ISO6579食品和动物饲料微生物学沙门氏菌检测Word下载.docx
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以下标准文件是本标准的参考标准。
已过期的文献，后来改善或修订的，部分这种文献已经不适用。
然而，有大部分学者正在争取发布最新版的文献如以下列出。
对于无限期的文献，最新版本都是适用的。
ISO和IEC成员保存当前有效国际性标准的记录。
ISO6887-1，食物与动物饲料原料微生物学——样品准备原则，微生物检测样品原液及十倍法稀释——第一部分：
样品原液和十倍法稀释的指导准则。
ISO7218，食物与动物饲料原料微生物学——微生物检验指导准则。
ISO8261，牛奶和奶制品——微生物检测样品准备、品原液和十倍法稀释的指导准则。
3术语和定义
以下术语和定义适用于本标准。
3.1沙门氏菌
按照本国际标准操作，在固体选择性培养基上形成典型或略典型的菌落，并且生物学反应和血清学反应符合要求。
3.2检测沙门氏菌
按照本国际标准操作，检查一定重量或体积的样品存在或不存在沙门氏菌。
4原理
4.1概述
沙门氏菌的检测有四个必须的连续阶段（也可见附录A）。
注意：
沙门氏菌可能以很少数量存在，并伴随大量的肠杆菌属或其它属细菌存在。
此外，检测低数量的受损的沙门氏菌，前增菌是必要的。
4.2使用非选择性液体培养基前增菌
缓冲蛋白胨水环境温度培养是检测的一部分，然后37℃±
1℃培养18h±
2h。
对于特定的食品，使用其它的前增菌是必要的（见9.1.2）。
如果是大量的样品，在接种前，缓冲蛋白胨水必须先预热至37℃±
1℃。
4.3选择性液体培养基中增菌
使用RV大豆培养基（RVS肉汤）和MK连四硫酸盐/新生霉素（MKTTn肉汤）肉汤。
RVS肉汤41.5℃±
1℃，24h±
3h。
MKTTn肉汤37℃±
4.4平板划线和鉴定
使用两种选择性固体培养基：
——木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂（XLD琼脂）；
——任何对XLD琼脂做补充的固体选择性培养基，并能分离乳糖阳性的伤寒沙门氏菌和副伤寒沙门氏菌。
实验室可以自己选择使用哪一种培养基。
XLD琼脂37℃±
1℃培养24h±
另一种培养基根据生产商的要求培养。
如亮绿琼脂（BGA），亚硫酸铋琼脂可供选择。
4.5确认试验
假定沙门氏菌菌落进行次培养，做适当的生化学和血清学试验来鉴定。
5培养基和试剂、血清
5.1概述
一般实验室实践，参照ISO7218。
5.2常规培养基和试剂
由于需使用到大量的培养基和试剂，其成分和准备查看附录B。
5.2.1非选择性钱增菌培养基：
缓冲蛋白胨水
见B.1。
5.2.2第一个选择性增菌培养基：
RV大豆培养基（RVS肉汤）
见B.2。
5.2.3第二个选择性增菌培养基：
MK连四硫酸盐/新生霉素（MKTTn肉汤）肉汤
见B.3。
5.2.4固体选择性平板培养基
5.2.4.1第一个培养基：
木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂（XLD琼脂）
见B.4。
5.2.4.2第二个培养基
第二种适当的培养基的选择取决于试验室的判断。
必须按照生产商的要求配制培养基。
5.2.5营养琼脂
见B.5。
5.2.6三糖铁琼脂（TSI琼脂）
见B.6。
5.2.7尿素琼脂（西蒙氏）
见B.7。
5.2.8L－赖氨酸脱羧酶培养基
见B.8。
5.2.9牛乳糖检测试剂
见B.9。
5.2.10VP反应试剂
见B.10
5.2.11吲哚反应试剂
见B.11。
5.2.12半固体营养琼脂
见B.12。
5.2.13生理盐水溶液
见B.13。
5.3血清
一般可买到含有一种或多种O抗原的血清。
例如：
抗体血清包含一种或多种“O”，称为单价或多价“O”抗体血清，“Vi”血清。
还有包含一种或多种H抗原的血清。
必须确认所使用的血清适合检测所有类型的沙门氏菌。
6设备和玻璃器皿
使用一般微生物实验室设施（见ISO7218）,另有以下增加。
6.1干热灭菌或湿热灭菌设备
见ISO7218。
6.2干燥箱或烘箱，鼓风式，能达到37℃～55℃
6.3培养箱，可恒温37℃±
1℃
6.4水浴锅，可恒温41.5℃±
6.5水浴锅，可恒温44℃～47℃
6.6水浴锅，可恒温37℃±
6.7接种环，直径3mm
6.8pH计
6.9试管或三角瓶
6.10刻度移液管或移液器，10ml和1ml
6.11平皿，小尺寸的（直径90mm～100mm）和大尺寸的（直径140mm）
7取样
ISO6888中并不涉及取样。
如果没有相关的国际标准，建议需经过多方同意。
微生物实验室接收到的样品必须是真实代表样品的，并在运输和储藏期间没有损坏或改变微生物的性状。
8样品前处理
参照样品的相关国际标准进行前处理。
9程序
9.1测试部分和样品原始悬液
9.1.1概述
参照ISO6887-1，相关细节可参考各个样品的标准。
牛奶或奶制品参照ISO8261。
样品原始悬液的准备，一般使用钱增菌培养基。
如果取样量大于25g，使用前增菌培养基补足至1:
10悬液。
当不只一份25g的样品进行检测时，为了降低检测工作量，并且合成物不会影响样品的检测，可以将多个检测部分合成为一个部分。
例如，如果有十份25g的样品检测，可以把这十个样品合成成为一份250g的样品，添加2.25L前增菌肉汤。
可以选择，将0.1ml（在10mlRVS肉汤中）和1ml（在10mlMKTTn肉汤中）的前增菌肉汤合并为一份，添加至100ml选择性培养基中。
9.1.2特殊食物样品原始悬液的准备
以下操作只用于沙门氏菌的检测。
详细的细节可参照ISO6887-2，ISO6887-3，ISO6887-4和ISO8261。
9.1.2.1可可粉和含有可可粉的产品（大于20％）
加入含50g/l酪蛋白的缓冲蛋白胨水（避免使用酸酪蛋白），或100g/l灭菌脱脂奶粉，培养2h后，如果样品中含有大量的革兰氏阳性菌群，添加0.018g/l亮绿。
9.1.2.2酸性和变酸食品
要确保前增菌过程中pH值不会低于4.5。
如果使用双倍浓度缓冲蛋白胨水水会使酸性和变酸食品的pH值比较稳定。
9.2非选择性前增菌
将原始悬液在37℃±
1℃下培养18h±
9.3选择性增菌
9.3.1接种0.1ml9.2中的培养物至10mlRVS肉汤；
接种1ml9.2中的培养物至10mlMKTTn肉汤。
9.3.2RVS肉汤41.5℃±
1℃下培养24h±
3h；
必须检查培养温度不能超过限值42.5℃。
9.4划线平板并鉴别
9.4.1培养24h±
3h后，取一环RVS肉汤培养物划线至大尺寸的XLD平板，以便能很好的分离出单个菌落。
如果没有大尺寸的平板，使用两个小尺寸平板代替。
同样划线第二种选择性固体培养基。
9.4.2培养24h±
3h后，取一环MKTTn肉汤，重复9.4.1操作划线两种选择性平板。
9.4.3倒置平板，放置于培养箱中。
XLD平板37℃培养，第二种培养基培养温度参照生产商要求。
9.4.4培养24h±
3h后，检查是否存在典型的沙门氏菌菌落，或不典型的可能为沙门氏菌的菌落。
XLD平板上的典型沙门氏菌菌落为黑色中心，周围有一圈微红色的透明圈，由于培养基的指示剂。
H2S阳性沙门氏菌为粉红色中心深粉红色。
乳糖阳性沙门氏菌为黄色有或没有黑色中心。
按照生产商的要求培养第二种培养基，检查有没有典型菌落出现。
9.5证实
9.5.1概述
商业的沙门氏菌生化鉴定盒如果确认可靠，即可供使用。
生化鉴定盒的使用涉及到菌落的生化特性确认。
必须按照生产商的说明使用。
沙门氏菌菌落的辨别需要很大深度的经验，不仅是逐个逐个血清型，而且是一批批选择性培养基的使用。
9.5.2挑选菌落做确认
每个选择性平板至少挑选一个典型菌落或疑是菌落做确认，如果第一个菌落为阴性，必须重新挑选四个菌落。
流行病学研究一般会挑选五个菌落。
如果平板上少于五个典型或疑是菌落，挑选所有菌落做确认。
将挑选的菌落划线营养琼脂平板，更好地分离单个菌落。
37℃±
使用纯培养物做生化鉴定和血清学鉴定。
9.5.3生化鉴定
9.5.3.1概述
用接种针将9.5.2获得的菌落接种至9.5.3.2到9.5.3.7培养基中。
9.5.3.2TSI琼脂
在斜面琼脂上划线并穿刺。
按照下面说明记录培养基的变化：
a）底层
黄色：
葡萄糖阳性（葡萄糖利用）
红色或无变化：
葡萄糖阴性（葡萄糖不理用）
泡沫或葡萄糖产气形成龟裂
b）斜面
乳糖和/或蔗糖阳性（乳糖和/或蔗糖利用）
乳糖和/或蔗糖阴性（乳糖和/或蔗糖不利用）
典型沙门氏菌为碱性（红色）斜面和酸性（黄色）底部，产气（泡沫），并且（90％个例）产生硫化氢（琼脂变黑）（9.5.3.8）。
如果分离出乳糖阳性沙门氏菌，TSI斜面应该是黄色的。
因此，沙门氏菌的初步鉴定不能仅依靠TSI琼脂的结果（见9.5.3）。
9.5.3.3尿素琼脂
划线斜面琼脂。
并间隔性做检查。
如果反应为阳性，尿素氨释放，将培养基颜色由酚红变为淡粉红，而后变为深樱桃色。
通常2h～4h内会出现该反应。
9.5.3.4L－赖氨酸脱羧酶培养基
接种至液体培养基表面之下。
混浊和出现紫色为阳性结果。
黄色为阴性结果。
9.5.3.5检测β－牛乳糖
接种一环嫌疑菌落至含有0.25ml生理盐水的试管中，滴加1滴甲苯并振荡试管。
水浴37℃下培养数分钟（大约5min）。
添加0.25mlβ－牛乳糖检测试剂并混匀。
将试管重新放回水浴锅，37℃下培养24h±
不时观察试管。
黄色为阳性反应。
一般20min后出现。
如果使用成品试纸，必须按照说明书操作。
9.5.3.6VP反应
接种一环嫌疑菌落至含有3mlVP培养基的试管中，37℃下培养24h±
培养完毕后，添加2滴肌氨酸试剂，3滴1-萘酚乙醇试剂，2滴氢氧化钾试剂。
振荡。
在15min由粉红色变为鲜红色为阳性反应。
9.5.3.7吲哚反应
接种一环嫌疑菌落至含有5ml胰蛋白胨/色氨酸培养基中，37℃±
培养后，添加1ml靛基质试剂。
红色为阳性反应。
黄褐色为阴性反应。
9.5.3.8生化测试解释
见表1。
9.5.4血清学反应和分型
9.5.4.1概述
通过血清和纯菌落的凝聚反应来证实沙门氏菌Q-、Vi-、H-抗原的存在，并要排除自凝集菌落。
按照说明书使用血清。
特殊情况如下。
9.5.4.2排除自凝集菌种
在干净的玻片上滴1滴生理盐水。
使用接种环，将液滴分散，用单菌落的一部分，以得到同类的和混浊的悬液。
也可以先将菌落在一滴水中分散，在与1滴生理盐水混合。
轻轻摇动30s～60s。
在深色的背景下观察结果，可使用放大镜观察。
如果菌体能结成多或少的块状，可认为自凝集。
不适宜做随后的血清学鉴定。
表1生化反应分析
测试
沙门氏菌分型
伤寒沙门氏菌
甲型伤寒沙门氏菌
乙型伤寒沙门氏菌
丙型伤寒沙门氏菌
其它型
反应
％b
TSI葡萄糖产酸
TSI葡萄糖产气
TSI乳糖产酸
TSI蔗糖产酸
TSI产硫化氢
尿素水解
赖氨酸脱羧
β－牛乳糖
VP
产生吲哚
+
-d
-
100
2
97
98
10
92
1
95
2e
a见参考文献〔5〕。
b这个百分数表示不是所有的沙门氏菌血清型表现为+或-。
这个比例会随着不同地区的食品中毒血清型而变化。
c该百分数还未得知。
d伤寒沙门氏菌是产气的。
e肠道沙门氏菌亚种为阳性或阴性乳糖反应，但β－牛乳糖反应通常为阳性。
9.5.4.3O-抗原检查
用不会自凝集的纯菌落，按照9.5.4.2的操作，使用O-抗体血清代替生理盐水，如果出现胶合，为阳性反应。
使用多价和多价血清检测。
9.5.4.4Vi-抗原检查
用不会自凝集的纯菌落，按照9.5.4.2的操作，使用Vi-抗体血清代替生理盐水，如果出现胶合，为阳性反应。
9.5.4.5H-抗原检查
接种不自凝集菌落纯菌落于半固体培养基。
使用该培养基检查H-抗原，按照9.5.4.2的操作，使用H-抗体血清代替生理盐水，如果出现胶合，为阳性反应。
9.5.5阐述生化鉴定和血清学反应结果
表2给出确认实验的结果。
表2确认实验阐述
生化反应
自凝集
血清反应
结果
典型的
NO
O-、Vi-或H-抗原阳性
菌种认为是沙门氏菌
所有反应阴性
可能是沙门氏菌
YES
没有测试
不典型反应
NO/YES
菌种认为不是沙门氏菌
9.5.6最后的确认
认为是沙门氏菌或可能为沙门氏菌的菌种必须送往公认的沙门氏菌检测中心做最后的确认。
必须提供菌种的相关信息及其是否与食物中毒有关。
10结果表达
根据确认实验的结果，报告xg或xml样品中存在或不存在沙门氏菌（见ISO7218）。
11测试报告
测试报告必须包括：
——取样方式，如果知道；
——任何培养基或培养条件的偏离；
——本标准中为提及的任何操作条件、细节，和可能对结果产生影响的细节；
——结果的获得。
当使用不是本标准指定的平板培养基，检测出阳性结果时，也需特殊说明。
12质量控制
为了检查实验室使用本标准及本标准描述的培养基检测沙门氏菌的能力，引入标准样品控制前增菌培养基的质量。
同样适用其它测试培养基。
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