补肾化痰法对Alzheimer病模型大鼠行为学的影响及作用机制Word文件下载.docx

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正常组、空白组、模型组均给予等容积的生理盐水灌胃。

28d后采用Morris水迷宫进行行为学评价。

结果行为学结果显示高、中、低量组和西药组的平均潜伏期较模型组有明显缩短（P0.01）；

高、中量组的象限百分比较模型组有明显提高（P0.01），20%、40%区域较模型组有明显减少（P0.01）；

模型组大鼠空间探索的象限百分比和跨过原平台位置次数比正常组和空白组明显降低（P0.01）。

西药组和高、中、低量组的象限百分比和跨过原平台位置次数较模型组有明显提高（P0.01），并呈现一定量效关系（P0.01）。

结论补肾化痰法可显著改善AD模型大鼠的学习记忆障碍。

【关键词】补肾化痰法；

Alzheimer；

行为学【Abstract】ObjectiveToobserveeffectsandfunctionmechanismofreplenishingkidneyessenceandremovingphlegmtherapyonbehaviorintheratofAD.MethodsApplicationoftechnologytostereotacticbrainofratsinjectedBNMcondensedAβ2535+IBObuildADmodel.2weeksafterinjection,high,mediumandlowvolumeoftheratswereadministeredthedrugdecoction;

westernmedicinegroupwithHuperzineoralsuspension;

normalgroup,blankgroup,modelgroupweregivenequalvolumeofnormalsalineig.28daysaftertheMorriswatermazeusedforbehavioralevaluation.ResultsBehavioralresultsshowedhigh,mediumandlowvolumegroupandwesternmedicinegroupthantheaverageincubationperiodofthemodelgroupwassignificantlyshorter（P0.01）;

highpercentageofthevolumegroupthanthequadrantofthemodelgrouphadmarkedlyimproved（P0.01）,20%,40%thantheregionhassignificantlyreducedthemodelgroup（P0.01）;

modelgroupthepercentageofspaceexplorationandthequadrantacrosstheformerplatformpositionthanthenormalgroupandblankgroupweresignificantlylower（P0.01）.Westernmedicinegroupandthehigh,mediumandlowpercentageandcrossedthequadranttheoriginalplatformlocationofthevolumegroupthaninthemodelgrouphadmarkedlyimproved（P0.01）,andacertaindoseeffectrelationship（P0.01）.ConclusionBushenHuatanmethod（replenishingkidneyessenceandremovingphlegmtherapy）cansignificantlyimprovetheADmodeloflearningandmemoryimpairmentinrats.【Keywords】replenishingkidneyessenceandremovingphlegmtherapy;

Alzheimer;

behavior阿尔茨海默病（Alzheimer’sdisease,AD）是一种以进行性记忆障碍和智能衰退为主要临床特征的中枢神经系统退行性疾病，随着人口老龄化的日趋严重，AD已经成为危害老年人健康的主要疾病之一［1］，是目前公认具有世界性的公共卫生事业重大问题，被称为“即将到来的21世纪的瘟疫”［2，3］。

目前AD病因和病理机制尚未完全明了，更无确切疗效的药物。

寻找确能根治AD药物已成为当今国际热点课题之一。

目前西医主要是对症治疗，治疗的目的是延缓AD的进展和促进神经元的功能恢复以改善症状。

治疗的策略是根据现有损害神经元的各种因素或AD脑中代谢异常来设计不同作用位点的各种药物，但是这些药物价格昂贵，毒副作用较大，不能支持老年人用药的要求［4，5］。

中医药在延缓衰老以及衰老相关疾病的防治方面有着丰富的理论和实践经验，以其疗效较好、综合效益高、副作用少而显示了良好的前景。

为此，我们首先建立了大鼠AD模型，并采用Morris水迷宫进行行为学测试，观察补肾化痰法对AD模型大鼠行为学的影响，并用哈伯因混悬液作对照，旨在进一步探讨中药治疗AD的作用及机理。

1实验材料1.1动物15月龄Wistar大鼠70只，雌雄各半，体重450±

50g，由湖北省实验动物研究中心提供。

1.2主要试剂Aβ2535和IBO购于Sigma公司。

1.3主要仪器和设备Morris水迷宫装置（中国医学科学院），脑立体定位仪（北京硕林苑科技有限公司），微量注射器1μl（上海医用激光仪器厂），电子天平（AL104，梅特勒托利多公司）。

1.4药物补肾化痰方由制首乌、石菖蒲、竹节参、茯苓、陈皮、半夏、白芥子等组成,购自湖北中医学院国医堂门诊部。

中药经水煎制成浓缩液。

哈伯因,购自河南众生制药股份有限公司豫中制药厂,批号:

060321.2实验方法2.1动物分组①Aβ2535+IBO模型组（简称模型组）,②假手术组（简称空白组）,③正常组,④哈伯因治疗组（简称西药组）,⑤补肾化痰法高剂量组（简称高量组）,⑥补肾化痰法中剂量组（简称中量组）,⑦补肾化痰法低剂量组（简称低量组）。

2.2AD模型构建模型组大鼠用2％戊巴比妥钠（40mg/kg）腹腔注射麻醉后，固定于脑立体定位仪上，颅顶正中切开暴露至颅骨，根据大鼠颅脑立体定位图谱，对基底核立体定位（位置:

前囟后3.8mm，中线旁开2.5mm，深度3mm），用牙科钻钻开颅骨，用1μl微型进样器注射针5min内缓慢注入Aβ2535+IBO混合液1μl，留针10min.注射完毕后以局部软组织封闭针孔，缝合皮肤。

术后给予青霉素钠盐5万单位肌注，每天1次，连续3d.空白组在定位下给予大鼠BNM一次性注射1μl灭菌生理盐水。

2.3给药脑内注射2周后给药。

给药量均按人与大鼠体表面积系数比确定，以临床人用药等效剂量为中剂量，模型组、空白组、正常组给予生理盐水灌胃，1ml/100g·

d，连续28d.西药组给予哈伯因混悬液灌胃，1ml/100g·

d，连续28d.高量组、中量组、低量组分别给予补肾化痰方水煎液灌胃，含生药分别是2g/ml，1g/ml，0.5g/ml，1ml/100g·

d，连续28d.2.4检测指标及方法2.4.1Morris水迷宫实验造模结束后进行Morris水迷宫行为检测，评价其学习记忆成绩。

主要进行定位航行和空间探索实验。

2.4.1.1定位航行实验定位航行实验用于测量大鼠通过一段训练后，对空间的学习记忆能力。

每日上下午各4次,将大鼠面向池壁分4个象限放入水中,记录其在2min内寻找到平台的时间（逃避潜伏期）。

如果大鼠在2min内未找到平台，则用手牵引其至平台上，让大鼠停留10s，计算机会自动记录大鼠在实验期间的行程，并转换为行程转迹图，所经过长度、所需的时间，每个象限的行程长度、每个象限行程的时间、速度、各个象限的行程长度占总长度的百分比，各个象限的行程时间占总时间的百分比。

数据的采集和处理由Morris迷宫图像自动监视处理系统完成，历时4d.2.4.1.2空间探索实验5d撤除平台，进行空间探索实验。

将大鼠任选1个入水点放入水中，记录其2min内跨越原平台位置的次数。

两实验还记录大鼠在平台象限的游泳距离占总距离百分比，池壁20%和40%区域游泳距离百分比，以判断动物记忆储存及再提取能力。

2.5统计处理所有计量检测结果以均数±

标准差（±

s）表示。

采用SPSSFORWINDOWS15.0统计软件包统计分析。

3结果3.1大鼠平均逃避潜伏期在实验前两天，各组动物基本围绕池壁游泳，较少游向平台附近，其运动轨迹呈随机分布于各象限之中。

但随着实验的推进，正常组、空白组大鼠依靠空间线索找到平台位置的时间逐渐缩短，其运动轨迹也慢慢位于平台象限，或者在平台象限相邻两侧的象限寻找，其潜伏期迅速下降。

但模型组大鼠除极少数能找到平台外，基本保持前两天时的情形，稍有改善。

为分析信息获取能力，测量了4d训练的总潜伏期和训练末2d的后潜伏期。

从表1可知，模型组平均潜伏期比正常组和空白组明显延长，有统计学意义（P0.01）。

西药组和高、中、低量组的平均潜伏期较模型组明显缩短，与模型组比较有统计学意义（P0.01）。

进一步的组间比较发现高量组与西药组比较有统计学意义（P0.01）。

中、高量组比较也有统计学意义（P0.01）。

表1大鼠定位航行实验前4d和后2d平均潜伏期结果3.2大鼠平均游泳距离定位航行实验中，观察了实验大鼠在实验平台象限的游泳距离占总距离百分比，池壁20%和40%区域游泳距离百分比（分别简称象限百分比、20%区域、40%区域）（见表2）。

从表中可见，模型组大鼠游泳的象限百分比较正常组和空白组大鼠明显缩短。

高、中量组的象限百分比较模型组有明显提高（P0.01），低量组的象限百分比较模型组无差异（P0.05）。

进一步的组间比较发现低量组与西药组的差异具有统计学意义（P0.01）。

高、中、低量组的20%、40%区域较模型组有明显减少（P0.01），并随剂量的增加，其值相应的减少，但中、高量组间比较，除20%区域外并无统计学意义（P0.05）；

与西药组比较也无明显的差异（P0.05）。

低量组20%、40%区域与西药组比较有统计学意义（P0.01）。

3.3大鼠搜索平台变化趋势大鼠在寻找平台的过程中表现出不同方式，一些大鼠进入水池后无目的游动，往往速度较快，但经常找不到平台；

还有一些大鼠经过几次训练后，对环境的记忆已经非常深刻，一入水直接游向平台；

更多的大鼠在学习过程中总是注意观察周围的环境，并识别水池内壁的不同图形标志，根据标志与平台的相对位置去寻找平台，这些大鼠总是先游到某一特定的象限，看到标志后又到平台。

从表3中可看出，模型组大鼠空间搜索能力显著下降，其象限百分比较正常组和空白组明显缩短（P0.01），20%、40%区域较正常组和空白组明显增加（P0.01）。

正常组和空白组之间无统计学意义（P0.05）。

高、中、低量组的象限百分比较模型组明显增加，有统计学意义（P0.01）。

高量组的象限百分比、20%区域与西药组的差异具有统计学意义（P0.01或P0.05）。

20%区域中、高量组比较有显著差异（P0.01）。

40%区域低、中量组比较有统计学意义（P0.05）。

表2大鼠定位航行实验学习记忆结果表3大鼠空间搜索实验学习记忆结果3.4大鼠跨越平台的次数对各组大鼠跨越原平台位置的次数进行了比较，从表4中可看出，模型组大鼠较正常组和空白组大鼠跨越原平台位置次数明显下降，有统计学意义（P0.01）。

西药及中药各组与模型组相比，差异均具有统计学意义（P0.01）。

西药组与中、高量组比较有统计学意义（P0.01或P0.05），与低量组比较无统计学意义（P0.05），高量组与中量组比较也有统计学意义（P0.05）。

表4大鼠跨越原平台位置次数结果4讨论AD早期表现主要是健忘，并伴有其他高级功能的障碍，学习记忆障碍是AD患者一个重要的临床症状和特征。

AD最早和最重要的症状之一是比较突出的近期记忆受损［6］。

Aβ2535和IBO脑内注射可以很好地模拟AD行为学和病理学表现，但仍缺乏深入的行为学研究，作者用Morris水迷宫行为评价该模型的行为学特征具有重要意义。

Morris水迷宫实验能够较准确地反映动物的学习记忆能力，可作为检测实验动物学习记忆水平的重要工具。

Morris水迷宫所检测的是大鼠在多次的训练中，学会寻找固定位置的隐藏平台，形成稳定的空间位置认知，这种空间认知是加工空间信息（外部线索）形成的，所形成的记忆是一种空间参考记忆。

从信息的加工和提取方式来看，这种空间参考记忆进入意识系统，其储存的机制主要涉及边缘系统（如海马）以及大脑皮层有关脑区，属于陈述性记忆。

而临床健忘和痴呆的患者，正是陈述性记忆首先受损，而且比较突出。

所以从检测的记忆属性来说，运用Morris水迷宫行防治此类疾病有效药物的筛选研究比较恰当。

通过比较前几天的训练情况，可以获得动物获取空间信息的能力和学习的能力，而探索实验可以判断动物记忆储存能力及提取再现能力。

本实验采用凝聚态的Aβ2535和IBO直接注射大鼠BNM建立AD模型，2周后用水迷宫观察了大鼠学习记忆的变化［7～9］。

在水迷宫实验中，随着学习次数的增加，各组大鼠逃避潜伏期和游泳距离逐渐缩短，说明各组大鼠在4d游泳训练中对于寻找平台均有一定的学习记忆能力。

但是，不同组之间改变显著不同，表现了大鼠不同的学习记忆能力。

模型组在水中游泳寻找平台的潜伏期明显高于正常组和空白组；

随着训练时间的延长，模型组大鼠找到平台的时间逐渐缩短，缩短的幅度较正常组和空白组均小。

在平台的停留位置亦少于正常组和空白组。

对大鼠在寻找平台过程中表现出的不同方式比较发现，正常组大鼠往往采取直接游向平台，或者根据水池壁标志寻找平台的方式较快地找到平台，表明这些大鼠对环境的记忆已经非常深刻，空间定向能力好，而模型组大鼠进入水池后无目的地游动，经常找不到平台。

从大鼠定位航行实验、空间搜索实验、跨越原平台位置次数实验的结果显示，该模型具有认知功能障碍。

通过补肾化痰法和哈伯因干预，补肾化痰法高、中、低量组和西药组较模型组大鼠逃避潜伏期缩短，跨越原平台次数增加，表明补肾化痰法对AD模型大鼠的学习记忆障碍有改善作用。

AD属中医学的呆病、郁证、文痴等范畴，以本虚标实为主要特征，本虚在于肾的精气不足，标实在于痰浊，一方面肾虚为主的脏腑功能失调可导致痰浊的产生，即因虚致实，另一方面，痰浊为患又可影响气血津液的化生和运行，致本虚更甚，即因实而致虚，两者互为因果，形成恶性循环，以致病程缠绵，见症多端，所以本病以补肾化痰为基本治法［10,11］。

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