色谱分离方法文档格式.docx

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下端带有玻璃塞的或不带有玻璃塞的以及带有垂熔筛板的均可选用。

吸附色谱所用的洗脱剂均为有机溶剂，因有机溶剂可溶解在玻璃塞上起润滑和密封作用的凡士林，故对玻璃塞的密封和润滑需要用淀粉甘油糊，而不能用凡士林。

在用不带有玻璃塞的色谱柱时，含氯的溶剂如氯仿、二氯甲烷等对胶管的腐蚀很大，常会导致胶管的膨胀和变形，在使用时要经常检查下端连接的胶管，以防洗脱剂发生泄漏，造成柱中的洗脱剂流干，导致分离的失败。

柱内径与柱长之比通常为1:

10－1:

20,若柱粗而短，则分离效果较差。

若柱过长而细，分离效果虽好，但流速慢，消耗时间太长。

样品长时间吸附在硅胶上和长时间被光照射会使样品中的某些成分发生变化，过长的柱子装填均匀难度也较大，故通常对于分离复杂样品常先使用短而粗的柱子进行粗分，然后对于已经过粗分且成分相对较简单的样品再用细而长的柱子进行分离。

所用的色谱柱应比装入吸附剂的柱长再长一段，以备存有一定量的洗脱剂。

为了防止溶剂的挥发及减少溶剂的加入次数，色谱柱上可覆一玻璃瓶或装一个分液漏斗，内存色谱用溶剂。

（二）．吸附剂的用量

吸附剂的用量要根据被分离样品的组成及其是否容易被分开而决定。

一般来说，吸附剂用量为样品量的20－50倍。

若样品中所含成分的性质很相似，则吸附剂的用量要加大，可增至100倍或更大些。

硅胶对极性较小的化合物如萜烯、倍半萜烯等的吸附力较弱，其用量应加大，可为样品量的100－200倍。

（三）．装柱方法

色谱柱要求填装均匀，且不带有气泡。

若松紧不一致，则被分离物质的移动速度不规则，影响分离效果。

装柱时首先将色谱柱垂直的固定在支架上，在管的下端塞少许棉花，使棉花成为一个表面平整的薄层，然后用下述方法装柱。

1．干装法将硅胶均匀的倒入柱内，中间不应间断。

通常在柱的上端放一个玻璃漏斗，使硅胶经漏斗成一细流状慢慢地加入柱内。

必要时轻轻的敲打色谱柱，使填装均匀，尤其是在填装较粗的色谱柱时，更应小心。

色谱柱装好后打开下端活塞，然后沿管壁轻轻倒入洗脱剂（注意在洗脱剂倒入时，严防硅胶被冲起），待硅胶湿润后，在柱内不能带有气泡。

如有气泡需通过搅拌等方法设法除去，也可以在柱的上端再加入洗脱剂，然后通入压缩空气使空气泡随洗脱剂从下端流出。

2．湿装法因湿法装柱容易赶走硅胶内的气泡，故一般以湿法装柱较好。

量取一定量体积的准备用作首次洗脱的洗脱剂（Vo），倒入色谱柱中，并将活塞打开，使洗脱剂滴入接受瓶内，同时将硅胶慢慢的加入；

或将硅胶放置于烧杯中，加入一定量的洗脱剂，经充分搅拌，待硅胶内的气泡被除去后再加入柱内（因后一种方法对硅胶内的气泡除去的较完全，故最常用）。

一边沉降一边添加，直到加完为止。

硅胶的加入速度不宜太快，以免带入气泡。

必要时可在色谱柱的管外轻轻给与敲打，使硅胶均匀的下降，有助于硅胶带入的气泡外溢。

硅胶加完后，仍使洗脱剂流滴一段时间，然后使色谱柱中高于硅胶面上的洗脱剂几乎全部流入接受瓶内，正确计量接受器中的溶剂量（V1），Vo-V1之差即为色谱柱内包含的洗脱剂的体积，即色谱柱的保留体积。

知道保留体积多少，就能主动掌握大致在什么时侯收集洗脱液，当变换洗脱剂的时侯，也能估计到新洗脱剂的流份在什么时侯开始。

为了使色谱柱装的更加均匀，提高分离效果，同时也为了除去硅胶中含有的杂质，通常是色谱柱装好后，先不急于上样品，而是先用洗脱剂洗脱一天，待回收洗脱剂后回收瓶中没有残渣时在上样品。

（四）．样品的加入

样品的加入有两种方法，即湿法加样和干法加样。

湿法加样虽然具有吸附剂对样品的死吸附较少和样品回收率较高等优点，但因所用溶剂较难选择、样品谱带较宽以及获得均匀的样品谱带较难等缺点，故较少使用。

1．湿法加样先将样品溶解于用作首次使用的洗脱剂的溶剂中，如果样品在首次使用的洗脱剂中不溶解，可改用极性较小的其它溶剂，但溶剂的极性要尽可能的小，否则会大大的降低分离效果，并有可能导致分离的失败（需完全溶解，不得有颗粒或固体）。

溶液的体积不能过大，体积太大往往会使色带分散不集中，影响分离效果，通常样品溶液的体积不要超过色谱柱保留体积的15％。

先将色谱柱中硅胶面上的多余洗脱剂放出，再用滴管将样品溶液慢慢加入，在加入样品时勿使柱面受到扰动，以免影响分离效果。

2．干法加样先将样品溶解在易溶的有机溶剂中。

样品体积不要太大，通常不要超过色谱柱保留体积的30％，否则会造成死吸附过多和大量样品进入多孔性硅胶的内部，影响分离效果和降低样品的回收率，同时样品与硅胶一同加热时间过长，也会导致样品中的某些成分发生变化。

但样品体积也不宜太小，样品体积太小会造成溶液过浓，同样也会影响分离效果。

称取一定量硅胶（通常为色谱柱中硅胶量的10％－15％），置于蒸发皿中，用滴管慢慢加入样品溶液，边加边搅拌，待硅胶已完全被样品溶液湿润时，在水浴锅上蒸除溶剂，如果样品溶液还没有加完，则可重复上述步骤，直到加完为止。

蒸除溶剂后的附有样品的硅胶在100°

C加热3小时除去水分后，按湿法装柱的方法装入柱内，但要注意在样品加入时不要使柱面受到扰动。

（五）．展开与洗脱

样品溶液全部加完后，打开活塞将液体徐徐放出，当液面与柱面相平时，再用少量溶剂洗涤盛样品的容器数次，洗液全部加入色谱柱内，开始收集流出的洗脱液，当液面与柱面相同时，缓缓加入洗脱溶剂，使洗脱剂的液面高出柱面约10厘米。

在柱面上加入一个直径与色谱柱内径相同的并扎有许多小孔的滤纸片，然后再加入约两厘米厚的硅胶（慢慢加入，并缓缓搅拌，尽量除去硅胶中的气泡），最后在硅胶上方加入一团脱脂棉花，以防止每次加入洗脱溶剂时破坏色谱柱面，影响分离效果。

有色物质在日光下即可观察到明显的色谱带，有些无色物质虽然在日光下观察不到色谱带，但在紫外光的照射下可以观察到明显的荧光色谱带。

流份的收集既可按色谱带收集，也可按等馏份收集法收集。

由于一个色带中往往含有多个成分，故现在常常采用等馏分收集法收集，即分取一定洗脱液为一份，连续收集。

理论上每份收集的体积越小，则将已分离开的成分又重新人为地合并到一起的机会就越少，但每份收集的体积太小，必然要大大的加大工作量。

每份洗脱液的收集体积，应根据所用硅胶的量和样品的分离难易程度的具体情况而定，通常每份洗脱液的量约与柱的保留体积或硅胶的用量大体相当。

如所用硅胶的量为200g，则每份洗脱液收集的量约为200ml。

但若所用洗脱剂的极性较大或被分离成分的结构很相近，则每份的收集量要小一些。

为了及时了解洗脱液中各洗脱部分的情况，以便调节收集体积的多少和选择或改变洗脱剂的极性，现在多采用薄层色谱或纸层色谱的方法来检查。

根据色谱的结果，可将成分相同的洗脱液合并或更换洗脱剂。

采用薄层色谱或纸层色谱的方法来检查洗脱液的分离情况，既可在回收溶剂之前，也可在回收溶剂之后，应根据具体情况而定。

通常当上样量较大时，回收溶剂后进行，当上样量较少时，则在回收溶剂之前进行。

回收溶剂后，用易溶的溶剂溶解，在放置过程中有时可得到单一成分。

如果仍是几种成分的混合物，则还需进行进一步的分离。

在整个操作过程中，必须注意不使吸附剂表面的液体流干，否则会使色谱柱中进入气泡或形成裂缝。

同时洗脱液流出的速度也不应太快，流速过快，柱中交换达不到平衡，均能影响分离效果。

（六）．洗脱剂（展开剂）的选择

硅胶、氧化铝等对天然药物中生物活性成分及化学成分的吸附属于物理吸附（physicaladsorption）,亦称表面吸附，是由于吸附剂表面分子与溶质及溶剂分子的分子间力相互作用而引起的。

物理吸附的特点是无选择性、吸附与解吸附过程可逆、且可快速进行，吸附强弱及先后顺序大体遵循“相似者易于吸附”的经验规律。

在分离过程中溶质分子与溶剂分子、溶质分子相互间对吸附剂表面发生不断争夺。

由于化学结构不同，其性质就不同，对吸附剂表面的争夺能力也就不会相同，故可以通过色谱方法将不同化学结构的成分分开。

同样溶剂不同，其对吸附剂表面的争夺能力就不同，故溶剂不同，其洗脱能力也就不同。

硅胶、氧化铝等均为极性吸附剂，故有以下特点：

化合物的极性越强，吸附剂对其吸附力就越强，流出柱的速度就愈慢或Rf值就越小；

洗脱剂的极性越大，其洗脱能力就愈强；

吸附剂的含水量愈大，其对化合物的吸附力就愈弱。

值得注意的是洗脱剂的洗脱能力与其极性虽有关系，但并不呈线性关系，如极性大体相同的氯仿－丙酮混合液和氯仿－甲醇混合液，其对化合物的洗脱能力可能会相差很大，有时用前者可以将几个化合物分开，用后者就不一定能分开，但也有可能相反。

在分离过程中不仅要考虑化合物与吸附剂表面的相互作用，而且还要考虑化合物与洗脱剂间的相互作用，如形成分子间氢键、洗脱剂对化合物的溶解度等。

再选用洗脱剂时，应从低极性溶剂开始，然后逐步增加洗脱剂的极性，使吸附在吸附剂上的成分逐个被洗脱下来，从而达到分离的目的。

如果样品极性小，可选用石油醚或（环）己烷作为起始溶剂，如果样品极性较大则可选用氯仿或苯或乙酸乙酯等作为起始溶剂，待起始溶剂中不再有成分被洗脱下来时，再加大洗脱剂的极性，而且极性要逐渐加大。

通常在进行柱色谱之前，需要通过薄层色谱的方法寻找柱色谱的洗脱剂和用于馏份检查时的薄层色谱条件。

值得注意的是薄层色谱的条件并不能直接照搬到柱色谱中去，薄层色谱只能提供最初的起始洗脱剂和更换的洗脱剂。

通常的做法是先用石油醚、环己烷、苯、氯仿、乙酸乙酯等单纯的溶剂进行展开，如果最前沿斑点的Rf值在0.2－0.3左右，则该溶剂可以作为最初的起始溶剂；

选用好最初的起始溶剂后，然后用所选用的溶剂与其它溶剂进行配对（包括溶剂的种类和比例均可多选一些），通过观察比较薄层色谱结果，根据分离效果选取最佳配对溶剂，从而决定加大洗脱剂极性的最佳溶剂；

如果还需要选用第三种更换溶剂，则可通过双向薄层的方法进行。

（七）．硅胶吸附色谱的操作实例

蟾蜍毒具有强心作用，因其甾体骨架中含有不饱和内酯环和叔醇羟基，故在氧化铝作用下很易发生变化。

如将若斯蟾蜍苷元（resibufogenin）、华蟾蜍精（cinobufagin）、蟾蜍灵（bufalin）溶于氯仿－苯或环己烷－丙酮溶液中，加入中性氧化铝吸附，经1－3天即可发生化学变化（见图2-2）。

但如使用硅胶作吸附剂分离就可获得良好的结果。

蟾酥用氯仿提取，取氯仿提取物10g，溶于少量氯仿丙酮混合液中，加入硅胶30g，拌匀，除去溶剂，干燥后用硅胶柱色谱分离。

硅胶的pH为5.3，粒度为100－200目，色谱柱的内径为4.5厘米，柱长为60厘米，洗脱剂为不同浓度的环己烷－丙酮混合液以及甲醇溶液，每个馏分的体积为350ml，回收溶剂后，洗脱物用薄层色谱检查，相同者合并，分离结果见表2-2.

表2-2蟾酥氯仿提取物硅胶柱色谱分离结果

流份洗脱剂得量薄层色谱结果

1环己烷:

丙酮（5:

1）0.373普通甾体

2-4环己烷:

1）0.100未鉴定成分1

5-10环己烷:

1）2.735若斯蟾蜍苷元

11-13环己烷:

1）0.453华蟾蜍精

14-15环己烷:

1）2.636华蟾蜍精，蟾蜍灵

16-20环己烷:

1）0.793蟾蜍灵

21-25环己烷:

1）0.005未鉴定成分4

26-30环己烷:

1）0.334华蟾蜍它灵

31-32环己烷:

1）0.307华蟾蜍它灵，蟾蜍它灵，未鉴定成分6

33-35环己烷:

1）0.296蟾蜍它灵

36-42环己烷:

1）0.268远华蟾蜍精

43-46环己烷:

1）0.162远华蟾蜍精，日本蟾蜍它灵，去乙酰蟾蜍它灵

47-48环己烷:

1）0.084去乙酰华蟾蜍精，日本蟾蜍它灵

49-54环己烷:

丙酮（3:

1）0.477日本蟾蜍它灵

55-57丙酮0.388日本蟾蜍它灵，嚏根草苷元

58-63甲醇0.899去乙酰华蟾蜍它灵，未鉴定成分12

总量9.707

回收率97.07%

R1R2R3嚏根草苷元（hellebrigenin）

蟾蜍它灵（bufotlin）HHOCOCH3

去乙酰蟾蜍它灵HHOH

蟾蜍灵（bufalin）HHH

远华蟾蜍精（telocinobufagin）OHHH

日本蟾蜍它灵（gamabufotalin）HOHH

）.5-1.0

R1R2

华蟾蜍它灵（cinobuftalin）OHOCOCH3

去乙酰华蟾蜍它灵OHOH

华蟾蜍精（cinobufagin）HOCOCH3

去乙酰华蟾蜍精HOH

若斯蟾蜍苷元（resibufogenin）HH

三．硅胶分配色谱

（一）．分配色谱原理

一种物质在两种互不相溶的溶剂中振摇，当达到平衡时，在同一温度下，该物质在两相溶剂中浓度的比值是恒定的，这个比值就称为该物质在这两种溶剂中的分配系数。

在天然药物提取分离工作中常用的溶剂萃取，就是利用天然药物中化学成分在互不相容的两相溶剂中的分配系数不同从而使其达到分离的。

如果需要分离的物质在两相溶剂中的分配系数相差很小，则一般用液－液萃取的方法是无法使其分离的，必须使其在两相溶剂中不断的反复分配，才能达到分离的目的，而分配色谱就能起到使其在两相溶剂中不断的进行反复分配提取的效用。

分配色谱法是用一种多孔性物质作为支持剂，将极性溶剂在色谱过程中始终固定在支持剂上，因它在色谱过程中始终是不移动的，故称之为固定相。

用另一种极性较小的溶剂来洗脱，因它在色谱过程中始终是移动的，故称为移动相。

由于移动相连续的加入，混合物中各成分一次又一次的在固定相与移动相之间按其分配系数进行无数次的分配，实际上就是移动相把成分从固定相中连续不断的提取出来并向前移动。

结果是在移动相中分配量大的成分移动速度快，走在前头；

在移动相中分配量小的成分移动速度慢，走在后头，从而使混合物中各成分达到彼此分离的目的。

将支持剂装在柱中的称为柱分配色谱，以滤纸作为支持剂的称为纸上分配色谱。

柱分配色谱所用的支持剂有硅胶、硅藻土、纤维素等。

硅胶由于规格不同，往往使分离结果不易重现。

硅藻土（商品名kiesilguhr,celite）由于所含的氧化硅质地较致密，几乎不发生吸附作用。

用纤维素作为支持剂进行分配色谱，实际上相当于纸色谱的扩大。

使用分配色谱的分离工作难易主要决定于混合物中各成分的分配系数的差异，如果分配系数相差较大，只要用较小的柱和较少的硅胶（支持剂）就能获得满意的分离。

如果分配系数相差较小，则分离同样重量的样品往往需要用较大的柱和较多的硅胶才能分开。

通常在溶剂萃取中，所用的两相溶剂比大致为1:

1，而在分配色谱中移动相的体积常常大于固定相5－10倍，在某些情况下甚至更大，即相当于以5－10倍甚至更大体积的有机溶剂向水溶液萃取，而分配系数的含义为溶质在两相溶剂中的浓度比，若体积增大，实际抽提出的量也大。

因此在分配色谱中选择固定相和移动相时，要考虑样品在两相溶剂中的分配比（样品在移动相中的浓度／样品在固定相中的浓度），通常其分配系数选择在0.1-0.2为宜。

分配系数较大时，则很快会从柱上被洗脱下来，分离效果较差。

如果分配系数过大则可采用反相分配色谱的方法进行分离，即以极性较小的溶剂作固定相，极性较大的溶剂作移动相。

原则上各类化合物均可用分配色谱的方法进行分离，但在实际工作应用中由于反相分配色谱是用得较少，主要是用于一些水溶性较大的化合物的分离如皂苷类、糖类、氨基酸类、极性较大的强心苷类、有机酸类、酚性化合物等。

（二）．分配色谱的一般操作

分配色谱的基本操作与吸附色谱大体相同，但也有它的特殊性，在使用时要引起注意，否则会直接影响它的分离效果。

1．装柱装柱前要先将支持剂与一定量的固定相搅拌混合均匀，然后将混有固定相的支持剂倒入盛有移动相溶剂的柱中，按一般湿法装柱操作方法进行操作。

通常支持剂和固定相溶剂的用量比为1:

0.5-1.0，即1克支持剂加0.5-1克固定相溶剂。

因分配色谱是使用不相互溶的两种溶剂，所以必须预先使两相溶剂相互饱和，即将两相溶剂放在一起振摇，待分层后再分别取出使用，至少移动相应先用固定相饱和后再使用。

否则，在色谱进行过程中当通过大量移动相溶剂时，就会把支持剂中的固定相溶剂溶解出来，最后只剩下了支持剂，也就不成为分配色谱了，并有可能导致整个分离的失败。

色谱柱固定相支持剂段直径与长度的比为通常为1:

10－20，，对分配系数比较接近的成分的分离，往往可加大到1:

40以上。

一般一米长的色谱柱的分离效果能相当于数百支逆流分溶管或数百个分液漏斗的萃取效果。

支持剂的用量通常较吸附色谱大，一般样品与支持剂的用量之比为1:

100－1000。

其具体用量主要取决于分离工作的难易，对分配系数比较接近的成分的分离甚至可采用1:

10000。

物质的分配系数往往会因温度的变化而改变，因此对要求较高的实验，色谱管最好有隔层套管，以便通水保持恒定的温度。

2．样品的加入样品上柱有三种方法：

如样品能溶于移动相溶剂，可用少量移动相溶剂溶解，加于柱顶再行展开；

如样品难溶于移动相而易溶于固定相时，则可用少量固定相溶剂溶解，再用支持剂（硅胶）吸着，装于柱顶再行展开；

如果样品在两相溶剂中的溶解度均不大，则可另选其他有机溶剂溶解后，加干燥支持剂拌匀，待溶剂挥发除尽后，加0.5－1.0倍量固定相溶剂拌匀，再装于柱顶。

3．洗脱加样完毕后，用移动相溶剂进行洗脱，分别收集各馏分，回收溶剂，用薄层色谱等方法检查，相同者合并。

所用的移动相溶剂常为固定相溶剂的5－10倍，即相当于用5－10倍体积的有机溶剂向水溶液反复提取（如果以水为固定相）。

在分配色谱进行过程中，要尽量使溶质在两相溶剂之间达到平衡，故移动相溶剂的流速应慢些。

通常要根据色谱柱的横断面和成分的分离难易程度来调整流速，柱直径及高度与流速的关系大体为：

2.6cm×

50cm，0.07ml/min；

4.5cm×

65cm，0.3ml/min；

5.5cm×

90cm，0.6ml/min；

6.5cm×

115cm，1.2ml/min。

4．溶剂系统的选择主要根据有效成分和杂质的溶解度来选择适当的溶剂系统，也可借助硅胶分配薄层色谱或纸层色谱的结果来摸索分离条件，或者查阅前人分离同类型化合物时的资料作为参考。

一般来讲，生物碱类或酸性物质可用缓冲溶液作固定相。

下列溶剂系统可供作硅胶分配色谱时参考（见表2-3）。

近年来，在使用硅胶柱色谱分离皂苷等极性较大的化合物时,常以含水的溶剂如氯仿－甲醇－水、二氯甲烷－甲醇－水等作为洗脱剂，由于在洗脱过程中硅胶会逐渐吸附洗脱剂中的水，使硅胶中的水分逐渐增大，故可以认为该类色谱开始时是脱活硅胶的吸附色谱，但随着硅胶中水的增多即固定相的增加，就逐渐变为硅胶分配色谱了。

表2-3硅胶分配色谱常用的固定相和移动相

分离的物质固定相移动相

水溶性生物碱水或缓冲溶液丁醇,乙酸乙酯

苷类水氯仿,乙酸乙酯,含0.5％甲醇的乙酸乙酯

酚性化合物水环己烷

有机酸0.05N或0.5N硫酸环己烷:

氯仿（或石油醚、苯、乙醚）3:

1

磷酸缓冲溶液氯仿:

乙醚1:

1

（三）．分配色谱的操作实例

1．狄戈辛（digoxin）的分离

洋地黄毒苷（digitoxin）HH

羟基洋地黄毒苷（gitoxin）HOH

狄戈辛（digoxin）OHH

取适量80－100目的硅胶（为分离样品量的100倍），加相当于硅胶2／3量的预先用乙酸乙酯饱和过的水，拌匀，再以预先用水饱和过的乙酸乙酯浸泡，调成稀糊状，湿法装柱，柱直径与长度之比为1:

20。

取毛地黄次生苷总苷和相当于总苷量的1－2倍量的硅胶，研匀后装于柱顶，用与水饱和的含有0.5％甲醇的乙酸乙酯洗脱，分部收集，减压回收溶剂，用薄层色谱检查（硅胶G薄层色谱条件，展开剂：

二氯乙烷－甲醇－甲酰胺80:

19:

1，显色剂：

三氯醋酸），相同者合并，用甲醇结晶，分别得到洋地黄毒苷、羟基洋地黄毒苷和狄戈辛（亦称异羟基洋地黄毒苷）等三个化合物。

2．羊角拗苷（divaricoside）的分离

取硅藻土250g，加入125ml预先用苯饱和过的水，拌匀，再以预先用水饱和过的苯浸泡，调成稀糊状，湿法装柱，柱直径与长度之比为1:

取羊角拗种子经酶解后的提取物4g，溶于少量乙醇中，加硅藻土10g拌匀，挥发除尽乙醇后，加5ml预先用苯饱和过的水，研匀后装于柱顶，依次用与水饱和的不同比例的苯－氯仿混合溶液洗脱，分部收集，每份30ml，减压回收溶剂，用薄层色谱检查，各流分的主要成分见表2-4

表2-4羊角拗种子提取物硅藻土分配柱色谱分离结果

流份移动相溶剂主要成分

14-19苯混合物

20-49苯混合物（内含羊角拗苷）

50-70苯不纯的羊