微生物分类鉴定.docx
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微生物分类鉴定
第三节微生物的分类鉴定方法
一、微生物鉴定的依据
获得纯化的微生物分离菌株后，首先判定是原核微生物还是真核微生物，这实际上在分离过程中所使用的方法和选择性培养基已经决定了分离菌株的大类的归属，从平板菌落的特征和液体培养的性状都可加以判定。
然后，如是原核微生物，便可根据表14-3所示的经典分类鉴定指标进行鉴定，如条件允许，可做碳源利用的BIOLOG-GN分析和16SrDNA序列分析。
多项结果结合起来确定分离菌株的属和种。
表14-3微生物经典分类鉴定方法的指标依据
经
典
分
类
法
个体：
细胞形态、大小、排列方式，染色反应，有无运动，各种特殊构造特征等
形态特征：
菌落形态，在固体、半固体或液体培养基中的生长状态等
营养要求：
碳源、氮源、矿质元素、生长因子等
生理生化特征：
代谢产物种类、产量、显色反应等
酶：
产酶种类和反应特征等
生态学特性：
生长温度，对氧的需要，酸碱度要求，宿主种类，生态分布等
血清学反应
噬菌体的敏感性
其他
二、微生物鉴定的技术与方法
根据目前微生物分类学中使用的技术和方法，可把它们分成四个不同的水平：
①细胞形态和行为水平，②细胞组分水平，③蛋白质水平，④基因组水平；
在微生物分类学发展的早期，主要的分类鉴定指标是以在细胞形态和习性为主，可称为经典的分类鉴定法。
其他三种实验技术主要是60年代以后采用的，称为化学分类和遗传学分类法，这些方法再加上数值分类鉴定法，可称为现代的分类鉴定方法。
（一）、经典分类鉴定法
经典分类法是一百多年来进行微生物分类的传统方法。
其特点是人为地选择几种形态生理生化特征进行分类，并在分类中将表型特征分为主、次。
一般在科以上分类单位以形态特征、科以下分类单位以形态结合生理生化特征加以区分。
最后，采用双歧法整理实验结果，排列一个个的分类单元，形成双歧检索表（图14-4）。
A.能在60oC以上生长
B.细胞大，宽度~1.8mm………………………………………1.热微菌属（Thermomicrobium）
BB.细胞小，宽度~0.8mm
C.能以葡萄糖为碳源生长
D.能在生长……………………………………………2.热酸菌属（Acidothermus）
DD.不能在生长…………………………………………………3.栖热菌属（Thermus）
CC.不能以葡萄糖为唯一碳源………………………4.栖热嗜油菌属（栖热嗜狮菌属Thermoleophilum）
AA.不能在60oC以上生长
图14-4双歧法检索表例样
应用BIOLOG-GN仪检测分离菌株对众多碳源的利用情况判断分离菌株的分类地位，近年来也时有应用。
在BIOLOG-GN仪上有96个小孔，其中95孔内分装有95种不同碳源的缓冲液，1孔为无碳源的缓冲液对照，各孔接入适宜菌浓度和液量的分离菌株培养物，定温培养，每日定时读取BIOLOG-GN仪计算机上各碳源利用情况，一般为时1周，BIOLOG-GN仪可显示出该鉴定菌株的最可能归属。
（二）、数值分类法
又称阿德逊氏分类法（）。
它的特点是根据较多的特征进行分类，一般为50～60个，多者可达100个以上，在分类上，每一个特性的地位都是均等重要。
通常是以形态、生理生化特征，对环境的反应和忍受性以及生态特性为依据。
最后，将所测菌株两两进行比较，并借用电子计算机计算出菌株间的总相似值，列出相似值矩阵（图14-5）。
为便于观察，应将矩阵重新安排，使相似度高的菌株列在一起，然后将矩阵图转换成树状谱（dendrogram）（图14-6），再结合主观上的判断（如划分类似程度大于85％者为同种，大于65％者为同属等），排列出—个个分类群。
图14-5显示6个细菌菌株的遗传相似矩阵图
图14-6根据相似矩阵图转换的相似关系树状谱
数值分类法的优越性在于它是以分析大量分类特征为基础，对于类群的划分比较客观和稳定；而且促进对细菌类群的全面考查和观察，为细菌的分类鉴定积累大量资料。
但在使用数值分类法对细菌菌株分群归类定种或定属时，还应做有关菌株的DNA碱基的G+Cmol%和DNA杂交，以进一步加以确证。
（三）、化学分类法
微生物分类中，根据微生物细胞的特征性化学组分对微生物进行分类的方法称化学分类法（chemotaxonomy）。
在近二十多年中，采用化学和物理技术采研究细菌细胞的化学组成，已获得很有价值的分类和鉴定资料，各种化学组分在原核微生物分类中的意义见表14-4。
表14-4细菌的化学组分分析及其在分类水平上的应用
细胞成份
分析内容
在分类水平上的作用
细胞壁
肽聚糖结构
种和属
多糖
胞壁酸
膜
脂肪酸
种和属
极性类脂
霉菌酸
类异戊二烯苯醌
蛋白质
氨基酸序列分析
属和属以上单位
血清学比较
电泳图
酶谱
代谢产物
脂肪酸
种和属
全细胞成分分析
热解—气液色谱分析
种和亚种
热解—质谱分析
随着分子生物学的发展，细胞化学组分分析用于微生物分类日趋显示出重要性。
细胞壁的氨基酸种类和数量现己被接受为细菌属的水平的重要分类学标准。
在放线菌分类中，细胞壁成分和细胞特征性糖的分析作为分属的依据，已被广泛应用。
脂质是区别细菌还是古菌的标准之一，细菌具有酰基脂（脂键），而古菌具有醚键脂，因此醚键脂的存在可用以区分古菌。
霉菌酸的分析测定己成为诺卡氏菌形放线菌分类鉴定中的常规方法之一。
鞘氨醇单胞菌和鞘氨醇杆菌等细胞膜都含有鞘氨醇，因此鞘氨醇的有无可作为此类细菌的一个重要标志。
此外某些细菌原生质膜中的异戊间二烯醌，细胞色素，以及红外光谱等分析对于细菌、放线菌中某些科、属、种的鉴定也都十分有价值。
（四）、遗传学分类法
分子遗传学分类法是以微生物的遗传型（基因型）特征为依据，判断微生物问的亲缘关系，排列出一个个的分类群。
目前较常使用的方法有：
1、DNA中G+Cmol%分析
每一个微生物种的DNA中GCmol%的数值是恒定的，不会随着环境条件、培养条件等的变化而变化，而且在同一个属不同种之间，DNA中GCmol%的数值不会差异太大，可以某个数值为中心成簇分布，显示同属微生物种的GCmol%范围。
DNA中GCmol%分析主要用于区分细菌的属和种，因为细菌DNA中GC含量的变化范围一般在25％～75％；而放线菌DNA中的GC比例范围非常窄（37％～51%）。
一般认为任何两种微生物在GC含量上的差别超过了10％，这两种微生物就肯定不是同一个种。
因此可利用G+Cmol％来鉴别各种微生物种属间的亲缘关系及其远近程度。
值得注意的是，亲缘关系相近的菌，其G+Cmol％含量相同或者近似，但G+Cmol％相同或近似的细菌，其亲缘关系并不一定相似，这是因为这一数据还不能反映出碱基对的排列序列，而且如放线菌的DNA的GCmol%在37～51之间，企图在这么小的范围内区分放线菌的几十个属显然是不现实的。
要比较两种细菌的DNA碱基对排列序列是否相同，以及相同的程度如何，就需做核酸杂交试验。
2、DNA-DNA杂交
DNA杂交法的基本原理是用DNA解链的可逆性和碱基配对的专一性，将不同来源的DNA在体外加热解链，并在合适的条件下，使互补的碱基重新配对结合成双链DNA，然后根据能生成双链的情况，检测杂合百分数。
如果两条单链DNA的碱基顺序全部相同，则它们能生成完整的双链，即杂合率为100%。
如果两条单链DNA的碱基序列只有部分相同，则它们能生成的“双链”仅含有局部单链，其杂合率小于100%。
由此；杂合率越高，表示两个DNA之间碱基序列的相似性越高，它们之间的亲缘关系也就越近。
如两株大肠埃希氏菌的DNA杂合率可高达100％，而大肠埃希氏菌与沙门氏菌的DNA杂合率较低，约有70％。
G+Cmol％的测定和DNA杂交实验为细菌种和属的分类研究开辟了新的途径，解决了以表观特征为依据所无法解决的一些疑难问题，但对于许多属以上分类单元间的亲缘关系及细菌的进化问题仍不能解决。
3、DNA—rRNA杂交
目前研究RNA碱基序列的方法有两种。
一是DNA与rRNA杂交，二是16SrRNA寡核苷酸的序列分析。
DNA与rRNA杂交的基本原理、实验方法同DNA杂交一样，不同的是①是DNA杂交中同位素标记的部分是DNA，而DNA与rRNA杂交中同位素标记的部分是rRNA。
②DNA杂交结果用同源性百分数表示，而DNA与rRNA杂交结果用Tm（e）和RNA结合数表示。
Tm（e）值是DNA与rRNA杂交物解链一半时所需要的温度。
RNA结合数是100mgDNA所结合的rRNA的mg数。
根据这个参数可以作出RNA相似性图。
在rRNA相似性图上，关系较近的菌就集中到一起。
关系较远的菌在图上占据不同的位置。
用rRNA同性试验和16SrRNA寡核苷酸编目的相似性比较rRNA顺反子的实验数据可得到属以上细菌分类单元的较一致的系统发育概念，并导致了古细菌的建立。
4、16SrRNA（16SrDNA）寡核苷酸的序列分析
首先，16SrRNA普遍存在于原核生物（真核生物中其同源分子是18SrRNA）中。
rRNA参与生物蛋白质的合成过程，其功能是任何生物都必不可少的，而且在生物进化的漫长历程中保持不变，可看作为生物演变的时间钟。
其次，在16SrRNA分子中，既含有高度保守的序列区域，又有中度保守和高度变化的序列区域，因而它适用于进化距离不同的各类生物亲缘关系的研究。
第三，16SrRNA的相对分子量大小适中，约1540个核苷酸，便于序列分析。
因此，它可以作为测量各类生物进化和亲缘关系的良好工具。
分离菌株16SrRNA基因的分离较为简单。
从平板中直接挑取一环分离菌株细胞,加入100μL无菌重蒸H2O中,旋涡混匀后,沸水浴2min,12000rmin-1离心5min,上清液中即含16SrRNA基因，可直接用于PCR扩增。
分离菌株16SrRNA基因的PCR扩增和序列测定的一般步骤为：
16SrRNA基因的PCR引物：
5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'。
扩增反应体积50mL，反应条件为95℃预变性5min，94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸2min，共进行29个循环，PCR反应在PTC-200型热循环仪上进行。
取5mL反应液在10gL-1的琼脂糖凝胶上进行电泳检测。
PCR产物测序可由专门技术公司完成。
测序得到分离菌株16SrDNA部分序列，此序列一般以*.形式保存，可以用写字板或Editsequence软件打开，将所得序列通过Blast程序与GenBank中核酸数据进行比对分析（），具体步骤如下：
点击网站中NucleotideBLAST下Nucleotide-nucleotideBLAST[blastn]选项，将测序所得序列粘贴在“search”网页空白处，或输入测序结果所在文件夹目录，点击核酸比对选项，即“blast”，然后点击“format”，计算机自动开始搜索核苷酸数据库中序列并进行序列比较，根据同源性高低列出相近序列及其所属种或属，以及菌株相关信息，从而初步判断16SrDNA鉴定结果。
遗传距离矩阵与系统发育树构建，可采用DNAStar软件包中的MegAlign程序计算样本间的遗传距离。
由GenBank中得到相关菌株的序列，与本研究分离菌株所测得序列一起输入程序进行DNA同源序列排列，并经人工仔细核查。
在此基础上，序列输入软件包，以简约法构建系统发育树。
使用Kimura2-parameter法，系统树各分枝的置信度经重抽样法（Bootstrap）500次重复检测，DNA序列变异中的转换和颠换赋于相同的加权值。
第一章 微生物检验常规鉴定技术
课堂教学计划（1学时）
名称
第一章微生物常规鉴定技术
目的要求
复习微生物检验基本知识，并重点掌握微生物常规鉴定技术；如形态结构和培养特性观察以及微生物检验中常用的生化反应。
重点难点
微生物常规鉴定技术
教学内容及教学组织
教学方法、手段及时间安排
第一章微生物常规鉴定技术
一、接种
二、分离纯化和培养技术
三、培养
二
一、形态结构和培养特性观察
1、微生物的形态结构观察主要是通过染色
2、细菌细胞在固体培养基表面形成的细胞群体叫菌落
二、生理生化试验
微生物检验中常用的生化反应
通过讲授和演示等方式进行；并采取举例方式进行教学，使其理论与实践相结合，便于理解记忆。
第一章微生物检验基本知识
包括显微镜、染色技术、培养基制备技术、接种、分离纯化和培养技术等。
接种、分离纯化和培养技术
一、接种
将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基上或活的生物体内的过程叫做接种。
１、接种工具和方法
接种和分离工具
1．接种针2.接种环3.接种钩.玻璃涂棒6.接种圈7.接种锄8.小解剖刀
常用的接种方法有以下几种：
１）划线接种这是最常用的接种方法。
即在固体培养基表面作来回直线形的移动，就可达到接种的作用。
常用的接种工具有接种环，接种针等。
在斜面接种和平板划线中就常用此法。
２）三点接种在研究霉菌形态时常用此法。
此法即把少量的微生物接种在平板表面上，成等边三角形的三点，让它各自独立形成菌落后，来观察、研究它们的形态。
除三点外，也有一点或多点进行接种的。
３）穿刺接种在保藏厌氧菌种或研究微生物的动力时常采用此法。
做穿刺接种时，用的接种工具是接种针。
用的培养基一般是半固体培养基。
它的做法是：
用接种针蘸取少量的菌种，沿半固体培养基中心向管底作直线穿刺，如某细菌具有鞭毛而能运动，则在穿刺线周围能够生长。
４）浇混接种该法是将待接的微生物先放入培养皿中，然后再倒入冷却至45°C左右的固体培养基，迅速轻轻摇匀，这样菌液就达到稀释的目的。
待平板凝固之后，置合适温度下培养，就可长出单个的微生物菌落。
５）涂布接种与浇混接种略有不同，就是先倒好平板，让其凝固，然后再将菌液倒入平板上面，迅速用涂布棒在表面作来回左右的涂布，让菌液均匀分布，就可长出单个的微生物的菌落。
６）液体接种从固体培养基中将菌洗下，倒入液体培养基中，或者从液体培养物中，用移液管将菌液接至液体培养基中，或从液体培养物中将菌液移至固体培养基中，都可称为液体接种。
７）注射接种该法是用注射的方法将待接的微生物转接至活的生物体内，如人或其它动物中，常见的疫苗预防接种，就是用注射接种，接入人体，来预防某些疾病。
８）活体接种活体接种是专门用于培养病毒或其它病原微生物的一种方法，因为病毒必须接种于活的生物体内才能生长繁殖。
所用的活体可以是整个动物；也可以是某个离体活组织，例如猴肾等；也可以是发育的鸡胚。
接种的方式是注射，也可以是拌料喂养。
２、无菌操作
培养基经高压灭菌后，用经过灭菌的工具（如接种针和吸管等）在无菌条件下接种含菌材料（如样品、菌苔或菌悬液等）于培养基上，这个过程叫做无菌接种操作。
在实验室检验中的各种接种必须是无菌操作。
图5－４ 斜面接种时的无菌操作
（1）接种灭菌
（2）开启棉塞（3）管口灭菌（4）挑起菌苔（5）接种（6）塞好棉塞
二、分离纯化
含有一种以上的微生物培养物称为混和培养物（Mixedculture）。
如果在一个菌落中所有细胞均来自于一个亲代细胞，那么这个菌落称为纯培养（Pureculture）。
在进行菌种鉴定时，所用的微生物一般均要求为纯的培养物。
得到纯培养的过程称为分离纯化，方法有许多种。
１、倾注平板法
首先把微生物悬液通过一系列稀释，取一定量的稀释液与熔化好的保持在40-50°左右的营养琼脂培养基充分混合，然后把这混合液倾注到无菌的培养皿中，待凝固之后，把这平板倒置在恒箱中培养。
单一细胞经过多次增殖后形成一个菌落，取单个菌落制成悬液，重复上述步骤数次，便可得到纯培养物。
（图5－５，a）
图5－５ 倾注平板法（a）涂布平板法（b）图解
1.菌悬液2.熔化的培养基3.培养物4.无菌水
２、涂布平板法
首先把微生物悬液通过适当的稀释，取一定量的稀释液放在无菌的已经凝固的营养琼脂平板上，然后用无菌的玻璃刮刀把稀释液均匀地涂布在培养基表面上，经恒温培养便可以得到单个菌落。
（图5－５，b）
３、平板划线法
最简单的分离微生物的方法是平板划线法。
用无菌的接种环取培养物少许在平板上进行划线。
划线的方法很多，常见的比较容易出现单个菌落的划线方法有斜线法、曲线法、方格法、放射法、四格法等。
（图5－６）当接种环在培养基表面上往后移动时，接种环上的菌液逐渐稀释，最后在所划的线上分散着单个细胞，经培养，每一个细胞长成一个菌落。
（图5－７）
４、富集培养法
富集培养法的方法和原理非常简单。
我们可以创造一些条件只让所需的微生物生长，在这些条件下，所需要的微生物能有效地与其他微生物进行竞争，在生长能力方面远远超过其他微生物。
如果要分离一些专性寄生菌，就必须把样品接种到相应敏感宿主细胞群体中，使其大量生长。
通过多次重复移种便可以得到纯的寄生菌。
图5－６ 平板划线分离法
1.斜线法2.曲线法3.方格法4.放射法5.四格法
５、厌氧法
在实验室中，为了分离某些厌氧菌，可以利用装有原培养基的试管作为培养容器，把这支试管放在沸水0浴中加热数分钟，以便逐出培养基中的溶解氧。
然后快速冷却，并进行接种。
接种后，加入无菌的石蜡于培养基表面，使培养基与空气隔绝。
另一种方法是，在接种后，利用N2或CO2取代培养基中的气体，然后在火焰上把试管口密封。
有时为了更有效地分离某些厌氧菌，可以把所分离的样品接种于培养基上，然后再把培养皿放在完全密封的厌氧培养装置中。
三、培养
1、根据培养时是否需要氧气，可分为好氧培养和厌氧培养两大类。
好氧培养：
也称“好气培养”。
就是说这种微生物在培养时，需要有氧气加入，否则就不能生长良好。
在实验室中，斜面培养是通过棉花塞从外界获得无菌的空气。
三角烧瓶液体培养多数是通过摇床振荡，使外界的空气源源不断地进入瓶中。
厌氧培养：
也称“厌气培养”。
这类微生物在培养时，不需要氧气参加。
在厌氧微生物的培养过程中，最重要的一点就是要除去培养基中的氧气。
一般可采用下列几种方法：
a.降低培养基中的氧化还原电位：
常将还原剂如谷胱甘肽、硫基醋酸盐等，加入到培养基中，便可达到目的。
有的将一些动物的死的或活的组织如牛心、羊脑加入到培养基中，也可适合厌氧菌的生长。
b.化合去氧：
这也有很多方法，主要有：
用焦性没食子酸吸收氧气；用磷吸收氧气；用好氧菌与厌氧混合培养吸收氧气；用植物组织如发芽的种子吸收氧气；用产生氢气与氧化合的方法除氧。
c.隔绝阻氧：
深层液体培养；用石蜡油封存；半固体穿刺培养。
d.替代驱氧用二氧气碳驱代氧气；用氮气驱代氧气；用真空驱代氧气；用氢气驱代氧气；用混和气体驱代氧气。
２、根据培养基的物理状态，可分为固体培养和液体培养两大类。
固体培养：
液体培养：
第二章微生物常规鉴定技术
一、形态结构和培养特性观察
１、微生物的形态结构观察主要是通过染色，在显微镜下对其形状、大小、排列方式、细胞结构（包括细胞壁、细胞膜、细胞核、鞭毛、芽孢等）及染色特性进行观察，直观地了解细菌在形态结构上特性，根据不同微生物在形态结构上的不同达到区别、鉴定微生物的目的。
２、细菌细胞在固体培养基表面形成的细胞群体叫菌落（colony）。
不同微生物在某种培养基中生长繁殖，所形成的菌落特征有很大差异，而同一种的细菌在一定条件下，培养特征却有一定稳定性。
以此可以对不同微生物加以区别鉴定。
因此，微生物培养特性的观察也是微生物检验鉴别中的一项重要内容。
１）细菌的培养特征包括以下内容：
在固体培养基上，观察菌落大小、形态、颜色（色素是水溶性还是脂溶性）、光泽度、透明度、质地、隆起形状、边缘特征及迁移性等。
在液体培养中的表面生长情况（菌膜、环）混浊度及沉淀等。
半固体培养基穿刺接种观察运动、扩散情况。
（图３－８）
图３－８ 细菌的培养特征
1.点状2.圆形3.丝状4.不规则形5.假根状6.纺锤状7.扁平8.隆起9.凸起10.垫状11.脐状12.边缘整齐13.波状14.裂片状15.啮蚀状16.丝状17.卷发状18.丝线状19.刺毛状20.串珠状21.疏展状22.树根状23.假根状24.丝状25.串珠状26.乳头状27.绒毛状28.树根状29.量杯状30.萝卜状31.漏斗状32.囊状33.层状34.絮状35.环状36.蹼状37.膜状
２）霉菌酵母菌的培养特征：
大多数酵母菌没有丝状体，在固体培养基上形成的菌落和细菌的很相似，只是比细菌菌落大且厚。
液体培养也和细菌相似，有均匀生长、沉淀或在液面形成菌膜。
霉菌有分支的丝状体，菌丝粗长，在条件适宜的培养基里，菌丝无限伸长沿培养基表面蔓延。
霉菌的基内菌丝、气生菌丝和孢子丝都常带有不同颜色，因而菌落边缘和中心，正面和背面颜色常常不同，如青霉菌：
孢子青绿色，气生菌丝无色，基内菌丝褐色。
霉菌在固体培养表面形成絮状、绒毛状和蜘蛛网状菌落。
二、生理生化试验
微生物生化反应：
指用化学反应来测定微生物的代谢产物，生化反应常用来鉴别一些在形态和其它方面不易区别的微生物。
因此微生物生化反应是微生物分类鉴定中的重要依据之一。
微生物检验中常用的生化反应有：
１、糖酵解试验
不同微生物分解利用糖类的能力有很大差异，或能利用或不能利用，能利用者，或产气或不产气。
可用指示剂及发酵管检验。
试验方法：
以无菌操作，用接种针或环移取纯培养物少许，接种于发酵液体培养基管，若为半固体培养基，则用接种针作穿刺接种。
接种后，置36±1.0°C培养，每天观察结果，检视培养基颜色有无改变（产酸），小倒管中有无气泡，微小气泡亦为产气阳性，若为半固体培养基，则检视沿穿刺线和管壁及管底有无微小气泡，有时还可看出接种菌有无动力，若有动力、培养物可呈弥散生长。
本试验主要是检查细菌对各种糖、醇和糖苷等的发酵能力，从而进行各种细菌的鉴别，因而每次试验，常需同时接种多管。
一般常用的指示剂为酚红、溴甲酚紫，溴百里蓝和An-drade指示剂。
２、淀粉水解试验
某些细菌可以产生分解淀粉的酶，把淀粉水解为麦芽糖或葡萄糖。
淀粉水解后，遇碘不再变蓝色。
试验方法：
以18~24h的纯培养物，涂布接种于淀粉琼脂斜面或平板（一个平板可分区接种，试验数种培养物）或直接移种于淀粉肉汤中，于36±1°C培养24~48h，或于20°培养5天。
然后将碘试剂直接
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