有机会选择满意的抗血清。
一般应选择健康、强壮的动物。
（4）佐剂常用的佐剂为福氏（Freund）佐剂。
9份石腊油、1份羊毛脂称为福氏不完全佐剂；
其中再加入灭活的结核分枝杆菌则称为福氏完全佐剂。
应用佐剂可延缓抗原的释放，保护抗原不被酶水解。
抗原缓慢少量释放，不但可避免频繁的注射，也有利于高亲和力抗体的产生；
佐剂还可刺激网状内皮系统，引起单核细胞在局部的浸润和巨噬细胞的吞噬作用；
使淋巴在局部淋巴结通过增加，从而增加抗原与抗原反应细胞的接触，有利于抗体的产生。
（5）抗原的注射途径不同的注射途径可产生不同的免疫效果，按效果大小其一般次序为：
淋巴结、关节内、皮内、腹腔、皮下、肌肉、静脉。
效果的差别主要决定于抗原从注射部位消失的速率和通过淋巴结或其他免疫活动中心的速率。
多点皮内注射法不仅节省抗原而且可在较短时间内获得较理想的抗血清。
（6）注射剂量与免疫时间准确、恰当地给予抗原剂量、安排注射时间、次数及佐剂，是获得良好抗血清的重要措施。
对常用的动物如兔、豚鼠等，在基础免疫时，每只动物剂量一般给予数百微克或数十微克抗原即可。
在一般情况下，一次基础免疫不易产生滴度高的抗血清，需要继续进行1次或数次加强注射。
在基础免疫与第1次加强免疫之间的间隔时间一般为4～6周，有时可长达2～3个月。
加强免疫注射的部位应在原来注射位置附近，以再次刺激那些产生了免疫反应的淋巴结。
加强免疫的抗原剂量一般是基础免疫的半量或更少一些。
一般在加强注射后7～10d取血开始测试，若抗血清不够理想，应给予第2次加强注射，直至得到满意的抗血清。
3.单克隆抗体。
单克隆抗体是利用淋巴细胞杂交瘤技术由微量不纯抗原获得大量单一抗原决定族的抗体。
单克隆抗体具有特异性强、抗体成分单一及可反复生产等优点。
单克隆抗体的制备步骤有：
①免疫利用上述制备抗血清的方法免疫一组小鼠，在加强注射后3d摘除小鼠脾脏，洗净后制成细胞悬液。
②细胞融合将脾细胞与一定比例的同系小鼠骨髓瘤细胞混合离心、去上清液后轻弹管壁使细胞团成均匀糊状，并加聚乙二醇以促进两种细胞的融合。
③选择培养用选择性培养基筛选杂交瘤细胞，该培养液对骨髓瘤细胞株有毒性，故仅保留生存的杂交瘤细胞，将后者继续进行培养。
④检测抗体用放射免疫分析法或酶免疫分析等方法检测培养液中有无单克隆抗体的产生。
⑤克隆化对经检测为抗体阳性者，应及早克隆化，直至得到稳定分泌均一抗体克隆为止。
随着生物工程技术的发展，利用噬菌体展示技术可以快速获得各种人源化的单克隆抗体及其功能片段。
（三）标记物
1．对标记物的要求
（1）高比活度标记化合物的化学量越少，分析的灵敏度越高。
但同时还需要每一反应管有足够的放射性比活度以控制测量误差，这就要求标记物有较高的比活度。
（2）生物活性与免疫活性标记物的生物活性或免疫活性要能与标记前一致。
（3）放射化学纯度标记物的放射化学纯度应在95%以上。
（4）稳定性要求标记物要有良好的稳定性，标记方法、放射原子标记的位置、置换的水平、化学环境、储存温度等都会影响标记物的稳定性。
2．标记物的鉴定
对标记物的鉴定除鉴定一般的理化性质外，还应检验标记物的免疫活性，对放射受体分析和竞争性蛋白结合分析来说是检验标记物的生物活性。
（1）最大结合百分率的测定取少量标记物加过量特异性结合剂温育足够时间，标记物应大部分能与抗血清结合。
（2）标准曲线比较法在非标记的标准品中加入已知化学量的标记物，混匀后取一系列不同浓度代替标准品制作标准曲线，与正常标准曲线作比较，两条曲线所用的特异结合剂相同。
两条曲线的全部测定值都换算成各自所加放射性活度的结合百分率。
根据标记物免疫活性是否完整无损可能出现3种情况，如图5-3所示，若标记物完整无损，则两条曲线重合，（见图6-3中的实线与虚线①）；
若曲线平行右移，说明部分标记物已完全丧失结合能力，而另一部分标记物无损伤（见图6-3中的虚线②）；
若曲线斜率降低，说明标记物特异结合能力降低（见图6-3中的虚线③）。
图6-3标记物特异结合能力的鉴定—标准曲线比较法
（实线为正常标准曲线,虚线为加标记物的“标准曲线”）
（3）稀释曲线比较法第1条曲线中全部试管只加标记物与不同稀释度的特异性结合剂，标记物的浓度为常规稀释曲线的10倍。
第2条曲线中用1/10量的标记物，另加相同于
图6-4标记物特异结合能力的鉴定—稀释曲线比较法
其9倍量的标准品。
第2条曲线可能与第1条曲线完全重合，说明标记物与非标记的标准品有相同的亲和力；
第2条曲线下降比第1条快，说明当抗体量较少，标记物与标准品发生竞争性结合反应时，标记物的结合能力较差，因此所得放射性结合百分率低于第1条曲线（见图6-4）。
三、竞争性放射免疫分析方法的建立
（一）反应方式
1．平衡法
经典的竞争性RIA都采用平衡法，即让标记物和非标记物与特异结合剂有相同的反应几率。
该法反应时间长，平衡后才终止反应。
这种反应易于控制，重复性好。
但灵敏度有时不能满足需要，操作流程长。
2．顺序加样法
该法是将特异性结合剂预先充分地与非标记物反应形成复合物，然后加标记物作较短时间的温育。
此法测定时标记物与特异性结合剂形成复合物的概率比非标记物小，所得标准曲线斜率增加，从而提高了灵敏度（图6-5）。
但需要应用特定的曲线拟合方法，各待测样品的反应时间都必须和标准管严格一致。
3．STAT法
该法在反应未达到完全平衡时就终止反应，以得到接近典型的标准曲线，且有较高的灵敏度（图6-5），常采用化学结构和反应动力学与非标记物不完全相同的标记物。
该技术必须严格按预先确定的条件进行，包括反应时间和反应条件等。
图6.5三种不同顺序的加样法所得标准曲线
（A.平衡法；
B.顺序加样法；
C.STAT法）
（二）3种基本试剂的用量
3种试剂的用量选定是一个较为复杂的问题，在很大程度上取决于待测样品中待测物的含量范围。
若重点是低含量样品，则要求灵敏度高；
若重点是高含量样品，则要求标准曲线在高剂量区有较好的斜率；
若样品含量变化大则两个方面均需兼顾。
3种情况对试剂用量的选定影响很大。
若要求高灵敏度时，标记物尽量少，抗体最大结合率33%～50%，标准品用量也尽量少；
若要求测定高含量时，标记物要较多，抗体最大结合率＞50%，标准品用量相应加大；
若既要求高灵敏度也要求测定高含量时，则用量均需适中。
（三）反应介质
1．pH和离子强度
竞争性RIA的特异性结合反应，其亲和常数常受反应介质pH的影响。
为保证分析结果的重现性和可比性，必须使反应在恒定的pH下进行。
反应介质通常都用缓冲液配制，且缓冲液要有一定的离子强度。
最常用的是pH为7.5左右的0.05～0.1mol/LTris-HCl或磷酸缓冲液，也有应用pH较低的醋酸缓冲液或巴比妥缓冲液等，需通过预实验选定。
2．反应体积
缩小反应体积可相应地减少特异性结合剂及标记物的绝对量，从而使非标记待测物的竞争力量相对加强。
因此，小体积反应系统有较高的灵敏度，应用的试剂也较少。
但小体积的加样误差较大，所形成的复合物也较少，放射性测量的误差较大，故要对这两者综合考虑。
目前常规分析常选择0.3～1.2mL为宜。
3．添加剂
添加剂的种类繁多，建立一个新的分析系统时应通过实验考察有关添加剂的影响。
现已知应用防腐剂叠氮钠、抗凝剂EDTA对分析无影响。
4．样品处理
被测样品常为血清、血浆、尿液、脑脊液及各种组织等，样品中的其他物质都有可能干扰待测物与特异性结合剂的结合，因此一些样品在检测前需要进行处理。
常用的处理方法有用蒸馏水或缓冲液做适当稀释、用溶液将待测物从样品中提取出来、层析法、电泳法等。
样品处理时应避免造成新的干扰；
有些生物活性物质在酶的作用下极易降解，样品处理必须终止酶的作用；
抽提样品时应避免过激条件导致肽类物质的变性及样品的丢失。
（四）加样程序
每一分析系统都应有固定的加样程序，以确保实验的重现性。
通常应遵循的几点原则是：
⑴第1步首先设计好反应总体积及各试剂和样品的加样体积。
用缓冲液制备试剂的工作液。
其浓度应满足最终浓度的需要。
⑵第2步加缓冲液补足体积。
⑶第3步加标准品及待测样品。
加标准品有两种方法：
一是先按各管所需不同浓度配制一系列浓度不等的标准液，然后各管加相同体积；
另一种是只配一种较高浓度的标准液，然后各管加不同体积。
⑷第4步加标记物。
⑸第5步加特异结合试剂。
若采用顺序加样的非平衡法，第4步与第5步对调。
⑹第5步全部反应管加样完毕后，振摇混匀，并进行温育。
（五）温度和时间
平衡亲和常数K与温度有关，因此需精确控制温度。
低温可降低抗原抗体分子之间的碰撞频率，因此需通过延长温育时间才能使反应达到平衡。
温度虽然能影响平衡常数，加速或减缓结合反应达到平衡的时间，但并不改变抗体的特异性。
（六）结合与游离部分的分离
1．对分离方法的要求
分离结合抗原与游离抗原的方法很多，主要有物理化学法和免疫学法两大类。
分离方法的选择直接影响分析质量，通常需满足以下的要求：
①使结合部分和游离部分尽可能完全分开；
②分得的成分便于放射性测量；
③分离效果不受外界干扰因素影响；
④操作简便、分离迅速、重复性好；
⑤与游离标记物的非特异性结合尽可能小；
⑥试剂来源广泛，价格低廉。
2．各种常用的分离方法
（1）双抗体法分离原理是利用免疫沉淀，为目前使用最广泛的方法之一。
很多抗原的特异抗体来自家兔或豚鼠，称为第一抗体。
形成的抗原抗体复合物不能通过离心将其分离，若用其他动物制备抗第一抗体的血清，加入到反应已平衡的系统中，则该抗体就能与第一抗体形成不可溶的复合物，经离心可将其沉淀，从而达到分离的目的。
后一种抗体称为第二抗体。
这种方法的优点是：
可应用于生物活性物质的放射免疫分析；
非特异性吸附低；
添加第二抗体不会引起反应液组成的显著变化；
易于操作；
具有良好的特异性、灵敏度、精确度和重复性。
其反应式为：
（2）聚乙二醇（PEG）法常选用分子量为6,000的聚乙二醇，最终浓度为7%～8%时能使抗原抗体复合物沉淀。
其价格低廉，操作方便，一次可处理大量样品。
但分离效果易受pH、离子强度和温度的影响，非特异性结合较高，多与其他方法联合使用，如双抗体-PEG法。
（3）活性炭吸附法用蛋白质、右旋醣酐包被的活性炭吸附小分子量标记物，大分子复合物则留在溶液中，经离心即可达到分离的目的。
其优点是操作简便、经济、快速。
缺点是专一性差，若包被不均一，可使部分复合物也被吸附。
复合物可能解离，解离后的标记物也能被吸附，因此本法必须在低温下进行，掌握操作时间。
（4）盐析法利用不同蛋白质达到等电点所需中性盐的浓度不同来进行分离。
如标记抗原与抗体所形成的复合物在40%～50%饱和度的硫酸铵中可达到等电点而沉淀，而标记抗原在此浓度仍处于溶解状态，经离心即可将B与F分离。
（5）微孔滤膜法由纤维素酯制成的滤膜，对大分子蛋白质有较强吸附能力，而小分子标记物则在过滤时能自由通过。
本法简单快速，易自动化，分离效果也较好。
（6）葡萄球菌A蛋白（SPA）沉淀法A蛋白与免疫球蛋白，特别是与IgG有非常高的亲和力，因此可使用SPA代替第二抗体作为抗原抗体复合物的沉淀剂。
它与复合物达到平衡的时间远较第二抗体快。
（6）固相抗体法预先将抗体联接在某种固相载体上，分析时将标记和非标记抗原的溶液与固相抗体共同温育，反应结束时除去液体，测定固相载体上抗原抗体复合物的放射性活度。
该方法操作简便，分离效果好，发展极快。
对固相载体的材料有以下要求：
非特异性结合低；
能牢固地联接或吸附抗体；
单位面积联接或吸附的抗体量多；
物理化学性能稳定；
价格低廉，来源丰富。
目前认为多孔玻璃微球是较为理想的材料，其化学稳定性好，对酸碱有机溶剂均不起反应。
使用时先采用双功能联接剂形成分子臂，再与抗体蛋白偶联。
（8）磁化颗粒法使结合抗原的固相抗体在磁场作用下贴在管壁或管底，未结合抗原被倾倒掉，不需离心。
磁化固体支持物很多，如氧化铁纤维素颗粒、用硅烷包被的氧化铁颗粒、多聚碳酸盐包被的铁磁珠等。
（9）间接固相化技术先将抗原联接在聚合体支持物上，后再与抗血清保温，生成固相化抗体。
（10）屏蔽记数法先用活性炭吸附游离部分并使之自然沉降，再用高密度的屏蔽粉将沉淀中的放射性加以屏蔽，测量其中结合部分的放射性活度。
四、数据处理
（一）数据处理的基本步骤
数据处理就是将实验测得的未知样品的直接结果换算成剂量，每次实验均需作标准曲线（即剂量反应曲线），从中查出待测样品的剂量。
RIA所获得的实验数据有两类处理方法：
绘图法和数学模型计算法。
绘图法是将加入的标准品剂量作为横坐标，反应参数作为纵坐标，在坐标上绘制标准曲线。
按测定的反应参数在坐标曲线上查未知的测定样品的值。
作图法简便易行，但在绘图时难免发生人为的误差。
数学模型法比绘图法准确，是目前最常使用的方法，它需用计算机处理数据。
（二）不同分析系统剂量反应关系的特点
了解所用分析系统剂量反应关系的特点是设计或选用合适数学模型的前提。
多数RIA是均一性的，且在反应充分平衡后才分离B与F。
结合量B对剂量X的对数作图，呈对称的反S型曲线；
若以logitBx/B0对lgB作图则呈直线。
若采用顺序加样法，所得剂量反应曲线常在低剂量区迅速下降，而在高剂量区特别平坦，以B对lgX作图呈不对称反S型曲线。
STAT在严格规定时间终止反应才能得到典型RIA系统的剂量反应曲线。
（三）几种数学模型
针对剂量反应曲线的实际形状寻找有相似曲线形状的函数式，如一般多项式函数及样条函数。
以RIA的某些特性为基础设计函数式，如直线化模型及目前认为较好的一些非线性模型。
临床应用RIA都配备了计算机系统，提供函数及数学模型的软件。
1．一般多项式函数
一般多项式函数包括2次、3次及4次等多项式及3/2幂函数，这些函数只在某一区域能模拟RIA的剂量反应曲线，普遍适用性差，目前已很少应用。
2．样条函数
用若干个3次多项式分别代表各相邻标准点的连线，并给予若干限制条件，使各点线以一定方式连接起来，此即称直接样条函数，一般能模拟整条RIA剂量反应曲线。
但对坏点无判别能力。
后对该方法增加一条限制条件，只允许整条曲线有一个转折，称为平滑样条函数法。
但在有坏点时，平滑的结果将使整条曲线有移位。
由于平滑样条函数受坏点的影响较大，目前也已少用。
3．直线化数学模型
直线化数学模型根据RIA中抗体基本被饱和的特点，以非标记抗原浓度为自变量，以B0/Bx为因变量作图，得一直线。
此法运算简便，缺点是直线化使误差严重不均匀，目前已很少使用。
4．Logistic模型
由logit-lg的通式整理重排即得四参数Logistic模型的通式，式中4个参数均可由实验数据通过曲线拟合求得。
该模型有4个参数，因此适应性较强，其优点为灵敏度高及可避免NSB测定不准确引入的误差，为目前常用的数学模型。
由logit－lg的通式两侧取反对数得到：
令Y＝Bx＋d，a=Bo＋d，其中d＝NSB则上式变为：
设非标记物X的剂量为C时特异结合的放射性恰为Bo的一半，亦即：
或
则代入上式得W＝Cb。
故上式可写成：
该式整理重排即得四参数Logistic模型的通式：
式中，4个参数a、b、c、d均可由实验数据通过曲线拟合求得。
5．四参数单位点质量作用模型
该模型除直接从质量作用定律导出外，还把NSB作为一个与游离抗原成正比的参数引入函数式。
五、放射免疫分析的质量控制
质量控制是利用科学的方法对测定结果进行控制，以达到规定质量的标准。
质量控制的实质是控制误差。
实验方法内部存在误差，在不同方法之间存在误差，用同一方法的各实验室之间和用不同方法的实验室之间都可能存在误差。
质量控制的近期目的是通过对测定结果的分析，对本次测定的质量作出评价，并按照预定的要求决定结果的取舍，以保证测定结果的准确性；
远期目的是通过对不同批测定结果的不断对比分析，发现造成误差的原因，从而改进实验条件或设计，以提高质量。
（一）RIA中的误差及引起误差的原因
误差可分为随机误差和系统误差两种。
随机误差是由于偶然的原因，如RIA分析中的加样、分离和计数等误差造成同一样品多次测定结果不一致。
它的出现是随机的，误差是双向的，没有倾向性。
即使是高度自动化及十分仔细操作也不能完全避免随机误差，但可设法控制在允许的水平以下。
随机误差反映测定的精确性，其评价指标是精密度。
系统误差是由于某种特定的原因，如标准品定量或配制不准确、方法设计不合理、仪器出故障、操作程序失常等造成的误差。
系统误差是带有倾向性的误差，使测定结果系统地偏高或偏低，这种误差是可以找出原因加以改进而避免的。
评价系统误差的指标是偏差。
引起误差的主要原因为：
1．试剂
试剂的质量和稳定性对测定结果有直接影响，化学试剂和生物试剂均能影响RIA的质量，而生物试剂更易变性，所有试剂均应合理储存，并在使用期内使用
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