产绿原酸金银花内生菌的分离研究论文 精品Word文档格式.docx
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3.2.4.1固体基本培养基的选择12
3.2.4.2液体基本培养基的选择12
3.2.4.3发酵条件的单因素优化13
3.2.4.4发酵条件的正交试验13
3.2.5金银花内生真菌的抑菌实验14
4结果与分析15
4.1菌株筛选的结果15
4.2菌株次生代谢产物检测结果15
4.2.1薄层色谱法（TLC）检测15
4.2.2高效液相色谱法（HPLC）检测16
4.3内生真菌的形态学鉴定结果19
4.3.1传统鉴定方法19
4.3.1.1菌株形态学描述19
4.3.1.2显微形态鉴定21
4.4二次发酵条件的优化结果25
4.4.1固体基本培养基的选择结果25
4.4.2液体基本培养基的选择25
4.4.3纯化分离出的菌株发酵液形态27
4.4.4发酵条件的单因素比较29
4.4.4.1碳源的选择30
4.4.4.2氮源的选择30
4.4.4.3温度的选择31
4.4.5发酵条件的正交试验32
4.5抑菌实验结果34
5结论与讨论35
6展望36
参考文献37
1前言
1.1内生菌与植物的关系
内生菌（endophyte）是指一类在其部分或全部生活史中存活于健康植物组织内部，而不使宿主植物表现出明显感染症状的微生物。
内生菌也可理解为植物组织内的正常菌群，它们与植物的关系相当密切，是植物微生态系统的天然组成成分。
关于内生菌的起源仍然有不同的观点，存在两种假说，即“内生说”和“外生说”:
内生说认为内生菌与宿主植物应该具有相同或相似的遗传背景；
外生说认为内生菌源于植物体外，通过植物体表、根际的自然孔口、伤口或诱导植物形成的通道进入体内。
内生菌长期生活在植物体内的特殊环境中，植物以其内生菌的组织、细胞及其代谢产物为内环境，而内生菌以宿主植物的组织和细胞及其代谢产物为外环境，两者之间互相进行物质、能量及基因交流，在长期进化过程中与宿主协同进化，在演化过程中两者形成了互利共生的关系。
一方面内生菌可从宿主中吸取营养供自己生长所需；
另一方面，内生菌产生的次生代谢产物，能刺激植物的生长发育，提高宿主植物对非生物胁迫（如抗干旱）和生物胁迫（如抵抗病虫害等）的抵抗能力，内生菌与宿主植物在长期协同进化过程中彼此构成了和谐稳定的生态关系。
另有观点认为内生菌与宿主植物间存在基因交流，对红豆杉，长春花等药用植物内生菌的研究中，通过对其内生菌的发酵液进行化学分析，分离得到了和宿主植物相同或相似的生理活性成分，可见宿主植物与其内生真菌由于长期的共同生活因而关系非常密切。
1.2内生菌天然药物新资源及其展望
研究发现某些内生菌可以产生与宿主植物相同或类似的生理活性成分，这一发现可能在一定程度上解决了某些药物资源短缺的问题。
近年来先后从红豆杉（Taxus），长春花等药用植物中分离得到了内生真菌，并从这些药用植物内生真菌发酵液中分离得到了和宿主植物研究相同或相似的生理活性成分。
内生菌作为许多重要药用成分的新来源，可工业化生产而不受土壤气候以及资源的限制，从而缓解了药物资源的短缺。
目前已经从红豆杉、长春花、银杏等植物中分离出能产生活性成分的内生真菌[1,2,3]。
1993年Stiede首次从短叶红豆杉（Taxusbreviflia）中分离得到一株能合成抗癌物质紫杉醇的内生真菌（Taxomycesandreanae），此后对东北红豆杉也进行了研究[3]。
云南大学张玲琪等从桃儿七（Sinopodophyllumhexandrum）的茎中分离到能够产生鬼臼毒素的内生真菌[4,5,6]。
从桃儿七植株中共分离得到28株真菌，其中有两株能够产生鬼臼毒素类似物，它们分别属于青霉属和交链孢属。
1999年，中山大学王伟等人从南方红豆杉（Tchinensisvar．mairei）中分离得到87株内生真菌，其中有6个菌株能分泌紫杉烷类化合物，它们分别属于头孢霉属、轮柄梳霉属和无孢菌群等。
通过比较发现，以上产生与宿主相同或相似生理活性成分的内生真菌菌株之间并不存在种属联系，表明内生菌具备这一能力并不是偶然现象。
这些发现掀起了一场从药用植物体内分离内生菌的热潮，为人类解决某些药用植物生长缓慢、资源短缺等问题提供了新思路。
另一方面，多样性的内生菌也能产生许多具有生物活性的次生产物，从而增强植物的抗逆性，表现在非生物胁迫（如抗干旱）和生物胁迫（如抵抗病虫害等）方面，这些次生代谢产物多数具有抗菌、抗肿瘤等生物活性。
本研究通过分离金银花内生真菌得到产绿原酸的菌株，寻找出此类菌株是如何通过其自身次生代谢产物来影响宿主次生代谢产物的产生，探讨两者之间的相关性。
并以金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌为指示菌，通过纸片法对分离得到的能够产生绿原酸的金银花内生真菌进行抑菌学实验，验证其发酵液中的次生代谢产物具有抑菌活性。
本研究为后期利用金银花内生真菌工业发酵生产绿原酸提供科学理论依据，具有很大的经济价值和研究意义。
2问题的提出
在河南的道地药材中，近几年有一种药材，价格连年上涨，而且用途广泛，这就是我们关注的-金银花，金银花具有清热解毒、通经活络、广谱抗菌及抗病毒等功效，70%以上的感冒、消炎中成药原料药材中几乎都有金银花的踪迹，具有“中药抗生素”、“绿色抗菌素”之称。
金银花的作用除药用外，其饮料、美容、减肥和保健养生的作用更为神奇，对身体所起到的巨大保护和修复作用是十分显著的。
金银花既然有如此之多的用途，它起作用的活性成分什么？
通过请教老师和查阅资料，得知金银花所含绿原酸是其主要的活性成分之一，绿原酸能促进人体新陈代谢、调节人体功能、提高免疫力。
既然清楚绿原酸是金银花的活性成分，绿原酸具有抗菌、消炎、解毒、利胆、降压、升高白细胞及显著增加胃肠蠕动和促进胃液分泌等药理作用。
那么绿原酸在植物体内是如何产生的，它和土壤中的大量微生物存在有关系吗？
而且在植物体内有一类微生物存活于健康植物组织内部，在长期进化过程中与宿主协同进化，在演化过程中两者形成了互惠共生关系，此类微生物称为内生菌。
那么在金银花中有没有能产生绿原酸的内生菌。
那如果能把该菌分离出来，就可以利用微生物发酵生产金银花中活性成分绿原酸了。
那样就可以节约大量的土地和劳动力，又能实行工厂化生产。
那么，采用什么样的技术才能分离出产绿原酸的金银花内生菌并进行培养发酵呢？
于是我们开始了从金银花中分离产绿原酸内生菌的研究历程。
3材料与方法
3.1试剂
可溶性淀粉天津市化学试剂三厂
蛋白胨上海东海制药厂
牛肉膏北京奥博星生物技术有限责任公司
琼脂北京奥博星生物技术有限责任公司
葡萄糖上海化学试剂采购供应站试剂厂
硅胶H青岛海洋化工厂
甲醇天津市风船化学试剂科技有限公司
乙酸丁酯天津市风船化学试剂有限责任公司
羧甲基纤维素钠天津市福辰化学试剂厂
氯仿淄博广然化工有限公司
甲苯天津市富宇精细化工有限公司
甲酸上海三浦化工有限公司
乙腈天津市四友精细化学品有限公司
以上试剂除乙腈，甲醇外均为分析纯。
KNO3，K2HPO4，MgSO4•7H2O，NaCl，FeSO4·
7H2O等均为天津市化学试剂三厂
培养基配方
PDA培养基：
马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂18g，蒸馏水1000ml
PDB培养基：
马铃薯200g，葡萄糖20g，蒸馏水1000ml，自然pH
以上各种培养基配制好分装完成后于121℃,20min的环境中灭菌。
3.2实验方法
3.2.1菌株的筛选
3.2.1.1实验材料的采集
选取健康金银花植株的不同组织部位（新鲜根、茎、叶、花）作为内生真菌分离的实验材料，采摘时，尽量选择植物老的组织部位，因为对老的组织采样能最大程度的发现内生菌的多样性，此外尽量选择对离地面较远的组织采样，减少因泥土溅到组织上造成的表面杂菌污染。
采集后立即保存于保鲜袋内，4℃冰箱保存，24小时内进行内生菌的分离。
3.2.1.2样品的消毒处理
金银花组织表面消毒方法的考察。
将样品用自来水洗净，无菌剪刀剪成0.5×
0.5cm2的小块，采用75%乙醇与5%次氯酸钠相结合的方法进行表面消毒。
表1金银花内生真菌分离的消毒方法
方法
Solution
处理时间（s）
Timetreated
无菌水（sterilizedwater）
30（2times）
75%乙醇（ethanol）
30（1times）
30（3times）
5%次氯酸钠（NaCl0）
60（5times）
3.2.1.3表面消毒效果的检测
取最后一次消毒的无菌水200µ
L置入已消毒培养基中，紧贴培养基本表面，作为对照组，以确定金银花组织表面消毒彻底。
3.2.1.4分离与纯化
将植物组织用无菌剪刀剪成0.5×
0.5cm2的小块，接种于PDA培养基上，并取最后一次消毒无菌水用无菌棉签涂抹于PDA培养基上，作为对照。
将培养基置于28℃暗室恒温培养5天，定时观察，当有新的菌丝或菌落出现时转接至新的PDA培养基上，直至纯化为单一菌落为止，采用PDA试管斜面培养基保存已纯化的菌种，各两只。
3.2.1.5菌种的保藏
将纯化完全的菌株接种至PDA试管斜面培养基中，28℃暗室恒温培养，待斜面菌体生长丰满后，放入冰箱，4℃保存，每3个月活化转接一次。
3.2.2菌株次生代谢产物检测
3.2.2.1菌株的小样培养
液体培养基为马铃薯葡萄糖培养基（PDB），100ml三角瓶装液量30ml，高压灭菌后，冷却备用。
将要培养的菌株转移至PDA平板上，28℃暗室恒温培养至一定菌落。
用7mm无菌打孔器将培养纯化完全的菌落打取相同大小的菌饼接种于培养液中，每一菌株接种3瓶，以验证其重复性。
28℃,120r/min培养96小时后，作为发酵液种子小样。
移液管吸取相同体积的发酵液种子小样转接至装液量为50ml的150ml三角瓶中，28℃,120r/min培养96小时。
3.2.2.2内生菌发酵液的提取处理
将发酵好的内生菌发酵液离心（10000r/min）10min（上清液呢），过滤，浓缩，加甲醇溶解，定容至5ml，0.45µ
m微孔滤膜过滤，置进样小瓶中备用。
3.2.2.3薄层色谱法（TLC）检测绿原酸
将处理后的发酵提取液适当浓缩作为供试品溶液。
另取绿原酸对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。
照薄层色谱法（2010年中国药典附录ⅥB）实验，吸取供试品试液10-20µ
l,对照品溶液10µ
l，分别点于同一硅胶H薄层板上；
以乙酸丁酯：
甲酸：
水=7：
2.5：
2.5的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，FeCl3显色剂显色。
3.2.2.4高效液相色谱法（HPLC）检测绿原酸
参照《2010版药典》进行测定，色谱条件与系统适应性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；
以乙腈：
0.4%磷酸溶液（13：
87）为流动相；
流速1ml/min；
柱温25℃；
检测波长327nm；
进样量10µ
L，理论塔板数按绿原酸峰计算应不低于1000。
3.2.3内生真菌的形态学鉴定
3.2.3.1传统鉴定方法
本实验对于内生真菌进行了初步的的形态鉴定，主要通过观察其孢子形态、产孢结构、产孢方式等来进行，目前主要对其进行形态学鉴定，方法如下：
挑取纯化的真菌菌丝，分别接种于PDA和察氏培养基上，采用3点接种法培养，肉眼观察菌落正反面特征；
采用插片培养法对孢子进行显微观察。
参照《真菌鉴定手册》进行鉴定，可将内生菌初步鉴定到属水平。
如果更加准确的鉴定需要做分子生物方面的研究，由于时间的限制，未对菌株做分子生物学方面的实验。
3.2.3.2分子生物学鉴定方法
传统的内生菌鉴定方法过于繁琐和复杂，而微生物的形态学特征和生理生化特征是有其内部的核酸分子所决定的，因此对筛选得到的菌株，通过对内生菌ITSrDNA序列的分析进行鉴定，并利用DNAman软件构建系统发育树鉴定内生菌已经成为菌种鉴定的主要方法。
3.2.4二次发酵培养基的优化
3.2.4.1固体基本培养基的选择
将菌株B-4-15接种于PDA平板上，28℃，倒置培养，待菌落生长为培养皿1/3时，用无菌打孔器沿着菌落边缘打取相同大小的菌饼，直径为5mm，分别转接至各种供试固体培养基上。
置恒温培养箱中，28℃，倒置培养。
以菌落的生长速度及长势为指标，选择最适合于菌株生长的固体培养基。
3.2.4.2液体基本培养基的选择
制备菌株种子液，并以10%接种量接入到下列液体培养基中：
玉米粉葡萄糖培养基、马铃薯蔗糖培养基、豆芽汁葡萄糖培养基，28℃,120r/min摇床培养至菌球分散均匀。
培养结束后，测定菌株B-4-15的菌丝干重；
将发酵液进行提取，利用高效液相测定绿原酸含量，从而确定最佳液体培养基。
3.2.4.3发酵条件的单因素优化
碳源的选择
以选择出的最适液体培养基为测定碳源的基本培养基，分别以以下碳源代替培养基中的碳源：
葡萄糖、蔗糖、淀粉、乳糖。
培养条件及测定方法同液体培养基的选择一致。
氮源的选择
以选择出的最适液体培养基为测定氮源的基本培养基，供试氮源分别为硝酸铵、硝酸钠、蛋白胨、尿素，培养条件及测定方法同液体基本培养基的选择一致。
温度的选择
已选择出的最适液体培养基为基本培养基，分别在26℃、28℃、30℃、32℃的条件下进行培养，培养条件及测定同上。
3.2.4.4发酵条件的正交试验
发酵条件的单因素优化只能客观评价培养基中各成分所起的作用，而对于培养基整体而言还需要做下一步的实验工作，接下来会以菌株中绿原酸含量为指标，进行发酵条件的正交实验，优选最佳的碳源、氮源浓度和最佳培养温度。
以上述试验选择的碳源、氮源、温度、pH值这4个因素分别选取3个水平，进行L9（34）正交试验，在最适温度下进一步优化发酵试验，正交试验各因素及水平见表1：
表2正交试验因素水平
因素
水平
1
2
3
A碳源浓度
1.5%
2%
2.5%
B氮源浓度
0.2%
0.25%
0.3%
CpH
6.5%
7.0%
7.5%
D温度
26℃
28℃
30℃
3.2.5金银花内生真菌的抑菌实验
将3株内生真菌接种于PDA培养基上培养，待菌落生长为培养皿1/3，7mm打孔器打取菌饼转接至PDB培养液中发酵，摇床120r/min，28℃恒温培养96小时，将发酵液10000r/min离心10min，取上清液至小瓶中备用。
抑菌活性测试采用纸片扩散法：
将金银花内生真菌代谢产物分别配成1mg/mL的甲醇溶液，然后去50µ
L的各菌株次生代谢产物溶于小滤纸片，使其充分吸收，平方与分别含有金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌的琼脂水培养基上，每株真菌对3中测试菌分别作3个重复，金银花提取液作为阳性对照。
将制好的培养皿在37℃恒温培养24小时后观察，测定其抑菌圈大小。
4结果与分析
4.1菌株筛选的结果
将金银花不同组织部位（根、茎、叶、花）先在自来水下冲洗干净，去除表面的泥土与灰尘，无菌滤纸吸干表面水分，然后按照以上程序进行表面消毒。
表3金银花不同组织的内生真菌种类及分布
部位
菌株数（株）
涉及属的数目（株）
占总菌株数的比例
涉及属占总属数的比例
根
21
4
26.58%
44.44%
茎
25
7
31.65%
77.78%
叶
17
21.52%
花
13
5
16.46%
55.56%
总计
79
9
100%
通过对金银花内生真菌的分离，共得到内生真菌79株，其中从金银花根部分离得到21株，约占26.58%；
从茎部分离得到25株，约占31.65%；
从叶片中分离得到17株，约占21.52%；
花蕾中分离得到13株，约占16.46%。
由此可知金银花茎中内生真菌种类丰富，其次为根和茎，花中内生真菌数量最少。
本实验表明了在健康的金银花组织中存在着丰富的内生真菌，而其种类与数量则与其分离部位有关。
4.2菌株次生代谢产物检测结果
4.2.1薄层色谱法（TLC）检测
采用薄层色谱法进行初选，筛选出的三个菌株的次生代谢产物疑似绿原酸，三株菌株与绿原酸对照品具有相同的Rf值，且Rf值在0.5左右。
薄层层析图谱如下：
图1三株菌株发酵液薄层色谱图
A:
A-3-24，B:
B-4-15，C:
B-4-31,D:
绿原酸对照品，E：
金银花提取液
Rf值：
0.451,B:
0.452,C:
0.449,D:
0.449,E:
0.452
4.2.2高效液相色谱法（HPLC）检测
采用高效液相色谱法进一步确认：
三株内生真菌A-3-24，B-4-15，B-4-31与绿原酸对照品保留时间相近，均在7.915min左右。
三株菌株发酵液与绿原酸品液相色图谱如下：
图2绿原酸标准品发酵液液相色谱图
6号峰，保留时间为7.915min。
峰面积为2148992.7
图3菌株A-3-24发酵液液相色谱图
15号峰，保留时间为7.915min。
峰面积为257018.0
图4菌株B-4-15发酵液液相色谱图
14号峰，保留时间为7.933min。
峰面积为160309.2
图5菌株B-4-31发酵液液相色谱图
12号峰，保留时间7.928min。
峰面积为165023.6
标准曲线的绘制：
通过改变进样体积，得到不同进样量X下的峰面积Y，进而绘制标准曲线：
Y=222428x-88456,R2=0.9992。
表4标准曲线的绘制
表5三株内生真菌发酵液绿原酸含量计算
液相编号
保留时间/min
峰面积
含量（μg/ml）
标准品
7.915
2148992.7
76.8
A-3-24
257018.0
11.928
B-4-15
7.933
160309.2
8.588
B-2-31
7.928
165023.6
8.752
其中，24，15，31号样品与对照品保留时间基本一致，说明24，15，31号内生真菌菌株的发酵液可能含有绿原酸类物质。
根据三株内生真菌发酵液液相分析，保留时间与对照品保留时间一致，可以看出三株内生真菌发酵液中含有绿原酸。
4.3内生真菌的形态学鉴定结果
4.3.1传统鉴定方法
4.3.1.1菌株形态学描述
图6A-3-24菌落形态
图7B-4-15菌落形态
图8B-4-31菌落形态
表6三株内生真菌生理形态描述
菌株
颜色
菌丝
培养基
边缘
分泌物
黄色
辐射状生长
结合牢固
不整齐
无
干燥
整齐
红色液滴
B-4-31
淡绿色
干燥，皱缩
结合不牢固
无色液滴
4.3.1.2显微形态鉴定
通过对三株内生真菌的菌落形态及显微形态观察，观察其孢子形态，产孢方式，孢子囊及孢子柄等显微形态来初步推测菌株的分类地位。
三株内生真菌的显微形态如下：
图9菌株A-3-24镜下特征（10×
40）（孢子及孢子柄显微形态）
图10菌株A-3-24镜下特征（10×
40）（孢子囊及孢子柄显微形态）
图11菌株B-4-15镜下特征（10×
40）（孢子囊及孢子柄显微特征）
图12菌株B-4-31镜下特征（10×
40）（孢子囊及孢子形态）
根据对三株内生真菌镜下显微形态的观察，初步鉴定结果如下：
表7三株内生真菌显微形态描述
显微特征
孢子
分生孢子梗
真菌菌丝
分类归属
分离部位
圆形，孢子浅红色
孢子梗细长，无分支
菌丝有分支，有隔
毛霉属
叶片
圆形或类圆形，孢子单生
分生孢子聚集在分生孢子梗顶端呈头状。
菌丝有分支，无隔
青霉属
孢子单生，颜色淡绿色
分生孢子梗细长，有分支
菌丝体细长，有分支
曲霉属
表8金银花不同组织的内生真菌种类及分布
属（Genus）
根（Root）
茎（Stem）
叶（Leaf）
花（Flos）
总计（Total）
毛霉属（Mucor）
青霉属（Penicillium）
8
链格孢属（Alternaria）
犁头霉属（Absidia）
头孢霉属（Cephalosporieae）
头珠霉属（Piptoaephalis）
串珠霉属（Monilia）
丛梗孢属（Moniliaceae）
曲霉属（Asqergillus）
未确定（Unknown）
4.4二次
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